Caratterizzazione delle strutture amiloidi nell'invecchiamento C. Elegans utilizzando Fluorescence Lifetime Imaging
Summary
L’imaging a vita di fluorescenza monitora, quantifica e distingue le tendenze di aggregazione delle proteine nei modelli di malattia di C. elegans viventi, invecchiamento e stressati.
Abstract
Le fibrille amiloidi sono associate a una serie di malattie neurodegenerative come la Malattia di Huntington, Parkinson o Alzheimer. Queste fibrille amiloidi possono seprussiane le proteine metastabili endogene così come i componenti della rete proteostasi (PN) e quindi esacerbare il ripiegamento mistribosco proteico nella cellula. Ci sono un numero limitato di strumenti disponibili per valutare il processo di aggregazione delle proteine amiloidi all’interno di un animale. Presentiamo un protocollo per la microscopia a vita di fluorescenza (FLIM) che consente il monitoraggio e la quantificazione della fibrillazione amiloide in cellule specifiche, come i neuroni, in modo non invasivo e con la progressione dell’invecchiamento e il PN. FLIM è indipendente dai livelli di espressione del fluoroforo e consente un’analisi del processo di aggregazione senza ulteriori colorazioni o sbiancamenti. I fluorofori vengono spenti quando si trovano nelle immediate vicinanze di strutture amiloidi, il che si traduce in una diminuzione della durata della fluorescenza. Lo spegnimento è direttamente correlato all’aggregazione della proteina amiloide. FLIM è una tecnica versatile che può essere applicata per confrontare il processo di fibrilizzazione di diverse proteine amiloidi, stimoli ambientali o background genetici in vivo in modo non invasivo.
Introduction
L’aggregazione proteica si verifica sia nell’invecchiamento che nella malattia. I percorsi che portano alla formazione e alla deposizione di grandi amiloidi o inclusioni amorfosi sono difficili da seguire e la loro cinetica è altrettanto difficile da svelare. Le proteine possono misfold a causa di mutazioni intrinseche all’interno delle loro sequenze di codifica, come nel caso delle malattie genetiche. Le proteine si piegano male perché la rete proteostasi (PN) che le mantiene solubili e piegate correttamente è compromessa, come accade durante l’invecchiamento. Il PN comprende chaperones molecolari e macchine per degradazione ed è responsabile della biogenesi, del ripiegamento, del traffico e della degradazione delle proteine1.
C. elegans è emerso come un modello per studiare l’invecchiamento e la malattia a causa della sua breve durata di vita, della natura isogenica e della facilità di manipolazione genetica. Sono stati creati diversi ceppi transgenici C. elegans che esprimono proteine che causano malattie umane nei tessuti vulnerabili. È importante sottolineare che molti ceppi contenenti proteine soggette ad aggregazione riassumono il segno distintivo dei disturbi amiloidi, la formazione di grandi inclusioni. Grazie al corpo trasparente di C. elegans, questi aggregati possono essere visualizzati in vivo, in modo non invasivo e non distruttivo2. Generare qualsiasi proteina di interesse (POI) in fusione con un fluoroforo permette di indagare i suoi luoghi, il traffico, la rete di interazione e il destino generale.
Vi presentiamo un protocollo per monitorare l’aggregazione di proteine che causano malattie nel vivere e nell’invecchiamento C. elegans tramite microscopia imaging a vita di fluorescenza (FLIM). FLIM è una tecnica potente basata sulla durata di un fluoroforo, piuttosto che sui suoi spettri di emissione. La durata (tau, ) è definita come il tempo medio richiesto da un fotone per decadere dal suo stato eccitato al suo stato di terra. La durata di una determinata molecola viene calcolata con la tecnica del dominio temporale del conteggio dei singoli fotoni (TCSPC). In TCSPC-FLIM, la funzione di decadimento fluorescente si ottiene entusiasmando il fluoroforo con impulsi laser brevi e ad alta frequenza e misurando gli orari di arrivo del fotone emesso in un rilevatore rispetto agli impulsi. Durante la scansione di un campione, viene creato un array di dati tridimensionale per ogni pixel: l’array include informazioni sulla distribuzione dei fotoni nelle coordinate spaziali x,y e la loro curva di decadimento temporale. Un dato campione diventa quindi una mappa di vite che rivelano informazioni sulla struttura, il legame e l’ambiente3,,4. Ogni proteina fluorescente possiede una durata intrinseca e definita con precisione, di solito di pochi nanosecondi (ns), a seconda delle sue proprietà fisiochimiche. È importante sottolineare che la durata di un fluoroforo è indipendente dalla sua concentrazione, dall’intensità fluorescente e dalla metodologia di imaging. Tuttavia, all’interno di un sistema biologico, può essere influenzato da fattori ambientali come pH, temperatura, concentrazioni di ioni, saturazione di ossigeno e suoi partner di interazione. Le durate sono anche sensibili ai cambiamenti strutturali interni e all’orientamento. Fondere un fluoroforo a un POI si traduce in un cambiamento nel suo ciclo di vita e di conseguenza informazioni sul comportamento della proteina fusa. Quando un fluoroforo è circondato o incapsulato in un ambiente strettamente legato, come i fogli beta antiparalleli di una struttura amiloide, perde energia in modo non radiodiativo, un processo noto come spegnimento5. Il cinto del fluoroforo comporta un accorciamento della sua vita apparente. Quando è solubile, la vita di una proteina rimarrà più vicina al suo valore originale e più alto. Al contrario, quando una proteina inizia ad aggregarsi, la sua durata si sposterà inevitabilmente su un valore inferiore6,7. Pertanto, diventa possibile monitorare la propensione di aggregazione di qualsiasi proteina che forma amiloidi in diverse età nel vivere C. elegans.
