Evaluación histomorfométrica estandarizada de la osteoartritis en un modelo de ratón quirúrgico
Summary
El protocolo actual establece un método riguroso y reproducible para la cuantificación de los cambios morfológicos articulares que acompañan a la osteoartritis. La aplicación de este protocolo puede ser valiosa para monitorear la progresión de la enfermedad y evaluar las intervenciones terapéuticas en la osteoartritis.
Abstract
Uno de los trastornos articulares más frecuentes en los Estados Unidos, la osteoartritis (OA) se caracteriza por la degeneración progresiva del cartílago articular, principalmente en las articulaciones de la cadera y la rodilla, lo que resulta en impactos significativos en la movilidad del paciente y la calidad de vida. Hasta la fecha, no existen terapias curativas para OA capaz de ralentizar o inhibir la degeneración del cartílago. En la actualidad, hay un extenso cuerpo de investigación en curso para entender la patología de OA y descubrir nuevos enfoques terapéuticos o agentes que pueden ralentizar, detener o incluso revertir OA de manera eficiente. Por lo tanto, es crucial tener un enfoque cuantitativo y reproducible para evaluar con precisión los cambios patológicos asociados a la OA en el cartílago articular, el sinovium y el hueso subcondral. Actualmente, la gravedad y progresión de la OA se evalúan principalmente utilizando los sistemas de puntuación de Osteoarthritis Research Society International (OARSI) o Mankin. A pesar de la importancia de estos sistemas de puntuación, son semicuantitativos y pueden verse influenciados por la subjetividad del usuario. Lo que es más importante, no evalúan con precisión los cambios sutiles, pero importantes, en el cartílago durante los estados tempranos de la enfermedad o las fases de tratamiento temprano. El protocolo que describimos aquí utiliza un sistema de software histomorfométrico computarizado y semiautomatizado para establecer una metodología cuantitativa estandarizada, rigurosa y reproducible para la evaluación de cambios conjuntos en OA. Este protocolo presenta una poderosa adición a los sistemas existentes y permite una detección más eficiente de los cambios patológicos en la articulación.
Introduction
Uno de los trastornos articulares más frecuentes en los Estados Unidos, OA se caracteriza por la degeneración progresiva del cartílago articular, principalmente en las articulaciones de cadera y rodilla, lo que resulta en impactos significativos en la movilidad del paciente y la calidad de vida1,,2,3. El cartílago articular es el tejido conectivo especializado de las articulaciones diarthrodiales diseñadas para minimizar la fricción, facilitar el movimiento y soportar la compresión articular4. El cartílago articular se compone de dos componentes principales: condrocitos y matriz extracelular. Los condrocitos son células especializadas, metabólicamente activas que desempeñan un papel principal en el desarrollo, mantenimiento y reparación de la matriz extracelular4. La hipertrofia condrocitos (CH) es uno de los principales signos patológicos del desarrollo de la OA. Se caracteriza por un aumento del tamaño celular, disminución de la producción de proteoglicano, y aumento de la producción de enzimas degradantes de la matriz de cartílago que eventualmente conducen a la degeneración del cartílago5,6,7. Además, los cambios patológicos en el hueso subcondral y el sinovium de la articulación juegan un papel importante en el desarrollo y progresión de la OA8,9,10,11,12. Hasta la fecha, no existen terapias curativas que inhiban la degeneración del cartílago1,2,3,13,14. Por lo tanto, hay una amplia investigación en curso que tiene como objetivo entender la patología oA y descubrir nuevos enfoques terapéuticos que son capaces de ralentizar o incluso detener OA. En consecuencia, existe una creciente necesidad de un enfoque cuantitativo y reproducible que permita una evaluación precisa de los cambios patológicos asociados a la OA en el cartílago, el sinovium y el hueso subcondral de la articulación.
Actualmente, la gravedad y progresión de la OA se evalúan principalmente utilizando los sistemas de puntuación OARSI o Mankin15. Sin embargo, estos sistemas de puntuación son sólo semicuantitativos y pueden verse influenciados por la subjetividad del usuario. Lo que es más importante, no evalúan con precisión los cambios sutiles que ocurren en la articulación durante la enfermedad o en respuesta a la manipulación genética o una intervención terapéutica. Hay informes esporádicos en la literatura que describen análisis histomorfométricos del cartílago, sinovium, o hueso subcondral16,17,18,19,20,21. Sin embargo, todavía falta un protocolo detallado para un análisis histomorfométrico riguroso y reproducible de todos estos componentes conjuntos, creando una necesidad insatisfecha en el campo.
