Fluorescens levetid imaging overvåger, kvantificerer og skelner aggregering tendenser af proteiner i levende, aldring, og understregede C. elegans sygdom modeller.
Amyloid fibriller er forbundet med en række neurodegenerative sygdomme som Huntingtons, Parkinsons eller Alzheimers sygdom. Disse amyloid fibriller kan sequester endogene metastabile proteiner samt komponenter i proteostasis netværk (PN) og dermed forværre protein misfolding i cellen. Der er et begrænset antal værktøjer til rådighed til at vurdere aggregering af amyloid proteiner i et dyr. Vi præsenterer en protokol for fluorescens levetid mikroskopi (FLIM), der tillader overvågning samt kvantificering af amyloid fibrilization i specifikke celler, såsom neuroner, i en noninvasive måde og med progression af aldring og ved forstyrrelser af pn’en. FLIM er uafhængig af fluorophores udtryksniveauer og muliggør en analyse af aggregeringsprocessen uden yderligere farvning eller blegning. Fluorophorer slukkes, når de er i nærheden af amyloid strukturer, hvilket resulterer i et fald i fluorescens levetid. Dæmpningen korrelerer direkte med sammenlægningen af amyloidproteinet. FLIM er en alsidig teknik, der kan anvendes til at sammenligne fibrilization processen med forskellige amyloid proteiner, miljømæssige stimuli, eller genetiske baggrunde in vivo i en ikke-invasiv måde.
Protein aggregering forekommer både i aldring og sygdom. De veje, der fører til dannelse og aflejring af store amyloider eller amorfe indeslutninger er vanskelige at følge, og deres kinetik er ligeledes udfordrende at optrævle. Proteiner kan foldes forkert på grund af iboende mutationer inden for deres kodningsekvenser, som det er tilfældet med genetiske sygdomme. Proteiner også misfold fordi proteostasis netværk (PN), der holder dem opløselige og korrekt foldet er svækket, som det sker under aldring. PN omfatter molekylære chaperoner og nedbrydningsmaskiner og er ansvarlig for biogenese, foldning, handel og nedbrydning af proteiner1.
C. elegans har vist sig som en model til at studere aldring og sygdom på grund af sin korte levetid, isogene karakter, og nem genetisk manipulation. Flere C. elegans transgene stammer, der udtrykker humane sygdomsfremkaldende proteiner i sårbare væv er blevet skabt. Vigtigere er det, mange af de stammer, der indeholder aggregering-tilbøjelige proteiner opsummere kendetegnende for amyloid lidelser, dannelsen af store indeslutninger. Takket være C. elegans ‘gennemsigtige krop, kan disse aggregater visualiseres in vivo, noninvasively og nondestructively2. Generering af protein af interesse (POI) i fusion med en fluorophore gør det muligt at undersøge dens placeringer, menneskehandel, interaktion netværk, og generelle skæbne.
Vi præsenterer en protokol til at overvåge aggregering af sygdomsfremkaldende proteiner i levende og aldrende C. elegans via fluorescens levetid imaging mikroskopi (FLIM). FLIM er en kraftfuld teknik baseret på levetiden for en fluorophore, snarere end dens emissionsspektre. Levetiden (tau, τ) er defineret som den gennemsnitlige tid, der kræves af en foton til henfald fra sin ophidset tilstand tilbage til sin jorden tilstand. Et givet molekyles levetid beregnes med tidsdomæneteknikken for tidskorreleret enkelt fotontælling (TCSPC). I TCSPC-FLIM opnås fluorescerende henfaldsfunktion ved at spændende fluorophore med korte, højfrekvente laserimpulser og måle den udsendte fotons ankomsttider til en detektor med hensyn til impulserne. Når du scanner et eksempel, oprettes der en tredimensionel datamatrix for hver pixel: Arrayet indeholder oplysninger om fotonernes fordeling i deres x,y rumlige koordinater og deres tidsmæssige henfaldskurve. En given prøve bliver derfor et kort over levetider, der afslører oplysninger om proteinets struktur, binding og miljø3,4. Hvert fluorescerende protein har en iboende og præcist defineret levetid, normalt af et par nanosekunder (ns), afhængig af dens fysiokemiske egenskaber. Det er vigtigt, at en fluorophores levetid er uafhængig af dens koncentration, fluorescerende intensitet og billedbehandlingsmetoden. Men inden for et biologisk system, det kan påvirkes af miljømæssige faktorer såsom pH, temperatur, ion koncentrationer, iltmætning, og dens interaktion partnere. Levetider er også følsomme over for interne strukturelle ændringer og orientering. Sammensmeltning af en fluorophore til et POI resulterer i en ændring i dens levetid og dermed oplysninger om opførsel af det smeltede protein. Når en fluorophore er omgivet eller indkapslet i et tæt bundet miljø, såsom antiparallel beta ark af en amyloid struktur, det mister energi ikke-radiativt, en proces kendt som dæmpning5. Dæmpning af fluorophore resulterer i en forkortelse af dens tilsyneladende levetid. Når opløselige, et protein levetid vil forblive tættere på sin oprindelige, højere værdi. I modsætning hertil, når et protein begynder at samle, vil dets levetid uundgåeligt skifte til en lavere værdi6,7. Derfor bliver det muligt at overvåge sammenlægningtilbøjeligheden af amyloiddannende protein i forskellige aldre i levende C. elegans.
