Messung der Echtzeit-Arzneimittelreaktion in organotypischen Tumorgewebescheiben
Summary
Wir führen ein Protokoll zur Messung der Echtzeit-Arzneimittelreaktion in organotypischen Tumorgewebescheiben ein. Die hier skizzierte experimentelle Strategie bietet eine Plattform, um mittelhohe Durchsatz-Medikamenten-Screens auf Gewebescheiben durchzuführen, die aus klinischen oder Maustumoren unter ex vivo-Bedingungen abgeleitet werden.
Abstract
Tumorgewebe bestehen aus Krebszellen, infiltrierten Immunzellen, Endothelzellen, Fibroblasten und extrazellulärer Matrix. Dieses komplexe Milieu bildet die Tumormikroumgebung (TME) und kann die Reaktion auf Therapie in vivo oder Arzneimittelreaktion ex vivo modulieren. Herkömmliche Krebsmedikamenten-Entdeckungs-Screens werden an Zellen durchgeführt, die in einer Monoschicht kultiviert werden, einem System, das den Einfluss von TME kritisch vermisst. So stärken experimentelle Systeme, die empfindliche und hochdurchsatzige Assays mit physiologischem TME integrieren, den präklinischen Wirkstoffentdeckungsprozess. Hier führen wir ex vivo Tumorgewebescheibenkultur als Plattform für das Mittel-Hochdurchsatz-Medikamentenscreening ein. Organotypische Gewebescheibenkultur stellt präzise geschnittene, dünne Tumorabschnitte dar, die mit Unterstützung einer porösen Membran in einer Flüssigkeits-Luft-Schnittstelle gepflegt werden. In diesem Protokoll beschreiben wir die Herstellung und Wartung von Gewebescheiben, die aus Maustumoren und Tumoren aus patientenabgeleiteten Xenograft-Modellen (PDX) hergestellt werden. Um Veränderungen der Gewebelebensfähigkeit als Reaktion auf die medikamentöse Behandlung zu bewerten, haben wir einen biokompatiblen Lumineszenz-basierten Lebensfähigkeitstest genutzt, der eine Echtzeit-, schnelle und empfindliche Messung lebensfähiger Zellen im Gewebe ermöglicht. Mit dieser Plattform evaluierten wir dosisabhängige Reaktionen von Gewebescheiben auf den Multikinase-Inhibitor, Staurosporin und das zytotoxische Mittel Doxorubicin. Darüber hinaus zeigen wir die Anwendung von Gewebescheiben für die Ex-vivo-Pharmakologie, indem wir 17 klinische und präklinische Medikamente auf Gewebescheiben untersuchen, die aus einem einzelnen PDX-Tumor hergestellt werden. Unsere physiologisch relevante, hochempfindliche und robuste Ex-vivo-Screening-Plattform wird die Entdeckung und Entscheidungsfindung von präklinischen Onkologie-Medikamenten erheblich stärken.
Introduction
Krebszellwechselwirkungen mit den physikalischen und biochemischen Eigenschaften des umgebenden Stromalgewebes bilden das TME. TME kann Tumorwachstum stimulieren, Metastasen und modulieren Tumorreaktion auf Therapie1. In der konventionellen präklinischen Arzneimittelentwicklung werden Arzneimittelkandidaten in der Regel zuerst mit kultivierten Krebszelllinien gescreent, einer Assay-Plattform, der die TME2kritisch fehlt. Dieser Mangel an physiologischem TME in zellbasierten Vorscreening-Stadien kann die Entdeckung wirksamer Wirkstoffe in tumortragenden Tiermodellen einschränken und zur hohen Zermürbungsrate vieler vielversprechender Onkologie-Medikamente in späteren klinischen Entwicklungsstadien beitragen3.
Trotz der Bedeutung von TME bei der Modulation von Tumormedikamentenreaktionen schränken experimentelle Zwänge die Anwendung physiologisch relevanterer Systeme in den frühen Stadien der Arzneimittelentdeckung und -entwicklung ein. Es ist unpraktisch, Hunderte von therapeutischen Wirkstoffen auf Tumore von Tiermodellen oder Patiententumorproben zu überprüfen. Tatsächlich sind chirurgische Proben knappe Ressourcen mit unterschiedlichem genetischen Hintergrund, und das Screening von Tausenden von Kandidatenmolekülen in Tiermodellen ist aufgrund von experimentellem Umfang, Kosten und Tierschutz nicht machbar.
