Karakterisering van Amyloïde Structuren in Aging C. Elegans met behulp van Fluorescentie Lifetime Imaging
Summary
Fluorescentie levenslange beeldvorming monitoren, kwantificeert en onderscheidt de aggregatie tendensen van eiwitten in het leven, veroudering, en benadrukt C. elegans ziekte modellen.
Abstract
Amyloïde fibrils worden geassocieerd met een aantal neurodegeneratieve ziekten zoals de ZvH, Parkinson of de ziekte van Alzheimer. Deze amyloïde fibrils kunnen endogene metastabiele eiwitten en componenten van het proteostasenetwerk (PN) afzonderen en daardoor eiwitmisvouwen in de cel verergeren. Er zijn een beperkt aantal instrumenten beschikbaar om het aggregatieproces van amyloïde eiwitten binnen een dier te beoordelen. We presenteren een protocol voor fluorescentie levensduur microscopie (FLIM) dat monitoring en kwantificering van de amyloïde fibrilisatie in specifieke cellen, zoals neuronen, op een niet-invasieve manier en met de progressie van veroudering en bij verstoring van de PN. FLIM is onafhankelijk van de expressieniveaus van de fluoropforen en maakt een analyse van het aggregatieproces mogelijk zonder verdere vlekken of bleken. Fluorophoren worden gedoofd wanneer ze zich in de nabijheid van amyloïde structuren bevinden, wat resulteert in een afname van de fluorescentielevensduur. Het blussen correleert direct met de aggregatie van het amyloïde eiwit. FLIM is een veelzijdige techniek die kan worden toegepast om het fibrilisatieproces van verschillende amyloïde eiwitten, omgevingsstimuli of genetische achtergronden in vivo op een niet-invasieve manier te vergelijken.
Introduction
Eiwitaggregatie komt zowel bij veroudering als bij ziekte voor. De paden die leiden tot de vorming en afzetting van grote amyloïden of amorfe insluitsels zijn moeilijk te volgen en hun kinetiek zijn eveneens uitdagend om te ontrafelen. Eiwitten kunnen verkeerd worden gevouwen als gevolg van intrinsieke mutaties binnen hun coderingssequenties, zoals in het geval van genetische ziekten. Eiwitten ook verkeerd vouwen omdat de proteostase netwerk (PN) dat houdt ze oplosbaar en goed gevouwen is aangetast, zoals gebeurt tijdens het ouder worden. De PN omvat moleculaire chaperonne en afbraakmachines en is verantwoordelijk voor de biogenese, vouwen, handel en afbraak van eiwitten1.
C. elegans is ontstaan als een model om veroudering en ziekte te bestuderen als gevolg van de korte levensduur, isogene aard, en het gemak van genetische manipulatie. Verschillende C. elegans transgene stammen die menselijke ziekte-veroorzakende eiwitten uitdrukken in kwetsbare weefsels zijn gemaakt. Belangrijk is dat veel van de stammen die aggregatiegevoelige eiwitten bevatten, het kenmerk van amyloïdeaandoeningen, de vorming van grote insluitsels, samenvatten. Dankzij het transparante lichaam van C. elegans kunnen deze aggregaten in vivo, niet-invasief en niet-destructief worden gevisualiseerd2. Het genereren van eiwit van belang (POI) in fusie met een fluorophore maakt het mogelijk om de locaties, mensenhandel, interactie netwerk, en het algemene lot te onderzoeken.