Her beskriver vi en protokol til analyse af sammenlægningen af et fusionsprotein bestående af forskellige polyglutaminstrækninger (CAG, Q) (Q40, Q44 og Q85). Vi illustrerer, hvordan teknikken kan anvendes på samme måde på forskellige fluorophorer, såsom cyanfluorescerende protein (CFP), gult fluorescerende protein (YFP) og monomerisk rødt fluorescerende protein (mRFP); og i alle væv af C. elegans, herunder neuroner, muskler, og tarmen. Desuden, i forbindelse med proteostase, FLIM er et meget nyttigt redskab til at observere ændringer ved udtømning af molekylære chaperoner. At vælte en af de vigtigste molekylære chaperoner, varmechokprotein 1 (hsp-1) via RNA-interferens producerer for tidlig misfoldning af proteiner. Stigningen i aggregering belastning som følge af aldring, sygdom, eller mangelfuld chaperones, måles derefter som et fald i fluorescens levetid.
Den protokol, der præsenteres her, beskriver en mikroskopibaseret teknik til at identificere aggregerede arter i C. elegans modelsystem. FLIM kan præcist karakterisere tilstedeværelsen af både aggregerede og opløselige arter smeltet til en fluorophore via måling af deres fluorescens levetid henfald. Når et fusionsprotein begynder at samle sin registrerede gennemsnitlige levetid, vil det gå fra en højere til en lavere værdi16. Tilbøjeligheden til aggregering kan derefter udledes…
The authors have nothing to disclose.
Den muskel-Q40-mRFP stamme fra CGC, som er finansieret af NIH Office of Research Infrastructure Programmer (P40 OD010440). Den neuronal-Q40-CFP var en slags gave af Morimoto Lab. Vi anerkender DFG (KI-1988/5-1 til JK, NeuroCure PhD stipendium af NeuroCure Cluster of Excellence til MLP), EMBO (Kortsigtet stipendium til MLP) og Company of Biologs (rejse tilskud til CG og MLP) for finansiering. Vi anerkender også Advanced Light Microscopy imaging facilitet på Max Delbrück Center for Molecular Medicine, Berlin, for at give opsætningen til billedet YFP konstruktioner.
Agar-Agar Kobe I | Carl Roth GmbH + Co. KG | 5210.2 | NGM component |
Ahringer Library hsp-1 siRNA | Source BioScience UK Limited | F26D10.3 | |
Ampicillin | Carl Roth GmbH + Co. KG | K029.3 | Antibiotic |
B&H DCS-120 SPC-150 | Becker & Hickl GmbH | FLIM Aquisition software | |
B&H SPC830-SPC Image | Becker & Hickl GmbH | FLIM Aquisition software | |
BD Bacto Peptone | BD-Bionsciences | 211677 | NGM component |
C. elegans iQ44-YFP | CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) | OG412 | |
C. elegans iQ85-YFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
C. elegans mQ40-RFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
C. elegans nQ40-CFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
Deckgläser-18x18mm | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0657.2 | Cover slips |
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) | Carl Roth GmbH + Co. KG | 2316.4 | |
Leica M165 FC | Leica Camera AG | Mounting Stereomicroscope | |
Leica TCS SP5 | Leica Camera AG | Confocal Microscope | |
Levamisole Hydrochloride | AppliChem GmbH | A4341 | Anesthetic |
OP50 Escherichia coli | CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) | OP50 | |
PicoQuant PicoHarp300 | PicoQuant GmbH | FLIM Aquisition software | |
Sodium Azide | Carl Roth GmbH + Co. KG | K305.1 | Anesthetic |
Sodium Chloride | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3957.2 | NGM component |
Standard-Objektträger | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0656.1 | Glass slides |
Universal Agarose | Bio & Sell GmbH | BS20.46.500 | |
Zeiss AxioObserver.Z1 | Carl Zeiss AG | Confocal Microscope | |
Zeiss LSM510-Meta NLO | Carl Zeiss AG | Confocal Microscope |