Mätning i realtid läkemedelsrespons i organotypiska tumörvävnad skivor
Summary
Vi inför ett protokoll för att mäta realtid läkemedelsrespons i organotypiska tumör vävnad skivor. Den experimentella strategi som beskrivs här ger en plattform för att utföra medelhög genomströmning läkemedelsskärmar på vävnadsskivor som härrör från kliniska eller mustumörer i ex vivo villkor.
Abstract
Tumör vävnader består av cancerceller, infiltrerade immunceller, endotelceller, fibroblaster och extracellulära matris. Denna komplexa miljö utgör tumör mikromiljö (TME) och kan modulera svar på terapi in vivo eller läkemedelsrespons ex vivo. Konventionella cancerläkemedel upptäckt skärmar utförs på celler odlade i en monolayer, ett system som kritiskt saknar påverkan av TME. Således kommer experimentella system som integrerar känsliga och hög genomströmningsanalyser med fysiologiska TME att stärka den prekliniska läkemedelsupptäcktsprocessen. Här introducerar vi ex vivo tumör vävnad skiva kultur som en plattform för medium-high-throughput drog screening. Organotypic vävnad skiva kultur utgör exakt skuren, tunn tumör sektioner som underhålls med stöd av ett poröst membran i en flytande luft gränssnitt. I detta protokoll beskriver vi beredning och underhåll av vävnad skivor beredd från mus tumörer och tumörer från patient-härledda xenograft (PDX) modeller. För att bedöma förändringar i vävnadskraften som svar på läkemedelsbehandling, utnyttjade vi en biokompatibel luminescensbaserad lönsamhetsanalys som möjliggör realtid, snabb och känslig mätning av livskraftiga celler i vävnaden. Med hjälp av denna plattform utvärderade vi dosberoende svar av vävnadsskivor till multikinashämmare, staurosporin och cytotoxiskt medel, doxorubicin. Vidare visar vi tillämpningen av vävnad skivor för ex vivo farmakologi genom screening 17 kliniska och prekliniska läkemedel på vävnad skivor beredd från en enda PDX tumör. Vår fysiologiskt relevanta, mycket känsliga och robusta ex vivo screening plattform kommer att kraftigt stärka preklinisk onkologi läkemedelsupptäckt och behandling beslutsfattande.
Introduction
Cancer cell interaktioner med de fysiska och biokemiska egenskaperna hos den omgivande stromal vävnaden bildar TME. TME kan stimulera tumörtillväxt, metastasering och modulera tumörsvar på terapi1. I konventionella prekliniska läkemedelsutveckling, läkemedelskandidater är vanligtvis först screenas med odlade cancer cellinjer, en analys plattform som kritiskt saknar TME2. Denna brist på fysiologiska TME i cellbaserade prescreening stadier kan begränsa upptäckten av effektiva medel i tumörbärande djurmodeller och kan bidra till den höga avgångsfrekvensen för många lovande onkologi läkemedel i senare kliniska stadier av utveckling3.
Trots vikten av TME i modulerande tumör läkemedelssvar, experimentella begränsningar begränsa tillämpningen av mer fysiologiskt relevanta system under de tidiga stadierna av läkemedelsupptäckt och utveckling. Det är opraktiskt att screena hundratals terapeutiska medel på tumörer från djurmodeller eller patienttumörprover. Faktum är att kirurgiska exemplar är knappa resurser med varierande genetisk bakgrund och screening tusentals kandidatmolekyler i djurmodeller är inte möjligt på grund av experimentell skala, kostnader och djurskydd.
Tumör vävnad skiva kultur, där exakt skära, tunna tumör sektioner odlas ex vivo, kan ta itu med begränsningen av fysiologiska TME i läkemedelsscreening analyser. Historiskt sett har neurovetenskapen banat väg för och gjort omfattande optimeringar av skiva kultur för hjärnvävnad4. Nyligen har många studier visat beredning av skivor från olika typer av tumör vävnad inklusive cell linje-härledda tumörer, spontana tumör modeller, patient-härledda xenografts (PDX), och primära patient tumörer. Ex vivo vävnad skiva kultur integrerar fördelar från både in vivo och in vitro kultur5. Tumör vävnad skivor behålla intakt vävnad arkitektur och brokiga cellsammansättning, möjliggör studier av cancerceller inom TME sammanhang.
Detta protokoll introducerar en organotypic tumör vävnad segment kultur system i kombination med en realtid, mycket känslig lönsamhet analys för att utvärdera läkemedelssvar. Drug effekt tester på organotypic tumör vävnad skivor i tidigare införda protokoll förlitar sig på att mäta förändringar i cellens livskraft genom fluorescerande färgämne införlivande, immunohistochemistry (IHC), eller MTT ((3- [4, 5-dimetylthiazol-2-yl]-2, 5 difenyl tetrazolium bromid) analys6,,7,8,9. Alla dessa metoder är dock slutpunktsanalyser och lider av låg känslighet, lång bearbetningstid, komplexa dataanalyser, smalt signalområde och högt experimentellt fel. Vår luminescens-baserade levande cell-kompatibla reagens förbättrar dessa analyser genom att tillhandahålla ett brett signalområde och momentana (~ 5 min) mätning utan föregående bearbetning och minimal efterbehandling. Detta reagens är mycket känslig och kan samexistera i cellkulturmedia, vilket möjliggör kontinuerlig och tidsförloppsmätning av cellens livskraft. Detta analyssystem är tillämpligt på hög genomströmning screening av läkemedelskandidater på vävnad skivor i prekliniska läkemedelsutveckling.