Para estudiar los cambios patológicos en OA utilizando análisis histomorfométricos, utilizamos un modelo de ratón OA quirúrgico para inducir OA a través de la desestabilización del menisco medial (DMM). Entre los modelos establecidos de OA murina, DMM fue seleccionada para nuestro estudio porque implica un mecanismo menos traumático de lesión22,,23,,24,,25,26. En comparación con las cirugías de lesión menisca-ligamentoligamenta (MLI) o lesión del ligamento cruzado anterior (ACLI), DMM promueve una progresión más gradual de la OA, similar al desarrollo de OA en humanos22,,24,,25,,26. Los ratones fueron eutanasiados doce semanas después de la cirugía de MMC para evaluar los cambios en el cartílago articular, el hueso subcondral y el sinovium.
El objetivo de este protocolo es establecer un enfoque estandarizado, riguroso y cuantitativo para evaluar los cambios conjuntos que acompañan a OA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Investigaciones recientes de osteoartritis han mejorado nuestra comprensión de la interferencia entre los diferentes tejidos dentro de la articulación y el papel que cada tejido desempeña en la iniciación de la enfermedad o progresión8,9,10,35,36. En consecuencia, se ha vuelto obvio que la evaluación de la OA no debe limitarse al análisis del cartílago…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría reconocer la asistencia del personal del Departamento de Medicina Comparada y del núcleo Molecular e Histopatología en Penn State Milton S. Hershey Medical Center. Fuentes de financiación: NIH NIAMS 1RO1AR071968-01A1 (F.K.), ANRF Arthritis Research Grant (F.K.).
Materials
| 10% Buffered Formalin Phosphate | Fisher Chemical | SF100-20 | For sample fixation following harvest |
| Acetic Acid, Glacial (Certified A.C.S.) | Fisher Chemical | A38S-212 | For Decalcification Buffer preparation and acetic acid solution preparation for staining |
| Cintiq 27QHD Creative Pen Display | Wacom | https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch | For histomorphometric analysis and imaging |
| Cintiq Ergo stand | Wacom | https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch | For histomorphometric analysis and imaging |
| Ethylenediaminetetraacetic acid, tetrasodium salt dihydrate, 99% | Acros Organics | AC446080010 | For Decalcification Buffer preparation |
| Fast Green stain | SIGMA Life Sciences | F7258 | For sample staining |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 | For sample section collection |
| HistoPrep Xylene | Fisherbrand | HC-700-1GAL | For sample deparrafinization and staining |
| Histosette II Tissue Cassettes – Combination Lid and Base | Fisher | 15-182-701A | For sample processing and embedding |
| HP Z440 Workstation | HP | Product number: Y5C77US#ABA | For histomorphometric analysis and imaging |
| Manual Rotary Microtome | Leica | RM 2235 | For sample sectioning |
| Marking pens | Leica | 3801880 | For sample labeling, cassettes and slides |
| OLYMPUS BX53 Microscope | OLYMPUS | https://www.olympus-lifescience.com/en/microscopes/upright/bx53f2/ | For histomorphometric analysis and imaging |
| OLYMPUS DP 73 Microscope Camera | OLYMPUS | https://www.olympus-lifescience.com/en/camera/color/dp73/ | For histomorphometric analysis and imaging (discontinued) |
| ORION STAR A211 pH meter | Thermo Scientific | STARA2110 | For Decalcification Buffer preparation |
| OsteoMeasure Software | OsteoMetrics | https://www.osteometrics.com/index.htm | For histomorphometric measurement and analysis |
| Perfusion Two Automated Pressure Perfusion system | Leica | Model # 39471005 | For mouse knee harvest |
| PRISM 7 Software | GraphPad | Institutional Access Account | Statistical Analysis |
| Safranin-O stain | SIGMA Life Sciences | S8884 | For sample staining |
| ThinkBoneStage – Rotating Microscope Stage | Think Bone Consulting Inc. – OsteoMetrics (supplier) | http://thinkboneconsulting.com/index_files/Slideholder.php | For histomorphometric analysis and imaging |
| Wacom Pro Pen Stylus | Wacom | https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch | For histomorphometric analysis and imaging |
| Weigerts Iron Hematoxylin A | Fisher | 5029713 | For hematoxylin staining |
| Weigerts Iron Hematoxylin B | Fisher | 5029714 | For hematoxylin staining |
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