We presenteren een protocol om de aggregatie van ziekteveroorzakende eiwitten in levende en verouderende C. elegans via fluorescentie lifetime imaging microscopie (FLIM) te monitoren. FLIM is een krachtige techniek gebaseerd op de levensduur van een fluorophore, in plaats van de emissiespectra. De levensduur (tau, τ) wordt gedefinieerd als de gemiddelde tijd die een foton nodig heeft om te vergaan van zijn opgewonden toestand terug naar zijn grondstaat. De levensduur van een bepaald molecuul wordt berekend met de tijd-domein techniek van tijd-gecorreleerde enkele foton tellen (TCSPC). In TCSPC-FLIM wordt de fluorescerende vervalfunctie verkregen door de fluorophore op te winden met korte, hoogfrequente laserpulsen en de aankomsttijden van het uitgezonden foton te meten aan een detector met betrekking tot de pulsen. Bij het scannen van een voorbeeld wordt voor elke pixel een driedimensionale gegevensarray gemaakt: de array bevat informatie over de verdeling van de fotonen in hun x,y ruimtelijke coördinaten en hun temporele vervalcurve. Een bepaald monster wordt daarom een kaart van levens die informatie onthult over de structuur van het eiwit, binding en omgeving3,4. Elk fluorescerend eiwit heeft een intrinsieke en nauwkeurig gedefinieerde levensduur, meestal van een paar nanoseconden (ns), afhankelijk van de fysiochemische eigenschappen. Belangrijk is dat de levensduur van een fluorophore onafhankelijk is van zijn concentratie, fluorescerende intensiteit en van de beeldvormingsmethode. Binnen een biologisch systeem kan het echter worden beïnvloed door omgevingsfactoren zoals pH, temperatuur, ionenconcentraties, zuurstofverzadiging en zijn interactiepartners. Levens zijn ook gevoelig voor interne structurele veranderingen en oriëntatie. Het smelten van een fluorophore aan een POI resulteert in een verandering in zijn levensduur en dus informatie over het gedrag van het gesmolten eiwit. Wanneer een fluorophore is omgeven of ingekapseld in een strak gebonden omgeving, zoals de antiparallelle bètabladen van een amyloïde structuur, verliest het energie niet-radiatief, een proces dat bekend staat als het blussen5. Het blussen van de fluoropforen resulteert in een verkorting van de schijnbare levensduur. Wanneer oplosbaar, zal de levensduur van een eiwit dichter bij zijn oorspronkelijke, hogere waarde blijven. Wanneer een eiwit zich daarentegen begint op te saggregeren, zal de levensduur ervan onvermijdelijk verschuiven naar een lagere waarde6,7. Daarom wordt het mogelijk om de aggregatieneiging van amyloïde-vormende eiwitten op verschillende leeftijden in levende C. eleganste controleren.
Hier beschrijven we een protocol om de aggregatie te analyseren van een fusie-eiwit bestaande uit verschillende polyglutamine (CAG, Q) (Q40, Q44 en Q85). We illustreren hoe de techniek ook kan worden toegepast op verschillende fluorophoren, zoals cyaan fluorescerend eiwit (GVB), geel fluorescerend eiwit (YFP) en monomeric rood fluorescerend eiwit (mRFP); en in alle weefsels van C. elegans,met inbegrip van de neuronen, spieren, en de darm. Bovendien is FLIM in de context van proteostase een zeer nuttig instrument om veranderingen bij uitputting van moleculaire chaperononen waar te nemen. Het neerhalen van een van de belangrijkste moleculaire chaperononen, hitteshock eiwit 1 (hsp-1), via RNA interferentie produceert voortijdige misfolding van eiwitten. De toename van de aggregatiebelasting als gevolg van veroudering, ziekte of gebrekkige chaperonen, wordt vervolgens gemeten als een afname van de levensduur van de fluorescentie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het hier gepresenteerde protocol beschrijft een op microscopie gebaseerde techniek om geaggregeerde soorten in het C. elegans-modelsysteem te identificeren. FLIM kan de aanwezigheid van zowel geaggregeerde als oplosbare soorten die tot fluorophore zijn gefuseerd nauwkeurig karakteriseren door meting van hun fluorescentielevensduurverval. Wanneer een fusie-eiwit begint te aggregeren zal de geregistreerde gemiddelde levensduur verschuiven van een hogere naar een lagere waarde16. De neiging …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De spier-Q40-mRFP stam die door de CGC, die wordt gefinancierd door NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Het neuronale Q40-GVB was een soort geschenk van het Morimoto Lab. Wij erkennen de DFG (KI-1988/5-1 aan JK, NeuroCure PhD fellowship door de NeuroCure Cluster of Excellence aan MLP), EMBO (Korte termijn fellowship to MLP) en het Bedrijf van Biologen (reissubsidies aan CG en MLP) voor financiering. We erkennen ook de Advanced Light Microscopy imaging faciliteit in het Max Delbrück Centre for Molecular Medicine, Berlijn, voor het verstrekken van de setup om de YFP constructies beeld.
