Avaliação histomorfométrica padronizada da osteoartrite em um modelo de rato cirúrgico
Summary
O protocolo atual estabelece um método rigoroso e reprodutível para quantificação de alterações articulares morfológicas que acompanham a osteoartrite. A aplicação deste protocolo pode ser valiosa no monitoramento da progressão da doença e na avaliação de intervenções terapêuticas na osteoartrite.
Abstract
Uma das doenças articulares mais prevalentes nos Estados Unidos, a osteoartrite (OA) é caracterizada pela degeneração progressiva da cartilagem articular, principalmente nas articulações do quadril e do joelho, o que resulta em impactos significativos na mobilidade e qualidade de vida do paciente. Até o momento, não existem terapias curativas existentes para OA capazes de retardar ou inibir a degeneração da cartilagem. Atualmente, há um extenso corpo de pesquisas em andamento para entender a patologia da OA e descobrir novas abordagens terapêuticas ou agentes que podem reduzir eficientemente, parar ou até mesmo reverter o OA. Assim, é fundamental ter uma abordagem quantitativa e reprodutível para avaliar com precisão as alterações patológicas associadas à OA na cartilagem articular, no sinóvio e no osso subcondral. Atualmente, a gravidade e a progressão da OA são avaliadas principalmente usando os sistemas de pontuação Da Osteoarthritis Research Society International (OARSI) ou Mankin. Apesar da importância desses sistemas de pontuação, eles são semiquantitativos e podem ser influenciados pela subjetividade do usuário. Mais importante, não conseguem avaliar com precisão mudanças sutis, mas importantes, na cartilagem durante os estados precoces da doença ou fases de tratamento precoce. O protocolo que descrevemos aqui usa um sistema de software histomorfométrico computadorizado e semi-automatizado para estabelecer uma metodologia quantitativa padronizada, rigorosa e reprodutível para a avaliação de mudanças conjuntas na OA. Este protocolo apresenta uma poderosa adição aos sistemas existentes e permite uma detecção mais eficiente de alterações patológicas na articulação.
Introduction
Uma das doenças articulares mais prevalentes nos Estados Unidos, a OA é caracterizada pela degeneração progressiva da cartilagem articular, principalmente nas articulações do quadril e do joelho, o que resulta em impactos significativos na mobilidade do paciente e na qualidade de vida1,2,3. Cartilagem articular é o tecido conjuntivo especializado das articulações diartrodiais projetadas para minimizar o atrito, facilitar o movimento e suportar a compressão articular4. A cartilagem articular é composta por dois componentes primários: condrócitos e matriz extracelular. Os condrócitos são células especializadas e metabolicamente ativas que desempenham um papel primordial no desenvolvimento, manutenção e reparo da matriz extracelular4. A hipertrofia condrócito (CH) é um dos principais sinais patológicos do desenvolvimento da OA. Caracteriza-se pelo aumento do tamanho celular, diminuição da produção de proteoglicano e aumento da produção de enzimas degradantes da matriz de cartilagem que eventualmente levam à degeneração da cartilagem5,6,7. Além disso, alterações patológicas no osso subcondral e no sinóvio da articulação desempenham um papel importante no desenvolvimento e progressão da OA8,,9,10,11,12. Até o momento, não existem terapias curativas existentes que inibam a degeneração da cartilagem1,2,3,13,14. Assim, há extensas pesquisas em andamento que visam compreender a patologia da OA e descobrir novas abordagens terapêuticas que são capazes de retardar ou até mesmo parar o OA. Assim, há uma necessidade crescente de uma abordagem quantitativa e reprodutível que permita uma avaliação precisa das alterações patológicas associadas à OA na cartilagem, sinóvio e osso subcondral da articulação.
Atualmente, a gravidade e a progressão do OA são avaliadas principalmente usando os sistemas de pontuação OARSI ou Mankin15. No entanto, esses sistemas de pontuação são apenas semiquantitativos e podem ser influenciados pela subjetividade do usuário. Mais importante, eles não conseguem avaliar com precisão mudanças sutis que ocorrem na articulação durante a doença ou em resposta à manipulação genética ou a uma intervenção terapêutica. Há relatos esporádicos na literatura descrevendo análises histomorfométricas da cartilagem, sinóvio ou osso subcondral16,,17,,18,,19,,20,21. No entanto, ainda falta um protocolo detalhado para análise histomorfométrica rigorosa e reprodutível de todos esses componentes articulares, criando uma necessidade não atendida no campo.
