외과 마우스 모형에 있는 골관절염의 표준화한 조직 형측정 평가
1Center for Orthopedic Research and Translational Sciences, Department of Orthopedics and Rehabilitation,Pennsylvania State College of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology,Pennsylvania State College of Medicine, 3Department of Pharmacology,Pennsylvania State College of Medicine
Summary
현재 프로토콜은 골관절염을 동반하는 형태학적 관절 변화를 정량화하기 위한 엄격하고 재현 가능한 방법을 확립합니다. 이 프로토콜의 적용은 질병 진행을 모니터링하고 골관절염의 치료 적 개입을 평가하는 데 유용 할 수 있습니다.
Abstract
미국에서 가장 널리 퍼진 관절 질환 중 하나, 골관절염 (OA) 관절 연골의 점진적 변성을 특징으로, 주로 엉덩이와 무릎 관절에, 이는 환자의 이동성과 삶의 질에 중요한 영향을 초래. 현재까지, 연골 변성을 늦추거나 억제 할 수있는 OA에 대한 기존의 치료 요법이 없습니다. 현재, OA 병리학을 이해하고 효율적으로 감속, 중지 또는 OA를 역전시킬 수 있는 새로운 치료 접근법 또는 에이전트를 발견하기 위한 광범위한 연구가 진행되고 있습니다. 따라서, 관절 연골, 수축기 및 골격 뼈에서 OA 관련 병리학 적 변화를 정확하게 평가하기 위해 정량적이고 재현 가능한 접근 법을 가지고하는 것이 중요합니다. 현재, OA 심각도 및 진행은 주로 골관절염 연구 학회 국제 (OARSI) 또는 만킨 채점 시스템을 사용하여 평가된다. 이러한 채점 시스템의 중요성에도 불구하고, 그들은 반정적이며 사용자 주관성에 의해 영향을받을 수 있습니다. 더 중요한 것은, 그들은 정확하게 초기 질병 상태 또는 초기 치료 단계 동안 연골의 미묘한, 아직 중요한 변화를 평가하는 데 실패. 여기서 설명하는 프로토콜은 전산화되고 반자동화된 조직체형 소프트웨어 시스템을 사용하여 OA의 공동 변경 평가를 위한 표준화되고 엄격하며 재현 가능한 정량적 방법론을 수립합니다. 이 프로토콜은 기존 시스템에 강력한 추가를 제시하고 관절의 병리학 적 변화를 보다 효율적으로 감지 할 수 있습니다.
Introduction
미국에서 가장 널리 퍼진 관절 질환 중 하나인 OA는 주로 엉덩이와 무릎 관절에서 관절 연골의 점진적 변성을 특징으로 하며, 이는 환자의 이동성 및 삶의질에중대한 영향을 미치며1,2,,3. 관절 연골은 마찰을 최소화하고, 운동을 용이하게하고, 관절 압축을 견딜 수 있도록 설계된 이단 관절의 특수 결합조직입니다 4. 관절 연골은 두 가지 주요 구성 요소로 구성되어 있습니다 : 연골 세포와 세포 외 매트릭스. 연골세포는 세포외 기매트릭스의 개발, 유지 및 수리에 1차적인 역할을4하는 전문화된 대사 활성 세포이다. 연골 세포 비대 (CH)는 OA 발달의 주요 병리학 적 징후 중 하나입니다. 그것은 증가 세포 크기, 감소 프로테오글리칸 생산, 결국 연골 변성으로 이어질 연골 매트릭스 분해 효소의 증가 생산을 특징으로5,,6,,7. 또한, 관절의 상골골과 경막의 병리학적 변화는 OA 발달 및진행에중요한 역할을 한다8,9,10,,11,,12.9 현재까지 연골 변성을 억제하는 기존 치료법은 없습니다1,2,23,,13,,14.3 따라서, OA 병리학을 이해하고 OA를 감속하거나 중지 할 수있는 새로운 치료 접근법을 발견하는 것을 목표로 하는 광범위한 지속적인 연구가 있습니다. 따라서, 관절의 연골, 수축기 및 아초골 골에서 OA 관련 병리학적 변화를 정확하게 평가할 수 있는 정량적 및 재현가능한 접근법에 대한 필요성이 증가하고 있다.
현재, OA 심각도 및 진행은 주로 OARSI 또는 Mankin 채점시스템(15)을사용하여 평가된다. 그러나 이러한 채점 시스템은 반정적일 뿐이며 사용자 주관성에 의해 영향을 받을 수 있습니다. 더 중요한 것은, 그(것)들은 정확하게 질병 도중 또는 유전 조작 또는 치료 내정간섭에 응하여 합동에서 생기는 미묘한 변경을 평가하지 못합니다. 연골, 연골 또는 골격16,,17,,18,,19,,20,,21의조직 체형 분석을 설명하는 문헌에 산발적 인 보고서가 있습니다. 그러나 이러한 모든 관절 구성 요소의 엄격하고 재현 가능한 조직 체형 분석을 위한 상세한 프로토콜은 여전히 부족하여 현장에서 충족되지 않은 필요성을 야기합니다.