Materials
| Agar-Agar Kobe I | Carl Roth GmbH + Co. KG | 5210.2 | NGM component |
| Ahringer Library hsp-1 siRNA | Source BioScience UK Limited | F26D10.3 | |
| Ampicillin | Carl Roth GmbH + Co. KG | K029.3 | Antibiotic |
| B&H DCS-120 SPC-150 | Becker & Hickl GmbH | FLIM Aquisition software | |
| B&H SPC830-SPC Image | Becker & Hickl GmbH | FLIM Aquisition software | |
| BD Bacto Peptone | BD-Bionsciences | 211677 | NGM component |
| C. elegans iQ44-YFP | CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) | OG412 | |
| C. elegans iQ85-YFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
| C. elegans mQ40-RFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
| C. elegans nQ40-CFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
| Deckgläser-18x18mm | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0657.2 | Cover slips |
| Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) | Carl Roth GmbH + Co. KG | 2316.4 | |
| Leica M165 FC | Leica Camera AG | Mounting Stereomicroscope | |
| Leica TCS SP5 | Leica Camera AG | Confocal Microscope | |
| Levamisole Hydrochloride | AppliChem GmbH | A4341 | Anesthetic |
| OP50 Escherichia coli | CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) | OP50 | |
| PicoQuant PicoHarp300 | PicoQuant GmbH | FLIM Aquisition software | |
| Sodium Azide | Carl Roth GmbH + Co. KG | K305.1 | Anesthetic |
| Sodium Chloride | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3957.2 | NGM component |
| Standard-Objektträger | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0656.1 | Glass slides |
| Universal Agarose | Bio & Sell GmbH | BS20.46.500 | |
| Zeiss AxioObserver.Z1 | Carl Zeiss AG | Confocal Microscope | |
| Zeiss LSM510-Meta NLO | Carl Zeiss AG | Confocal Microscope |
References
- Klaips, C. L., Jayaraj, G. G., Hartl, F. U. Pathways of cellular proteostasis in aging and disease. Journal of Cell Biology. 217 (1), 51-63 (2018).
- Kikis, E. A. The struggle by Caenorhabditis elegans to maintain proteostasis during aging and disease. Biology Direct. 11, 58 (2016).
- Becker, W. Fluorescence lifetime imaging – techniques and applications. Journal of Microscopy. 247 (2), 119-136 (2012).
- Lakowicz, J. R. . Principles of Fluorescence Spectroscopy. , (2006).
- Berezin, M. Y., Achilefu, S. Fluorescence lifetime measurements and biological imaging. Chemical Reviews. 110 (5), 2641-2684 (2010).
- Kaminski Schierle, G. S., et al. A FRET sensor for non-invasive imaging of amyloid formation in vivo. ChemPhysChem. 12 (3), 673-680 (2011).
- Sandhof, C. A., et al. Reducing INS-IGF1 signaling protects against non-cell autonomous vesicle rupture caused by SNCA spreading. Autophagy. , 1-22 (2019).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. 64, e4019 (2012).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook the online review of C. elegans biology. 1999, 1-11 (2006).
- Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), 1-10 (2001).
- Becker, W., et al. Fluorescence Lifetime Imaging by Time-Correlated Single-Photon Counting. Microscopy Research and Technique. 63 (1), 58-66 (2004).
- Warren, S. C., et al. Rapid global fitting of large fluorescence lifetime imaging microscopy datasets. PloS one. 8 (8), e70687 (2013).
- Moronetti Mazzeo, L. E., Dersh, D., Boccitto, M., Kalb, R. G., Lamitina, T. Stress and aging induce distinct polyQ protein aggregation states. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), 10587-10592 (2012).
- Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14914-14919 (2009).
- Wallrabe, H., Periasamy, A. Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy. Current Opinion in Biotechnology. 16 (1), 19-27 (2005).
- Chan, F. T. S., Pinotsi, D., Kaminski Schierle, G. S., Kaminski, C. F. Structure-Specific Intrinsic Fluorescence of Protein Amyloids Used to Study their Kinetics of Aggregation. Bio-nanoimaging: Protein Misfolding and Aggregation. , 147-155 (2013).
- Laine, R. F., et al. Fast Fluorescence Lifetime Imaging Reveals the Aggregation Processes of α-Synuclein and Polyglutamine in Aging Caenorhabditis elegans. ACS Chemical Biology. 14 (7), 1628-1636 (2019).
- Kelbauskas, L., Dietel, W. Internalization of Aggregated Photosensitizers by Tumor Cells: Subcellular Time-resolved Fluorescence Spectroscopy on Derivatives of Pyropheophorbide-a Ethers and Chlorin e6 under Femtosecond One- and Two-photon Excitation. Photochemistry and Photobiology. 76 (6), 686-694 (2002).
- Becker, W., Su, B., Holub, O., Weisshart, K. FLIM and FCS detection in laser-scanning microscopes: Increased efficiency by GaAsP hybrid detectors. Microscopy Research and Technique. 74 (9), 804-811 (2011).
- Suhling, K., French, M. W., Phillips, D. Time-resolved fluorescence microscopy. Photochemical and Photobiological Sciences. 4 (1), 13-22 (2005).
