توصيف هياكل أميلويد في الشيخوخة C. Elegans باستخدام التصوير مدى الحياة فلورسينس
Summary
الفلورسينس مدى الحياة وشاشات التصوير، والقياس الكمي ويميز الميول التجميع من البروتينات في المعيشة، والشيخوخة، وشدد نماذج مرض C. elegans.
Abstract
ترتبط الفيبريات الأميلويد مع عدد من الأمراض العصبية مثل هنتنغتون, باركنسون, أو مرض الزهايمر. هذه الفيبريات اميلويد يمكن عزل البروتينات الذاتية ميتاستابل وكذلك مكونات شبكة البروتوستاس (PN) وبالتالي تفاقم البروتين misfolding في الخلية. هناك عدد محدود من الأدوات المتاحة لتقييم عملية تجميع البروتينات الأميلويد داخل الحيوان. نحن نقدم بروتوكولا للميكروسكوبية مدى الحياة الفلورية (FLIM) التي تسمح رصد وكذلك التحديد الكمي للفيبريلية اميلويد في خلايا محددة، مثل الخلايا العصبية، بطريقة غير الغازية ومع تطور الشيخوخة وعند اضطراب PN. FLIM مستقلة عن مستويات التعبير من الفلوروفور وتمكن من تحليل عملية التجميع دون أي مزيد من تلطيخ أو التبييض. يتم إخماد الفلورفور عندما تكون في محيط قريب من الهياكل الأميلويد، مما يؤدي إلى انخفاض عمر الفلورسينس. يرتبط الترويم بشكل مباشر بتجميع بروتين الأميلويد. FLIM هو تقنية متعددة الاستخدامات التي يمكن تطبيقها لمقارنة عملية الفيبريلة من البروتينات الأميلويد مختلفة، والمحفزات البيئية، أو الخلفيات الوراثية في الجسم الحي بطريقة غير الغازية.
Introduction
يحدث تجميع البروتين في كل من الشيخوخة والمرض. من الصعب اتباع المسارات التي تؤدي إلى تكوين وترسب الأميلويدات الكبيرة أو التضمينات غير المتبلور وحركية لها هي بالمثل صعبة للكشف. البروتينات يمكن أن تسيء بسبب الطفرات الجوهرية داخل تسلسل الترميز الخاصة بهم، كما هو الحال في الأمراض الوراثية. البروتينات أيضا يخطئ لأن شبكة البروتوستاس (PN) التي تبقيها قابلة للذوبان ومطوية بشكل صحيح هو ضعف، كما يحدث أثناء الشيخوخة. تتضمن PN المرافقالجزيئية وآلات التحلل وهي مسؤولة عن النشأة الحيوية وللطي والاتجار وتدهور البروتينات1.
C. ظهرت elegans كنموذج لدراسة الشيخوخة والمرض بسبب عمرها القصير، والطبيعة التسببية، وسهولة التلاعب الجيني. وقد تم إنشاء العديد من سلالات C. elegans المعدلة وراثيا التي تعبر عن البروتينات المسببة للأمراض البشرية في الأنسجة الضعيفة. الأهم من ذلك، العديد من السلالات التي تحتوي على البروتينات المعرضة للتجميع تلخيص السمة المميزة للاضطرابات اميلويد، وتشكيل إدراجات كبيرة. بفضل الجسم C. elegans ‘شفافة، يمكن تصور هذه المجاميع في الجسم2الحي، غير الغازية وغير هدام2 . توليد أي بروتين من الفائدة (POI) في الانصهار مع الفلوروفور يسمح للتحقيق في مواقعها، والاتجار، وشبكة التفاعل، ومصير عام.
