Измерение в режиме реального времени ответ на наркотики в органотипической опухоли ткани фрагменты
Summary
Мы вводим протокол для измерения реакции препарата в режиме реального времени на органотипические кусочки опухолевой ткани. Экспериментальная стратегия, изложенная здесь, обеспечивает платформу для проведения средне-высокой пропускной связи наркотиков экраны на ткани ломтиками, полученных из клинических или опухолей мыши в условиях ex vivo.
Abstract
Опухолевые ткани состоят из раковых клеток, проникших иммунных клеток, эндотелиальных клеток, фибробластов и внеклеточной матрицы. Эта сложная среда представляет собой микросреду опухоли (TME) и может модулировать ответ на терапию in vivo или ответ на наркотики ex vivo. Обычные экраны обнаружения рака наркотиков проводятся на клетках, культивированных в монослой, система критически не хватает влияния TME. Таким образом, экспериментальные системы, которые интегрируют чувствительные и высокопроизводительные анализы с физиологическим TME, укрепят процесс доклинического открытия препарата. Здесь мы представляем культуру срезов опухолевой ткани ex vivo в качестве платформы для скрининга лекарств со средней высокой пропускной прикладом. Органотипическая культура среза тканей представляет собой точно вырезанные, тонкие опухолевые секции, которые поддерживаются при поддержке пористой мембраны в жидко-воздушном интерфейсе. В этом протоколе мы описываем подготовку и поддержание фрагментов тканей, подготовленных из опухолей и опухолей мыши из моделей ксенотранспланта (PDX), полученных пациентом. Для оценки изменений жизнеспособности тканей в ответ на медикаментозное лечение мы использовали биосовместимый анализ жизнеспособности на основе люминесценции, который позволяет в режиме реального времени, быстро и чувствительно измерять жизнеспособные клетки в тканях. Используя эту платформу, мы оценивали доза-зависимые реакции ломтиков тканей на ингибитор мультикиназы, стауроспорина и цитотоксического агента, доксорубицин. Кроме того, мы демонстрируем применение тканевых ломтиков для фармакологии ex vivo путем скрининга 17 клинических и доклинических препаратов на фрагментах тканей, подготовленных из одной опухоли PDX. Наша физиологически-релевантная, высокочувствительная и надежная платформа скрининга ex vivo значительно укрепит доклиническую онкологическую информацию и принятие решений по лечению.
Introduction
Взаимодействие раковых клеток с физическими и биохимическими свойствами окружающей стромальной ткани образует TME. TME может стимулировать рост опухоли, метастаз, и модулировать реакцию опухоли на терапию1. В обычных доклинических развития наркотиков, кандидаты наркотиков, как правило, первый скрининг с использованием культивированных линий раковых клеток, асссеа платформы, которая критически не хватает TME2. Это отсутствие физиологических TME в клеточных стадиях предварительного скрининга может ограничить открытие эффективных агентов в опухолевых животных моделей и может способствовать высокой скорости истощения многих перспективных онкологических препаратов на более поздних клинических стадиях развития3.
Несмотря на важность TME в модуляции реакций опухолевых препаратов, экспериментальные ограничения ограничивают применение более физиологически значимых систем на ранних стадиях открытия и разработки лекарственных средств. Непрактично проверять сотни терапевтических агентов на опухоли от животных моделей или образцов опухолей пациента. Действительно, хирургические образцы являются скудными ресурсами с разнообразным генетическим фоном, и скрининг тысяч молекул-кандидатов в моделях животных невозможен из-за экспериментального масштаба, стоимости и благополучия животных.
Опухоль ткани ломтик культуры, где точно вырезать, тонкие секции опухоли культивируются ex vivo, может решить ограничение физиологических TME в анализы скрининга наркотиков. Исторически сложилось так, что область неврологии впервые и сделал обширную оптимизацию среза культуры для ткани мозга4. В последнее время многие исследования продемонстрировали подготовку ломтиков из различных типов опухолевых тканей, включая клеточные опухоли, спонтанные модели опухолей, ксенотрансплантаты пациента (PDX) и первичные опухоли пациента. Культура среза тканей Ex vivo интегрирует преимущества как in vivo, так и in vitro culture5. Опухолевые срезы ткани сохраняют нетронутую архитектуру тканей и пестрый состав клеток, что позволяет изучать раковые клетки в контексте TME.
Этот протокол вводит органотипическую систему культуры срезов опухолевых тканей в сочетании с анализом жизнеспособности в реальном времени для оценки реакции препарата. Тесты на эффективность препарата на ломтиках орханотипической опухолевой ткани в ранее введенных протоколах опираются на измерение изменений жизнеспособности клеток путем включения флуоресцентного красителя, иммуногистохимии (IHC), или MTT (((3- No 4, 5-диметилтиазол-2-yl-2, 5 дифенилов тетразолиум),7,8,9асса6 Тем не менее, все эти методы являются анализом конечной точки и страдают от низкой чувствительности, длительного времени обработки, сложного анализа данных, узкого диапазона сигналов и высокой экспериментальной ошибки. Наш люминесценция на основе живых клеток совместимый реагент улучшает эти анализы, обеспечивая широкий диапазон сигналов и мгновенное (5 мин) измерения без предварительной обработки и минимальной после обработки. Этот реагент очень чувствителен и может сосуществовать в среде клеточной культуры, что позволяет непрерывнои и время курса измерения жизнеспособности клеток. Эта система асссировки применима к высокопроходимым скринингам кандидатов на ткани на срезах тканей при доклинической разработке лекарств.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом протоколе мы демонстрируем платформу для количественных и в режиме реального времени исследований эффективности лекарств на органотипических фрагментах опухолевых тканей. Система культуры срезов тканей обеспечивает явные преимущества по сравнению с традиционными клеточным?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана NIH/NCI (K22CA201229, P30CA015704) и Фондом Сидни Киммеля «Киммел» (Kimmel Scholar Award), премией открытия рака легких (LCD-505536). Мы хотели бы поблагодарить доктора Алану Уэлм (Университет штата юта) за предоставление опухоли рака молочной железы PDX. Мы также хотели бы поблагодарить сотрудников сравнительной медицины, Фред Хатчинсон онкологический научный центр (FHCRC) для поддержания модели PDX и членов лаборатории Gujral для полезных дискуссий. N.N.A поддерживается стипендией JSPS по зарубежным исследованиям и междисциплинарной подготовке грантов FHCRC. A.J.B. поддерживается Хромосомы Метаболизм и Рак Обучение Грант от FHCRC.
