組織性腫瘍組織スライスにおけるリアルタイム薬物応答の測定
Summary
我々は、組織性腫瘍組織スライスにおけるリアルタイム薬物応答を測定するためのプロトコルを導入する。ここで概説する実験戦略は、ex vivo条件下で臨床またはマウス腫瘍に由来する組織スライス上で中高スループットの薬物スクリーンを実施するためのプラットフォームを提供する。
Abstract
腫瘍組織は、癌細胞、浸潤免疫細胞、内皮細胞、線維芽細胞、および細胞外マトリックスから構成される。この複雑なミリューは、腫瘍微小環境(TME)を構成し、インビボまたは薬物応答ex vivoでの治療に対する応答を調節することができる。従来のがん創薬スクリーンは、単層で培養された細胞に対して行われ、TMEの影響を極めて欠けるシステムである。したがって、高感度かつハイスループットなアッセイを生理学的TMEと統合する実験システムは、前臨床創薬プロセスを強化する。ここでは、中高スループットの薬物スクリーニングのプラットフォームとして、エキビボ腫瘍組織スライス培養を紹介する。オルガノミピック組織スライス培養は、液体空気界面で多孔質膜の支持を得て維持される、正確に切断された薄い腫瘍切片を構成する。本プロトコルでは、患者由来異種移植片(PDX)モデルからマウス腫瘍および腫瘍から調製された組織スライスの調製および維持について説明する。薬物治療に応答して組織生存率の変化を評価するために、我々は生体適合性の発光ベースの生存率アッセイを活用し、組織中の生存細胞のリアルタイム、迅速かつ敏感な測定を可能にした。このプラットフォームを用いて、マルチキナーゼ阻害剤、スタウロスポリン、および細胞傷害剤であるドキソルビシンに対する組織スライスの用量依存応答を評価した。また、単一PDX腫瘍から調製した組織スライスに対して17の臨床および前臨床薬をスクリーニングすることにより、エキビボ薬理学用の組織スライスの適用を実証する。生理学的に関連性が高く、高感度で堅牢なex vivoスクリーニングプラットフォームは、前臨床腫瘍学の創薬と治療の意思決定を大幅に強化します。
Introduction
癌細胞は、周囲の間質組織の物理的および生化学的特性との相互作用がTMEを形成する。TMEは、腫瘍の増殖、転移、および治療1に対する腫瘍応答を調節することを刺激することができる。従来の前臨床薬開発では、薬剤候補は、典型的には、培養癌細胞株を用いて最初にスクリーニングされる、TME2を極度2に欠けているアッセイプラットフォームである。細胞ベースの事前スクリーニング段階における生理学的TMEの欠如は、腫瘍を持つ動物モデルにおける有効な薬剤の発見を制限し、開発の後期臨床段階で多くの有望な腫瘍学的薬剤の高い消耗率に寄与し得る3。
腫瘍薬物反応を調節する上でTMEの重要性にもかかわらず、実験的制約は、創薬および開発の初期段階におけるより生理学的に関連するシステムの適用を制限する。動物モデルまたは患者の腫瘍標本から腫瘍に対して何百もの治療薬をスクリーニングすることは現実的ではない。確かに、外科標本は様々な遺伝的背景を持つ希少な資源であり、動物モデルにおける何千もの候補分子をスクリーニングすることは、実験的規模、コスト、および動物福祉のために実現不可能である。
腫瘍組織スライス培養は、正確に切断され、薄い腫瘍切片がex vivoで培養され、薬物スクリーニングアッセイにおける生理学的TMEの限界に対処することができる。歴史的に、神経科学の分野は、脳組織4のためのスライス培養の開拓および広範な最適化を行った。近年、多くの研究は、細胞株由来腫瘍、自発的腫瘍モデル、患者由来の異種移植片(PDX)、および原発性患者腫瘍を含む様々なタイプの腫瘍組織からのスライスの調製を実証している。エクスビボ組織スライス培養は、生体内およびインビトロ培養5の両方から利益を統合する。腫瘍組織スライスは、無傷の組織アーキテクチャと可変細胞組成を保持し、TMEコンテキスト内の癌細胞の研究を可能にする。
このプロトコルは、薬物応答を評価するために、リアルタイムで高感度な生存アッセイと組み合わせたorganotypic腫瘍組織スライス培養システムを導入する。以前に導入されたプロトコルにおけるorganotypic型腫瘍組織スライスの薬物有効性試験は、蛍光色素の組み込み、免疫組織化学(IHC)、またはMTT((3-[4,5-ジメチルチアゾール-2-2]-2,5ジフェニルテトラゾリウム臭化物)アッセイ6,7,6,7,8,9による細胞生存率の変化を測定することに依存している。8,9しかし、これらの方法はすべてエンドポイントアッセイであり、低感度、長い処理時間、複雑なデータ分析、狭い信号範囲、および高い実験誤差に苦しんでいます。当社の発光ベースの生細胞適合試薬は、事前処理と最小限の後処理なしで広い信号範囲と瞬時(〜5分)の測定を提供することにより、これらのアッセイを改善します。この試薬は高感度で、細胞培養培地に共存できるため、細胞生存率の連続的かつタイムコース測定が可能です。このアッセイシステムは、前臨床薬物開発における組織スライス上の薬剤候補のハイスループットスクリーニングに適用可能である。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルでは、organotypic腫瘍組織スライスに関する定量的かつリアルタイムの薬物有効性研究のためのプラットフォームを実証する。組織スライス培養システムは、天然腫瘍微小環境の細胞異質性および生理学的特徴を捕捉することにより、従来の細胞ベースのin vitro法よりも明確な利点を提供する。このプラットフォームは、薬物有効性試験のスループットを高め、細胞培養研究と生…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、NIH/NCI[K22CA201229、P30CA015704]、シドニー・キンメル財団[キンメル・スカラー賞]、肺癌発見賞(LCD-505536)によって支えられました。乳がんPDX腫瘍を提供してくれたアラナ・ウェルム博士(ユタ大学)に感謝します。また、比較医学、フレッド・ハッチンソンがん研究センター(FHCRC)のスタッフ、PDXモデルのメンテナンス、グジュラルラボのメンバーの皆様に有益な議論をいただきたいです。N.N.Aは、FHCRCのJSPS海外研究フェローシップと学際的トレーニング助成金の支援を受けています。A.J.B.は、FHCRCの染色体代謝および癌トレーニング助成金によって支えられています。