Tumorgewebe-Scheibenkultur, wo präzise geschnittene, dünne Tumorabschnitte ex vivo kultiviert werden, kann die Begrenzung der physiologischen TME in Medikamenten-Screening-Assays angehen. Historisch gesehen, der Bereich der Neurowissenschaften Pionier und machte umfangreiche Optimierungen der Schnittkultur für Gehirngewebe4. In jüngster Zeit haben viele Studien die Vorbereitung von Scheiben aus verschiedenen Arten von Tumorgewebe gezeigt, einschließlich zelllinienabgeleiteter Tumoren, spontaner Tumormodelle, von Patienten abgeleiteter Xenografts (PDX) und Primärpatiententumoren. Ex-vivo-Gewebeschnittkultur integriert Vorteile sowohl von in vivo als auch von in vitro Kultur5. Tumorgewebescheiben behalten intakte Gewebearchitektur und vielfältige Zellzusammensetzung, was die Untersuchung von Krebszellen im TME-Kontext ermöglicht.
Dieses Protokoll führt ein organotypisches Tumorgewebe-Slice-Kultursystem in Kombination mit einem Echtzeit-, hochsensiblen Lebensfähigkeitstest ein, um Arzneimittelreaktionen zu bewerten. Arzneimittelwirksamkeitstests an organotypischen Tumorgewebescheiben in zuvor eingeführten Protokollen beruhen auf der Messung von Veränderungen der Zelllebensfähigkeit durch Fluoreszenzfarbstoff-Inkorporation, Immunhistochemie (IHC) oder MTT ((3- [4, 5-dimethylthiazol-2-yl]-2, 5 Diphenyltetrazoliumbromid) Assay6,7,8,9. Alle diese Methoden sind Jedoch Endpunkt-Assays und leiden unter geringer Empfindlichkeit, langer Verarbeitungszeit, komplexen Datenanalysen, einem engen Signalbereich und hohem experimentellen Fehler. Unser auf Lumineszenz basierendes, zellkompatibles Reagenz verbessert diese Tests, indem es einen breiten Signalbereich und eine sofortige Messung (ca. 5 min) ohne vorherige Verarbeitung und minimale Nachbearbeitung bietet. Dieses Reagenz ist hochempfindlich und kann in den Zellkulturmedien koexistieren, was eine kontinuierliche und zeitliche Messung der Zelllebensfähigkeit ermöglicht. Dieses Assay-System ist anwendbar auf Daspereder präputiert es bei der präklinischen Arzneimittelentwicklung auf Gewebescheiben.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Protokoll zeigen wir eine Plattform für quantitative und Echtzeit-Arzneimittelwirksamkeitsstudien an organotypischen Tumorgewebescheiben. Das Gewebescheibenkultursystem bietet deutliche Vorteile gegenüber herkömmlichen zellbasierten In-vitro-Methoden, indem es die Zellheterogenität und die physiologischen Eigenschaften der nativen Tumormikroumgebung erfasst. Diese Plattform ermöglicht auch einen höheren Durchsatz für Arzneimittelwirksamkeitstests und hilft dabei, die Lücke zwischen Zellkulturstudien und…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom NIH/NCI [K22CA201229, P30CA015704] und der Sidney Kimmel Foundation [Kimmel Scholar Award], Lung Cancer Discovery Award (LCD-505536) unterstützt. Wir danken Dr. Alana Welm (University of Utah) für die Bereitstellung des Brustkrebs-PDX-Tumors. Wir danken auch den Mitarbeitern von Comparative Medicine, Fred Hutchinson Cancer Research Center (FHCRC) für die Wartung des PDX-Modells und den Mitgliedern des Gujral-Labors für hilfreiche Diskussionen. N.N.A wird vom JSPS Overseas Research Fellowship und Dem Interdisciplinary Training Grant des FHCRC unterstützt. A.J.B. wird vom Chromosom Metabolism and Cancer Training Grant des FHCRC unterstützt.