نحن نقدم بروتوكولا لرصد تجميع البروتينات المسببة للأمراض في المعيشة والشيخوخة C. elegans عن طريق الفلورسينس التصوير مدى الحياة المجهر (FLIM). FLIM هو تقنية قوية تقوم على عمر الفلوروفور ، بدلا من أطياف الانبعاثات. يتم تعريف العمر (تاو، و) على أنه متوسط الوقت المطلوب من قبل فوتون للاضمحلال من حالته اتحمس مرة أخرى إلى حالته الأرضية. يتم حساب عمر جزيء معين باستخدام تقنية المجال الزمني لعد الفوتون الواحد المرتبط بالوقت (TCSPC). في TCSPC-FLIM ، يتم الحصول على وظيفة تسوس الفلورسنت عن طريق إثارة الفلوروفور مع نبضات ليزر قصيرة عالية التردد وقياس أوقات وصول الفوتون المنبعثة إلى كاشف فيما يتعلق بالنبضات. عند مسح عينة، يتم إنشاء صفيف بيانات ثلاثي الأبعاد لكل بكسل: يتضمن الصفيف معلومات حول توزيع الفوتونات في إحداثياتها المكانية x y ومنحنى الاضمحلال الزمني. وبالتالي تصبح عينة معينة خريطة لأعمار الكشف عن المعلومات عن بنية البروتين، ملزمة، والبيئة3،4. كل بروتين الفلورسنت تمتلك حياة جوهرية ومحددة بدقة، وعادة من بضع نانو ثانية (ns)، تعتمد على خصائصه physiochemical. الأهم من ذلك ، فإن عمر الفلوروفور مستقل عن تركيزه ، وكثافة الفلورسنت ، ومنهجية التصوير. ومع ذلك ، داخل النظام البيولوجي ، يمكن أن تتأثر بالعوامل البيئية مثل درجة الحموضة ، ودرجة الحرارة ، وتركيزات الأيون ، وتشبع الأكسجين ، وشركاء التفاعل. العمر حساس أيضا ً للتغيرات الهيكلية الداخلية والتوجه. دمج الفلوروفور إلى POI يؤدي إلى تغيير في حياته وبالتالي معلومات عن سلوك البروتين المنصهر. عندما يتم إحاطة الفلوروفور أو تغليفها في بيئة مقيدة بإحكام ، مثل أوراق بيتا المضادة للمتوازية لبنية اميلويد ، فإنها تفقد الطاقة بشكل غير إشعاعي ، وهي عملية تعرف باسم إخماد5. يروي من الفلوروفور النتائج في تقصير حياتها واضحة. عندما تكون قابلة للذوبان، فإن عمر البروتين سيبقى أقرب إلى قيمته الأصلية الأعلى. في المقابل، عندما يبدأ البروتين في التجميع، فإن عمره سينتقل حتماإلى قيمة أقل6،7. لذلك ، يصبح من الممكن مراقبة الميل التجميعي لأي بروتين تشكيل اميلويد في أعمار مختلفة في C. elegansالحية.
هنا نصف بروتوكول لتحليل تجميع بروتين الانصهار تتألف من مختلف البوليغلوتامين (CAG، Q) تمتد (Q40، Q44، وQ85). نحن نوضح كيف يمكن تطبيق هذه التقنية بالتساوي على الفلورفور، مثل بروتين الفلورسنت السماوي (CFP)، والبروتين الفلوري الأصفر (YFP) وبروتين الفلورسنت الأحمر الأحادي (mRFP)؛ وفي جميع أنسجة C. elegans، بما في ذلك الخلايا العصبية والعضلات والأمعاء. وعلاوة على ذلك، في سياق البروتوستاس، FLIM هو أداة مفيدة جدا لمراقبة التغيرات عند استنفاد المرافقالجزيئية. هدم واحدة من المرافقالجزيئية الرئيسية، والبروتين صدمة الحرارة 1(hsp-1)،عن طريق تدخل الجيش الملكي النيبالي تنتج misfolding المبكر من البروتينات. ثم يتم قياس الزيادة في الحمل التجميعي نتيجة للشيخوخة أو المرض أو المرافقين الناقصين كانخفاض في عمر الفلورسينس.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويصف البروتوكول المعروض هنا تقنية تعتمد على المجهر لتحديد الأنواع المجمعة في نظام نموذج C. elegans. FLIM يمكن أن تميز بدقة وجود كل من الأنواع المجمعة والقابلة للذوبان تنصهر على الفلوروفور عن طريق قياس تسوس العمر الفلوري. عندما يبدأ بروتين الانصهار لتجميع متوسط العمر المسجل سوف يتحول من أعل…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
سلالة العضلات Q40-mRFP التي تقدمها CGC، والتي يتم تمويلها من قبل مكتب المعاهد القومية للصحة لبرامج البنية التحتية للبحوث (P40 OD010440). الخلايا العصبية-Q40-CFP كان هدية لطيفة من مختبر موريموتو. نحن نعترف DFG (KI-1988/5-1 إلى JK، زمالة دكتوراه NeuroCure من قبل مجموعة NeuroCure للتميز إلى MLP)، EMBO (زمالة قصيرة الأجل إلى MLP) وشركة علماء الأحياء (منح السفر إلى CG و MLP) للتمويل. كما نعترف بمرفق التصوير المجهري الخفيف المتقدم في مركز ماكس ديلبروك للطب الجزيئي، برلين، لتوفير الإعداد لتصوير بنيات YFP.