Para estudar alterações patológicas na OA usando análise histomorfométrica, utilizou-se um modelo cirúrgico de rato oa para induzir OA através da desestabilização do menisco medial (DMM). Entre os modelos estabelecidos de Murine OA, a DMM foi selecionada para o nosso estudo por envolver um mecanismo menos traumático de lesão22,,23,24,25,26. Em comparação com as cirurgias de lesão meniscal-ligamento (MLI) ou lesão do ligamento cruzado anterior (ACLI), a DMM promove uma progressão mais gradual da OA, semelhante ao desenvolvimento de OA em humanos22,24,25,26. Os camundongos foram eutanizados doze semanas após a cirurgia de DMM para avaliar alterações na cartilagem articular, osso subcondral e sinóvio.
O objetivo deste protocolo é estabelecer uma abordagem padronizada, rigorosa e quantitativa para avaliar as mudanças conjuntas que acompanham a OA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pesquisas recentes de osteoartrite melhoraram nossa compreensão do crosstalk entre os diferentes tecidos dentro da articulação e o papel que cada tecido desempenha na iniciação ou progressão da doença8,9,10,35,36. Assim, tornou-se óbvio que a avaliação da OA não deve se limitar à análise da cartilagem, mas também deve incluir a análise do osso s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de reconhecer a assistência da equipe do Departamento de Medicina Comparada e do núcleo molecular e histopatológico do Penn State Milton S. Hershey Medical Center. Fontes de financiamento: NIH NIAMS 1RO1AR071968-01A1 (F.K.), ANRF Arthritis Research Grant (F.K.).
Materials
| 10% Buffered Formalin Phosphate | Fisher Chemical | SF100-20 | For sample fixation following harvest |
| Acetic Acid, Glacial (Certified A.C.S.) | Fisher Chemical | A38S-212 | For Decalcification Buffer preparation and acetic acid solution preparation for staining |
| Cintiq 27QHD Creative Pen Display | Wacom | https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch | For histomorphometric analysis and imaging |
| Cintiq Ergo stand | Wacom | https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch | For histomorphometric analysis and imaging |
| Ethylenediaminetetraacetic acid, tetrasodium salt dihydrate, 99% | Acros Organics | AC446080010 | For Decalcification Buffer preparation |
| Fast Green stain | SIGMA Life Sciences | F7258 | For sample staining |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 | For sample section collection |
| HistoPrep Xylene | Fisherbrand | HC-700-1GAL | For sample deparrafinization and staining |
| Histosette II Tissue Cassettes – Combination Lid and Base | Fisher | 15-182-701A | For sample processing and embedding |
| HP Z440 Workstation | HP | Product number: Y5C77US#ABA | For histomorphometric analysis and imaging |
| Manual Rotary Microtome | Leica | RM 2235 | For sample sectioning |
| Marking pens | Leica | 3801880 | For sample labeling, cassettes and slides |
| OLYMPUS BX53 Microscope | OLYMPUS | https://www.olympus-lifescience.com/en/microscopes/upright/bx53f2/ | For histomorphometric analysis and imaging |
| OLYMPUS DP 73 Microscope Camera | OLYMPUS | https://www.olympus-lifescience.com/en/camera/color/dp73/ | For histomorphometric analysis and imaging (discontinued) |
| ORION STAR A211 pH meter | Thermo Scientific | STARA2110 | For Decalcification Buffer preparation |
| OsteoMeasure Software | OsteoMetrics | https://www.osteometrics.com/index.htm | For histomorphometric measurement and analysis |
| Perfusion Two Automated Pressure Perfusion system | Leica | Model # 39471005 | For mouse knee harvest |
| PRISM 7 Software | GraphPad | Institutional Access Account | Statistical Analysis |
| Safranin-O stain | SIGMA Life Sciences | S8884 | For sample staining |
| ThinkBoneStage – Rotating Microscope Stage | Think Bone Consulting Inc. – OsteoMetrics (supplier) | http://thinkboneconsulting.com/index_files/Slideholder.php | For histomorphometric analysis and imaging |
| Wacom Pro Pen Stylus | Wacom | https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch | For histomorphometric analysis and imaging |
| Weigerts Iron Hematoxylin A | Fisher | 5029713 | For hematoxylin staining |
| Weigerts Iron Hematoxylin B | Fisher | 5029714 | For hematoxylin staining |
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