Materials
| 10 cm dish | Corning | 430293 | |
| 24-well dish | CytoOne | CC7682-7524 | |
| 4T1 | ATCC | CRL-2539 | |
| 6 mm diameter Biopsy punch | Integra Miltex | 33-36 | |
| 6-well plate | CytoOne | CC7682-7506 | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A8960-5g | For TSC medium |
| Belzer UW cold storage solcution (UW solution) | Bridge to Life | 500 mL | |
| Corning Matrigel Membrane Mix | Fisher scientific | 356234 | |
| DMSO | Corning | MT-25950CQC | |
| Double Edge Stainless Steel Cutting Blades | TED PELLA | 121-6 | For slicing |
| Doxorubicin (hydrochloride) | Cayman Chemical | 15007 | |
| FBS | Gibco | 26140-079 | |
| Fine tip forceps | ROBOZ | RS-4974 | |
| Fine tip forceps | ROBOZ | RS-4976 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767-500g | For TSC medium |
| HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red | Gibco | 14-175-103 | |
| HCI010 | Dr. Alana Welm, University of Utah | Breast cancer PDX | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15630080 | For TSC medium |
| ITS + Premix | Fisher Scientific | 354352 | For TSC medium |
| IVIS Spectrum | PerkinElmer | 124262 | |
| Leica VT1200S Vibratome | Leica | VT1200S | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030164 | For TSC medium |
| Millicell Cell Culture Insert, 12 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Millipore | PICM01250 | |
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Millipore | PICM03050 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-500g | For TSC medium |
| PELCO Pro CA44 Tissue Adhesive | TED PELLA | 10033 | Glue |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 15140163 | For TSC medium |
| RealTime-Glo MT Cell Viability Assay | Promega | G9711 | |
| Recombinant Mouse EGF | BioLegend | 585608 | For TSC medium |
| RPMI1640 | Gibco | 11875135 | |
| Single Edge Industrial Razor Blades | VWR | 55411-050 | For removing glued tissues |
| Sodium Bicarbonate | Corning | 25-035-CI | For TSC medium |
| Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | BW13115E | For TSC medium |
| Staurosporine | Santa Cruz Biotechnology | sc-3510A | |
| Synergy H4 | BioTek | ||
| Tooothed forceps | ROBOZ | RS-5155 | |
| Transfer pipettes | Fisher scientific | 13-711-7M | Wide tip |
| Transfer pipettes | Samco Scientific | 235 | Fine tip |
| William's medium E, no glutamine | ThermoFisher Scientific | 12551032 | For TSC medium |
References
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