सर्जिकल माउस मॉडल में ऑस्टियोआर्थराइटिस का मानकीकृत हिस्टोमॉर्फोमेट्रिक मूल्यांकन
Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल ऑस्टियोआर्थराइटिस के साथ रूपात्मक संयुक्त परिवर्तनों की मात्रा के लिए एक कठोर और प्रजनन विधि स्थापित करता है। इस प्रोटोकॉल का आवेदन रोग प्रगति की निगरानी और ऑस्टियोआर्थराइटिस में चिकित्सीय हस्तक्षेपों का मूल्यांकन करने में मूल्यवान हो सकता है।
Abstract
संयुक्त राज्य अमेरिका में सबसे प्रचलित संयुक्त विकारों में से एक, ऑस्टियोआर्थराइटिस (ओए) मुख्य रूप से कूल्हे और घुटने के जोड़ों में आर्टिकुलर उपास्थि के प्रगतिशील पतन की विशेषता है, जिसके परिणामस्वरूप रोगी गतिशीलता और जीवन की गुणवत्ता पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है। आज तक, ओए के लिए कोई मौजूदा उपचारात्मक उपचार नहीं हैं जो उपास्थि पतन को धीमा या बाधित करने में सक्षम हैं। वर्तमान में, ओए पैथोलॉजी को समझने और उपन्यास चिकित्सीय दृष्टिकोणों या एजेंटों की खोज करने के लिए चल रहे शोध का एक व्यापक शरीर है जो एओए को कुशलतापूर्वक धीमा, रोक सकता है या रिवर्स भी कर सकता है। इस प्रकार, संयुक्त उपास्थि, सिनोवियम और उप-पाठन की हड्डी में ओए-संबद्ध रोग परिवर्तनों का सही मूल्यांकन करने के लिए मात्रात्मक और प्रजनन योग्य दृष्टिकोण होना महत्वपूर्ण है। वर्तमान में, ओए गंभीरता और प्रगति मुख्य रूप से ऑस्टियोआर्थराइटिस रिसर्च सोसायटी इंटरनेशनल (OARSI) या Mankin स्कोरिंग सिस्टम का उपयोग कर मूल्यांकन कर रहे हैं । इन स्कोरिंग सिस्टम के महत्व के बावजूद, वे अर्धमात्रात्मक हैं और उपयोगकर्ता व्यक्तिपरकता से प्रभावित हो सकते हैं। इससे भी महत्वपूर्ण बात, वे सही सूक्ष्म, अभी तक महत्वपूर्ण, प्रारंभिक रोग राज्यों या प्रारंभिक उपचार चरणों के दौरान उपास्थि में परिवर्तन का सही मूल्यांकन करने में विफल । हम यहां जो प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, वह ओए में संयुक्त परिवर्तनों के मूल्यांकन के लिए एक मानकीकृत, कठोर और प्रजनन मात्रात्मक पद्धति स्थापित करने के लिए एक कंप्यूटरीकृत और अर्धस्वचालित हिस्टोमॉर्फेट्रिक सॉफ्टवेयर सिस्टम का उपयोग करता है। यह प्रोटोकॉल मौजूदा प्रणालियों के लिए एक शक्तिशाली इसके अतिरिक्त प्रस्तुत करता है और संयुक्त में रोग परिवर्तनों का अधिक कुशल पता लगाने की अनुमति देता है।
Introduction
संयुक्त राज्य अमेरिका में सबसे प्रचलित संयुक्त विकारों में से एक, ओए मुख्य रूप से कूल्हे और घुटने के जोड़ों में आर्टिकुलर उपास्थि के प्रगतिशील पतन की विशेषता है, जिसके परिणामस्वरूप रोगी गतिशीलता और जीवन की गुणवत्ता1,2,2,3पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है। आर्टिकुलर उपास्थि घर्षण को कम करने, आंदोलन को सुविधाजनक बनाने और संयुक्त संपीड़न4सहने के लिए डिज़ाइन किए गए डायरथ्रोडायल जोड़ों का विशेष संयोजी ऊतक है। आर्टिकुलर उपास्थि दो प्राथमिक घटकों से बना है: कॉन्ड्रोसाइट्स और एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स। कॉन्ड्रोसाइट्स विशेष, चयापचय रूप से सक्रिय कोशिकाएं हैं जो एक्स्ट्रासेलुलर मैट्रिक्स4के विकास, रखरखाव और मरम्मत में प्राथमिक भूमिका निभाती हैं। Chondrocyte हाइपरट्रॉफी (CH) ओए विकास के प्रमुख रोग संकेतों में से एक है। यह सेलुलर आकार में वृद्धि, प्रोटेओग्लिकन उत्पादन में कमी, और उपास्थि मैट्रिक्स-अपमानजनक एंजाइमों के उत्पादन में वृद्धि की विशेषता है जो अंततः उपास्थि पतन5,6,6,7का कारण बनते हैं। इसके अलावा, संयुक्त के उपचोनड्ल बोन और साइनोवियम में रोग परिवर्तन ओए विकास और प्रगति8,9,,10,11, 12,12में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । आज तक, कोई मौजूदा उपचारात्मक उपचार नहीं हैं जो उपास्थि पतन1,,2,,3,,13,14को रोकते हैं।