Materials
| 10 cm dish | Corning | 430293 | |
| 24-well dish | CytoOne | CC7682-7524 | |
| 4T1 | ATCC | CRL-2539 | |
| 6 mm diameter Biopsy punch | Integra Miltex | 33-36 | |
| 6-well plate | CytoOne | CC7682-7506 | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A8960-5g | For TSC medium |
| Belzer UW cold storage solcution (UW solution) | Bridge to Life | 500 mL | |
| Corning Matrigel Membrane Mix | Fisher scientific | 356234 | |
| DMSO | Corning | MT-25950CQC | |
| Double Edge Stainless Steel Cutting Blades | TED PELLA | 121-6 | For slicing |
| Doxorubicin (hydrochloride) | Cayman Chemical | 15007 | |
| FBS | Gibco | 26140-079 | |
| Fine tip forceps | ROBOZ | RS-4974 | |
| Fine tip forceps | ROBOZ | RS-4976 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767-500g | For TSC medium |
| HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red | Gibco | 14-175-103 | |
| HCI010 | Dr. Alana Welm, University of Utah | Breast cancer PDX | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15630080 | For TSC medium |
| ITS + Premix | Fisher Scientific | 354352 | For TSC medium |
| IVIS Spectrum | PerkinElmer | 124262 | |
| Leica VT1200S Vibratome | Leica | VT1200S | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030164 | For TSC medium |
| Millicell Cell Culture Insert, 12 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Millipore | PICM01250 | |
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Millipore | PICM03050 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-500g | For TSC medium |
| PELCO Pro CA44 Tissue Adhesive | TED PELLA | 10033 | Glue |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 15140163 | For TSC medium |
| RealTime-Glo MT Cell Viability Assay | Promega | G9711 | |
| Recombinant Mouse EGF | BioLegend | 585608 | For TSC medium |
| RPMI1640 | Gibco | 11875135 | |
| Single Edge Industrial Razor Blades | VWR | 55411-050 | For removing glued tissues |
| Sodium Bicarbonate | Corning | 25-035-CI | For TSC medium |
| Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | BW13115E | For TSC medium |
| Staurosporine | Santa Cruz Biotechnology | sc-3510A | |
| Synergy H4 | BioTek | ||
| Tooothed forceps | ROBOZ | RS-5155 | |
| Transfer pipettes | Fisher scientific | 13-711-7M | Wide tip |
| Transfer pipettes | Samco Scientific | 235 | Fine tip |
| William's medium E, no glutamine | ThermoFisher Scientific | 12551032 | For TSC medium |
References
- Klemm, F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of therapeutic response in cancer. Trends in Cell Biology. 25 (4), 198-213 (2015).
- Horvath, P., et al. Screening out irrelevant cell-based models of disease. Nature Reviews: Drug Discovery. 15 (11), 751-769 (2016).
- Seruga, B., Ocana, A., Amir, E., Tannock, I. F. Failures in Phase III: Causes and Consequences. Clinical Cancer Research. 21 (20), 4552-4560 (2015).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Nishida-Aoki, N., Gujral, T. S. Emerging approaches to study cell-cell interactions in tumor microenvironment. Oncotarget. 10 (7), 785-797 (2019).
- van der Kuip, H., et al. Short term culture of breast cancer tissues to study the activity of the anticancer drug taxol in an intact tumor environment. BMC Cancer. 6, 86 (2006).
- Nagaraj, A. S., et al. Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing. Journal of Visualized Experiments. (141), e58569 (2018).
- Naipal, K. A., et al. Tumor slice culture system to assess drug response of primary breast cancer. BMC Cancer. 16, 78 (2016).
- Jiang, X., et al. Long-lived pancreatic ductal adenocarcinoma slice cultures enable precise study of the immune microenvironment. Oncoimmunology. 6 (7), 1333210 (2017).
- Sivakumar, R., et al. Organotypic tumor slice cultures provide a versatile platform for immuno-oncology and drug discovery. Oncoimmunology. 8 (12), 1670019 (2019).
- Duellman, S. J., et al. Real-Time Cell Viability Assay and Use in Inhibitor Screening. Assay and Drug Development Technologies. 13 (8), 456-465 (2015).
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17 (11), 1514-1520 (2011).
- Lazaro, C. A., et al. Establishment, characterization, and long-term maintenance of cultures of human fetal hepatocytes. Hepatology. 38 (5), 1095-1106 (2003).
- Chadwick, E. J., et al. A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies. Journal of Visualized Experiments. (105), e53304 (2015).
- Parker, J. J., Lizarraga, M., Waziri, A., Foshay, K. M. A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs. Journal of Visualized Experiments. (105), e53304 (2017).