Materials
| Agar-Agar Kobe I | Carl Roth GmbH + Co. KG | 5210.2 | NGM component |
| Ahringer Library hsp-1 siRNA | Source BioScience UK Limited | F26D10.3 | |
| Ampicillin | Carl Roth GmbH + Co. KG | K029.3 | Antibiotic |
| B&H DCS-120 SPC-150 | Becker & Hickl GmbH | FLIM Aquisition software | |
| B&H SPC830-SPC Image | Becker & Hickl GmbH | FLIM Aquisition software | |
| BD Bacto Peptone | BD-Bionsciences | 211677 | NGM component |
| C. elegans iQ44-YFP | CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) | OG412 | |
| C. elegans iQ85-YFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
| C. elegans mQ40-RFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
| C. elegans nQ40-CFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
| Deckgläser-18x18mm | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0657.2 | Cover slips |
| Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) | Carl Roth GmbH + Co. KG | 2316.4 | |
| Leica M165 FC | Leica Camera AG | Mounting Stereomicroscope | |
| Leica TCS SP5 | Leica Camera AG | Confocal Microscope | |
| Levamisole Hydrochloride | AppliChem GmbH | A4341 | Anesthetic |
| OP50 Escherichia coli | CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) | OP50 | |
| PicoQuant PicoHarp300 | PicoQuant GmbH | FLIM Aquisition software | |
| Sodium Azide | Carl Roth GmbH + Co. KG | K305.1 | Anesthetic |
| Sodium Chloride | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3957.2 | NGM component |
| Standard-Objektträger | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0656.1 | Glass slides |
| Universal Agarose | Bio & Sell GmbH | BS20.46.500 | |
| Zeiss AxioObserver.Z1 | Carl Zeiss AG | Confocal Microscope | |
| Zeiss LSM510-Meta NLO | Carl Zeiss AG | Confocal Microscope |
References
- Klaips, C. L., Jayaraj, G. G., Hartl, F. U. Pathways of cellular proteostasis in aging and disease. Journal of Cell Biology. 217 (1), 51-63 (2018).
- Kikis, E. A. The struggle by Caenorhabditis elegans to maintain proteostasis during aging and disease. Biology Direct. 11, 58 (2016).
- Becker, W. Fluorescence lifetime imaging – techniques and applications. Journal of Microscopy. 247 (2), 119-136 (2012).
- Lakowicz, J. R. . Principles of Fluorescence Spectroscopy. , (2006).
- Berezin, M. Y., Achilefu, S. Fluorescence lifetime measurements and biological imaging. Chemical Reviews. 110 (5), 2641-2684 (2010).
- Kaminski Schierle, G. S., et al. A FRET sensor for non-invasive imaging of amyloid formation in vivo. ChemPhysChem. 12 (3), 673-680 (2011).
- Sandhof, C. A., et al. Reducing INS-IGF1 signaling protects against non-cell autonomous vesicle rupture caused by SNCA spreading. Autophagy. , 1-22 (2019).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. 64, e4019 (2012).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook the online review of C. elegans biology. 1999, 1-11 (2006).
- Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), 1-10 (2001).
- Becker, W., et al. Fluorescence Lifetime Imaging by Time-Correlated Single-Photon Counting. Microscopy Research and Technique. 63 (1), 58-66 (2004).
- Warren, S. C., et al. Rapid global fitting of large fluorescence lifetime imaging microscopy datasets. PloS one. 8 (8), e70687 (2013).
- Moronetti Mazzeo, L. E., Dersh, D., Boccitto, M., Kalb, R. G., Lamitina, T. Stress and aging induce distinct polyQ protein aggregation states. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), 10587-10592 (2012).
- Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14914-14919 (2009).
- Wallrabe, H., Periasamy, A. Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy. Current Opinion in Biotechnology. 16 (1), 19-27 (2005).
- Chan, F. T. S., Pinotsi, D., Kaminski Schierle, G. S., Kaminski, C. F. Structure-Specific Intrinsic Fluorescence of Protein Amyloids Used to Study their Kinetics of Aggregation. Bio-nanoimaging: Protein Misfolding and Aggregation. , 147-155 (2013).
- Laine, R. F., et al. Fast Fluorescence Lifetime Imaging Reveals the Aggregation Processes of α-Synuclein and Polyglutamine in Aging Caenorhabditis elegans. ACS Chemical Biology. 14 (7), 1628-1636 (2019).
- Kelbauskas, L., Dietel, W. Internalization of Aggregated Photosensitizers by Tumor Cells: Subcellular Time-resolved Fluorescence Spectroscopy on Derivatives of Pyropheophorbide-a Ethers and Chlorin e6 under Femtosecond One- and Two-photon Excitation. Photochemistry and Photobiology. 76 (6), 686-694 (2002).
- Becker, W., Su, B., Holub, O., Weisshart, K. FLIM and FCS detection in laser-scanning microscopes: Increased efficiency by GaAsP hybrid detectors. Microscopy Research and Technique. 74 (9), 804-811 (2011).
- Suhling, K., French, M. W., Phillips, D. Time-resolved fluorescence microscopy. Photochemical and Photobiological Sciences. 4 (1), 13-22 (2005).