Materials
| 10 cm dish | Corning | 430293 | |
| 24-well dish | CytoOne | CC7682-7524 | |
| 4T1 | ATCC | CRL-2539 | |
| 6 mm diameter Biopsy punch | Integra Miltex | 33-36 | |
| 6-well plate | CytoOne | CC7682-7506 | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A8960-5g | For TSC medium |
| Belzer UW cold storage solcution (UW solution) | Bridge to Life | 500 mL | |
| Corning Matrigel Membrane Mix | Fisher scientific | 356234 | |
| DMSO | Corning | MT-25950CQC | |
| Double Edge Stainless Steel Cutting Blades | TED PELLA | 121-6 | For slicing |
| Doxorubicin (hydrochloride) | Cayman Chemical | 15007 | |
| FBS | Gibco | 26140-079 | |
| Fine tip forceps | ROBOZ | RS-4974 | |
| Fine tip forceps | ROBOZ | RS-4976 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767-500g | For TSC medium |
| HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red | Gibco | 14-175-103 | |
| HCI010 | Dr. Alana Welm, University of Utah | Breast cancer PDX | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15630080 | For TSC medium |
| ITS + Premix | Fisher Scientific | 354352 | For TSC medium |
| IVIS Spectrum | PerkinElmer | 124262 | |
| Leica VT1200S Vibratome | Leica | VT1200S | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030164 | For TSC medium |
| Millicell Cell Culture Insert, 12 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Millipore | PICM01250 | |
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Millipore | PICM03050 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-500g | For TSC medium |
| PELCO Pro CA44 Tissue Adhesive | TED PELLA | 10033 | Glue |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 15140163 | For TSC medium |
| RealTime-Glo MT Cell Viability Assay | Promega | G9711 | |
| Recombinant Mouse EGF | BioLegend | 585608 | For TSC medium |
| RPMI1640 | Gibco | 11875135 | |
| Single Edge Industrial Razor Blades | VWR | 55411-050 | For removing glued tissues |
| Sodium Bicarbonate | Corning | 25-035-CI | For TSC medium |
| Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | BW13115E | For TSC medium |
| Staurosporine | Santa Cruz Biotechnology | sc-3510A | |
| Synergy H4 | BioTek | ||
| Tooothed forceps | ROBOZ | RS-5155 | |
| Transfer pipettes | Fisher scientific | 13-711-7M | Wide tip |
| Transfer pipettes | Samco Scientific | 235 | Fine tip |
| William's medium E, no glutamine | ThermoFisher Scientific | 12551032 | For TSC medium |
References
- Klemm, F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of therapeutic response in cancer. Trends in Cell Biology. 25 (4), 198-213 (2015).
- Horvath, P., et al. Screening out irrelevant cell-based models of disease. Nature Reviews: Drug Discovery. 15 (11), 751-769 (2016).
- Seruga, B., Ocana, A., Amir, E., Tannock, I. F. Failures in Phase III: Causes and Consequences. Clinical Cancer Research. 21 (20), 4552-4560 (2015).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Nishida-Aoki, N., Gujral, T. S. Emerging approaches to study cell-cell interactions in tumor microenvironment. Oncotarget. 10 (7), 785-797 (2019).
- van der Kuip, H., et al. Short term culture of breast cancer tissues to study the activity of the anticancer drug taxol in an intact tumor environment. BMC Cancer. 6, 86 (2006).
- Nagaraj, A. S., et al. Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing. Journal of Visualized Experiments. (141), e58569 (2018).
- Naipal, K. A., et al. Tumor slice culture system to assess drug response of primary breast cancer. BMC Cancer. 16, 78 (2016).
- Jiang, X., et al. Long-lived pancreatic ductal adenocarcinoma slice cultures enable precise study of the immune microenvironment. Oncoimmunology. 6 (7), 1333210 (2017).
- Sivakumar, R., et al. Organotypic tumor slice cultures provide a versatile platform for immuno-oncology and drug discovery. Oncoimmunology. 8 (12), 1670019 (2019).
- Duellman, S. J., et al. Real-Time Cell Viability Assay and Use in Inhibitor Screening. Assay and Drug Development Technologies. 13 (8), 456-465 (2015).
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17 (11), 1514-1520 (2011).
- Lazaro, C. A., et al. Establishment, characterization, and long-term maintenance of cultures of human fetal hepatocytes. Hepatology. 38 (5), 1095-1106 (2003).
- Chadwick, E. J., et al. A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies. Journal of Visualized Experiments. (105), e53304 (2015).
- Parker, J. J., Lizarraga, M., Waziri, A., Foshay, K. M. A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs. Journal of Visualized Experiments. (105), e53304 (2017).