14 इस प्रकार, व्यापक चल रहे शोध है जिसका उद्देश्य ओए पैथोलॉजी को समझना और उपन्यास चिकित्सीय दृष्टिकोणों की खोज करना है जो ओए को धीमा करने या रोकने में सक्षम हैं। तदनुसार, एक मात्रात्मक और प्रजनन योग्य दृष्टिकोण की बढ़ती आवश्यकता है जो संयुक्त के उपास्थि, सिनोवियम और सबकॉन्ड्रल हड्डी में ओए-संबद्ध रोग परिवर्तनों का सटीक मूल्यांकन करने में सक्षम बनाता है।
वर्तमान में, ओए गंभीरता और प्रगति मुख्य रूप से OARSI या Mankin स्कोरिंग सिस्टम15का उपयोग कर मूल्यांकन कर रहे हैं । हालांकि, ये स्कोरिंग सिस्टम केवल अर्धमात्रात्मक हैं और उपयोगकर्ता व्यक्तिपरकता से प्रभावित हो सकते हैं। इससे भी महत्वपूर्ण बात, वे रोग के दौरान संयुक्त रूप से या आनुवंशिक हेरफेर या चिकित्सीय हस्तक्षेप के जवाब में होने वाले सूक्ष्म परिवर्तनों का सही मूल्यांकन करने में विफल रहते हैं। साहित्य में छिटपुट रिपोर्टें हैं जिनमें उपास्थि, सिनोवेनियम या सबकॉन्ड्रल बोन16,17,18,19,20,21के हिस्टोमॉर्फेमेट्रिक विश्लेषणों का वर्णन किया गया है ।, हालांकि, इन सभी संयुक्त घटकों के कठोर और प्रजनन हिस्टोमॉर्फोमेट्रिक विश्लेषण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल अभी भी कमी है, जिससे क्षेत्र में एक अपूरित आवश्यकता पैदा हो रही है।
हिस्टोमॉर्फेमेट्रिक विश्लेषण का उपयोग करके ओए में रोग परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए, हमने एक सर्जिकल ओए माउस मॉडल का उपयोग किया जो ओए को मध्यस्थ मेनिस्कस (डीएमएम) के अस्थिरहोने के माध्यम से प्रेरित करता है। मूत्र ओए के स्थापित मॉडलों में से, डीएमएम को हमारे अध्ययन के लिए चुना गया था क्योंकि इसमें चोट का कम दर्दनाक तंत्र शामिल है22,23,,24,25,26। मेनिसकल-स्नायुचोट (एमएलआई) या पूर्वकाल क्रूसिएट स्नायु चोट (ACLI) सर्जरी की तुलना में, डीएमएम22,24,,25,,26मनुष्यों में ओए विकास के समान ओए की अधिक क्रमिक प्रगति को बढ़ावा देता है।, चूहों को डीएमएम सर्जरी के बारह सप्ताह बाद आर्टिकुलर उपास्थि, सबकॉन्ड्रल बोन और साइनोवियम में परिवर्तन का मूल्यांकन करने के लिए इच्छामृत्यु दी गई थी।
इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य ओए के साथ संयुक्त परिवर्तनों का मूल्यांकन करने के लिए एक मानकीकृत, कठोर और मात्रात्मक दृष्टिकोण स्थापित करना है।
Protocol
Representative Results
Discussion
हाल ही में ऑस्टियोआर्थराइटिस अनुसंधान ने संयुक्त के भीतर विभिन्न ऊतकों के बीच क्रॉसटॉक के बारे में हमारी समझ को बढ़ाया है और प्रत्येक ऊतक रोग दीक्षा या प्रगति8,9,10,</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम पेन स्टेट मिल्टन एस हर्शे मेडिकल सेंटर में तुलनात्मक चिकित्सा कर्मचारियों और आणविक और हिस्टोपैथोलॉजी कोर विभाग की सहायता को स्वीकार करना चाहते हैं। वित्तपोषण स्रोत: NIH NIAMS 1RO1AR071968-01A1 (F.K.), ANRF गठिया अनुसंधान अनुदान (F.K.) ।