Qui descriviamo un protocollo per analizzare l’aggregazione di una proteina di fusione che comprende diversi tratti di poliglutamina (CAG, Q) (Q40, Q44 e Q85). Illustreremo come la tecnica possa essere applicata ugualmente a diversi fluorofori, come la proteina cianescente (CFP), la proteina fluorescente gialla (YFP) e la proteina fluorescente rosso monomerica (mRFP); e in tutti i tessuti di C. elegans, compresi i neuroni, i muscoli e l’intestino. Inoltre, nel contesto della proteostasi, FLIM è uno strumento molto utile per osservare i cambiamenti in seguito all’esaurimento degli chaperoni molecolari. Abbattere uno degli chaperoni molecolari chiave, la proteina da shock termico 1 (hsp-1), tramite l’interferenza dell’RNA produce un ripiegamento errato delle proteine. L’aumento del carico di aggregazione a causa dell’invecchiamento, della malattia o degli accompagnatori carenti carenti, viene quindi misurato come diminuzione della durata della fluorescenza.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo qui presentato descrive una tecnica basata sulla microscopia per identificare le specie aggregate nel sistema modello C. elegans. FLIM può caratterizzare con precisione la presenza di specie aggregate e solubili fuse in un fluoroforo attraverso la misurazione dei loro decadimenti di durata della fluorescenza. Quando una proteina di fusione inizia ad aggregare la sua durata media registrata passerà da un valore superiore a un valore più bassodi 16. La propensione all’aggre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il ceppo muscolare-Q40-mRFP fornito dal CGC, che è finanziato dal NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Il neuronale-Q40-CFP era un dono gentile del Morimoto Lab. Riconosciamo il DFG (KI-1988/5-1 a JK, la borsa di studio NeuroCure PhD del Cluster di Eccellenza NeuroCure a MLP), l’EMBO (Short term fellowship to MLP) e la Società dei Biologi (travel grants to CG and MLP) per il finanziamento. Riconosciamo anche l’impianto di imaging Advanced Light Microscopy presso il Centro Max Delbràck per la Medicina Molecolare di Berlino, per aver fornito la configurazione per l’immagine dei costrutti YFP.
Materials
| Agar-Agar Kobe I | Carl Roth GmbH + Co. KG | 5210.2 | NGM component |
| Ahringer Library hsp-1 siRNA | Source BioScience UK Limited | F26D10.3 | |
| Ampicillin | Carl Roth GmbH + Co. KG | K029.3 | Antibiotic |
| B&H DCS-120 SPC-150 | Becker & Hickl GmbH | FLIM Aquisition software | |
| B&H SPC830-SPC Image | Becker & Hickl GmbH | FLIM Aquisition software | |
| BD Bacto Peptone | BD-Bionsciences | 211677 | NGM component |
| C. elegans iQ44-YFP | CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) | OG412 | |
| C. elegans iQ85-YFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
| C. elegans mQ40-RFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
| C. elegans nQ40-CFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
| Deckgläser-18x18mm | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0657.2 | Cover slips |
| Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) | Carl Roth GmbH + Co. KG | 2316.4 | |
| Leica M165 FC | Leica Camera AG | Mounting Stereomicroscope | |
| Leica TCS SP5 | Leica Camera AG | Confocal Microscope | |
| Levamisole Hydrochloride | AppliChem GmbH | A4341 | Anesthetic |
| OP50 Escherichia coli | CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) | OP50 | |
| PicoQuant PicoHarp300 | PicoQuant GmbH | FLIM Aquisition software | |
| Sodium Azide | Carl Roth GmbH + Co. KG | K305.1 | Anesthetic |
| Sodium Chloride | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3957.2 | NGM component |
| Standard-Objektträger | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0656.1 | Glass slides |
| Universal Agarose | Bio & Sell GmbH | BS20.46.500 | |
| Zeiss AxioObserver.Z1 | Carl Zeiss AG | Confocal Microscope | |
| Zeiss LSM510-Meta NLO | Carl Zeiss AG | Confocal Microscope |
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