조직 형 분석을 사용하여 OA의 병리학 적 변화를 연구하기 위해, 우리는 내측 반월 상 연골 (DMM)의 불안정화를 통해 OA를 유도하기 위해 수술 OA 마우스 모델을 사용했다. murine OA의 확립 된 모델 중, DMM은 부상22,,23,,24,,25,,26의덜 외상성 메커니즘을 수반하기 때문에 우리의 연구를 위해 선택되었다. 반월 상 연골 인대 부상 (MLI) 또는 전방 십자 인대 부상 (ACLI) 수술에 비해, DMM은인간22,,24,,25,,26에서OA 발달과 유사한 OA의 보다 점진적인 진행을 촉진한다. 마우스는 관절 연골, 골격 및 경막의 변화를 평가하기 위해 DMM 수술 후 12주 동안 안락사시켰다.
이 프로토콜의 목표는 OA와 함께 제공되는 공동 변화를 평가하기 위해 표준화되고 엄격하며 정량적인 접근 방식을 수립하는 것입니다.
Protocol
12 주 된 남성 C57BL/6 쥐 잭스 연구소에서 구입 했다. 모든 마우스는 12시간 의 밝은/어두운 스케줄을 가진 방에 있는 마이크로 이솔레이터 케이지 당 3-5 마우스의 단으로 수용되었다. 모든 동물 절차는 국립 보건원 (NIH) 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드에 따라 수행되었으며 펜실베니아 주립 대학의 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. 1. 외상 후 골관?…
Representative Results
DMM 유도 OA 는 관절 연골 변성 및 연골 세포 손실의 결과DMM-유도 OA는 샴 마우스에 비해 OARSI 점수가 증가하여, 표면 침식 및 연골 손실을 뚜렷하게 특징으로하였다(도 1A,D). 여기에 상세한 히스토모퍼홈트리 프로토콜은 총 연골 영역과 비석연골 영역의 감소를 포함하여 여러 OA 관련 변화를 검출했다(도1A,B,E,…
Discussion
최근 골관절염 연구는 관절 내의 다른 조직과 각 조직이 질병 개시 또는 진행에서 수행하는 역할 사이의 크로스토크에 대한 우리의 이해를 향상시켰으며88, 9,9,10,,35,,36. 따라서, OA의 평가는 연골의 분석에 국한되어서는 안되지만 또한 연골 뼈와 수축기의 분석을 포함해야한?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 비교 의학 직원의 부 및 펜 스테이트 밀튼 S. 허쉬 메디컬 센터에서 분자 및 조직 병리학 코어의 지원을 인정하고 싶습니다. 자금 출처: NIH NIAMS 1RO1AR071968-01A1 (F.K.), ANRF 관절염 연구 보조금 (F.K.).
Materials
| 10% Buffered Formalin Phosphate | Fisher Chemical | SF100-20 | For sample fixation following harvest |
| Acetic Acid, Glacial (Certified A.C.S.) | Fisher Chemical | A38S-212 | For Decalcification Buffer preparation and acetic acid solution preparation for staining |
| Cintiq 27QHD Creative Pen Display | Wacom | https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch | For histomorphometric analysis and imaging |
| Cintiq Ergo stand | Wacom | https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch | For histomorphometric analysis and imaging |
| Ethylenediaminetetraacetic acid, tetrasodium salt dihydrate, 99% | Acros Organics | AC446080010 | For Decalcification Buffer preparation |
| Fast Green stain | SIGMA Life Sciences | F7258 | For sample staining |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 | For sample section collection |
| HistoPrep Xylene | Fisherbrand | HC-700-1GAL | For sample deparrafinization and staining |
| Histosette II Tissue Cassettes – Combination Lid and Base | Fisher | 15-182-701A | For sample processing and embedding |
| HP Z440 Workstation | HP | Product number: Y5C77US#ABA | For histomorphometric analysis and imaging |
| Manual Rotary Microtome | Leica | RM 2235 | For sample sectioning |
| Marking pens | Leica | 3801880 | For sample labeling, cassettes and slides |
| OLYMPUS BX53 Microscope | OLYMPUS | https://www.olympus-lifescience.com/en/microscopes/upright/bx53f2/ | For histomorphometric analysis and imaging |
| OLYMPUS DP 73 Microscope Camera | OLYMPUS | https://www.olympus-lifescience.com/en/camera/color/dp73/ | For histomorphometric analysis and imaging (discontinued) |
| ORION STAR A211 pH meter | Thermo Scientific | STARA2110 | For Decalcification Buffer preparation |
| OsteoMeasure Software | OsteoMetrics | https://www.osteometrics.com/index.htm | For histomorphometric measurement and analysis |
| Perfusion Two Automated Pressure Perfusion system | Leica | Model # 39471005 | For mouse knee harvest |
| PRISM 7 Software | GraphPad | Institutional Access Account | Statistical Analysis |
| Safranin-O stain | SIGMA Life Sciences | S8884 | For sample staining |
| ThinkBoneStage – Rotating Microscope Stage | Think Bone Consulting Inc. – OsteoMetrics (supplier) | http://thinkboneconsulting.com/index_files/Slideholder.php | For histomorphometric analysis and imaging |
| Wacom Pro Pen Stylus | Wacom | https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch | For histomorphometric analysis and imaging |
| Weigerts Iron Hematoxylin A | Fisher | 5029713 | For hematoxylin staining |
| Weigerts Iron Hematoxylin B | Fisher | 5029714 | For hematoxylin staining |
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Cite This Article
Pinamont, W. J., Yoshioka, N. K., Young, G. M., Karuppagounder, V., Carlson, E. L., Ahmad, A., Elbarbary, R., Kamal, F. Standardized Histomorphometric Evaluation of Osteoarthritis in a Surgical Mouse Model. J. Vis. Exp. (159), e60991, doi:10.3791/60991 (2020).