Materials
| 10% Buffered Formalin Phosphate | Fisher Chemical | SF100-20 | For sample fixation following harvest |
| Acetic Acid, Glacial (Certified A.C.S.) | Fisher Chemical | A38S-212 | For Decalcification Buffer preparation and acetic acid solution preparation for staining |
| Cintiq 27QHD Creative Pen Display | Wacom | https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch | For histomorphometric analysis and imaging |
| Cintiq Ergo stand | Wacom | https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch | For histomorphometric analysis and imaging |
| Ethylenediaminetetraacetic acid, tetrasodium salt dihydrate, 99% | Acros Organics | AC446080010 | For Decalcification Buffer preparation |
| Fast Green stain | SIGMA Life Sciences | F7258 | For sample staining |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 | For sample section collection |
| HistoPrep Xylene | Fisherbrand | HC-700-1GAL | For sample deparrafinization and staining |
| Histosette II Tissue Cassettes – Combination Lid and Base | Fisher | 15-182-701A | For sample processing and embedding |
| HP Z440 Workstation | HP | Product number: Y5C77US#ABA | For histomorphometric analysis and imaging |
| Manual Rotary Microtome | Leica | RM 2235 | For sample sectioning |
| Marking pens | Leica | 3801880 | For sample labeling, cassettes and slides |
| OLYMPUS BX53 Microscope | OLYMPUS | https://www.olympus-lifescience.com/en/microscopes/upright/bx53f2/ | For histomorphometric analysis and imaging |
| OLYMPUS DP 73 Microscope Camera | OLYMPUS | https://www.olympus-lifescience.com/en/camera/color/dp73/ | For histomorphometric analysis and imaging (discontinued) |
| ORION STAR A211 pH meter | Thermo Scientific | STARA2110 | For Decalcification Buffer preparation |
| OsteoMeasure Software | OsteoMetrics | https://www.osteometrics.com/index.htm | For histomorphometric measurement and analysis |
| Perfusion Two Automated Pressure Perfusion system | Leica | Model # 39471005 | For mouse knee harvest |
| PRISM 7 Software | GraphPad | Institutional Access Account | Statistical Analysis |
| Safranin-O stain | SIGMA Life Sciences | S8884 | For sample staining |
| ThinkBoneStage – Rotating Microscope Stage | Think Bone Consulting Inc. – OsteoMetrics (supplier) | http://thinkboneconsulting.com/index_files/Slideholder.php | For histomorphometric analysis and imaging |
| Wacom Pro Pen Stylus | Wacom | https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch | For histomorphometric analysis and imaging |
| Weigerts Iron Hematoxylin A | Fisher | 5029713 | For hematoxylin staining |
| Weigerts Iron Hematoxylin B | Fisher | 5029714 | For hematoxylin staining |
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