Protocol
Representative Results
Discussion
I detta protokoll visar vi en plattform för kvantitativa och realtid läkemedelseffekt studier på organotypic tumör vävnad skivor. Vävnaden segmentet kultursystemet ger tydliga fördelar jämfört med traditionella cellbaserade in vitro-metoder genom att fånga cell heterogenitet och fysiologiska egenskaper hos den inhemska tumörmikromiljön. Denna plattform möjliggör också högre genomströmning för läkemedelseffektivitetstester, vilket bidrar till att överbrygga klyftan mellan cellodlingsstudier och in vivo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av NIH/NCI [K22CA201229, P30CA015704] och Sidney Kimmel Foundation [Kimmel Scholar Award], Lung Cancer Discovery Award (LCD-505536). Vi vill tacka Dr Alana Welm (University of Utah) för att tillhandahålla bröstcancer PDX tumör. Vi vill också tacka personalen på Comparative Medicine, Fred Hutchinson Cancer Research Center (FHCRC) för underhåll av PDX-modellen och medlemmar av Gujral labbet för hjälpsamma diskussioner. N.N.A stöds av JSPS Overseas Research Fellowship and Interdisciplinary Training Grant från FHCRC. A.J.B. stöds av Chromosome Metabolism and Cancer Training Grant från FHCRC.
Materials
| 10 cm dish | Corning | 430293 | |
| 24-well dish | CytoOne | CC7682-7524 | |
| 4T1 | ATCC | CRL-2539 | |
| 6 mm diameter Biopsy punch | Integra Miltex | 33-36 | |
| 6-well plate | CytoOne | CC7682-7506 | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A8960-5g | For TSC medium |
| Belzer UW cold storage solcution (UW solution) | Bridge to Life | 500 mL | |
| Corning Matrigel Membrane Mix | Fisher scientific | 356234 | |
| DMSO | Corning | MT-25950CQC | |
| Double Edge Stainless Steel Cutting Blades | TED PELLA | 121-6 | For slicing |
| Doxorubicin (hydrochloride) | Cayman Chemical | 15007 | |
| FBS | Gibco | 26140-079 | |
| Fine tip forceps | ROBOZ | RS-4974 | |
| Fine tip forceps | ROBOZ | RS-4976 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767-500g | For TSC medium |
| HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red | Gibco | 14-175-103 | |
| HCI010 | Dr. Alana Welm, University of Utah | Breast cancer PDX | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15630080 | For TSC medium |
| ITS + Premix | Fisher Scientific | 354352 | For TSC medium |
| IVIS Spectrum | PerkinElmer | 124262 | |
| Leica VT1200S Vibratome | Leica | VT1200S | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030164 | For TSC medium |
| Millicell Cell Culture Insert, 12 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Millipore | PICM01250 | |
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Millipore | PICM03050 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-500g | For TSC medium |
| PELCO Pro CA44 Tissue Adhesive | TED PELLA | 10033 | Glue |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 15140163 | For TSC medium |
| RealTime-Glo MT Cell Viability Assay | Promega | G9711 | |
| Recombinant Mouse EGF | BioLegend | 585608 | For TSC medium |
| RPMI1640 | Gibco | 11875135 | |
| Single Edge Industrial Razor Blades | VWR | 55411-050 | For removing glued tissues |
| Sodium Bicarbonate | Corning | 25-035-CI | For TSC medium |
| Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | BW13115E | For TSC medium |
| Staurosporine | Santa Cruz Biotechnology | sc-3510A | |
| Synergy H4 | BioTek | ||
| Tooothed forceps | ROBOZ | RS-5155 | |
| Transfer pipettes | Fisher scientific | 13-711-7M | Wide tip |
| Transfer pipettes | Samco Scientific | 235 | Fine tip |
| William's medium E, no glutamine | ThermoFisher Scientific | 12551032 | For TSC medium |
References
- Klemm, F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of therapeutic response in cancer. Trends in Cell Biology. 25 (4), 198-213 (2015).
- Horvath, P., et al. Screening out irrelevant cell-based models of disease. Nature Reviews: Drug Discovery. 15 (11), 751-769 (2016).
- Seruga, B., Ocana, A., Amir, E., Tannock, I. F. Failures in Phase III: Causes and Consequences. Clinical Cancer Research. 21 (20), 4552-4560 (2015).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Nishida-Aoki, N., Gujral, T. S. Emerging approaches to study cell-cell interactions in tumor microenvironment. Oncotarget. 10 (7), 785-797 (2019).
- van der Kuip, H., et al. Short term culture of breast cancer tissues to study the activity of the anticancer drug taxol in an intact tumor environment. BMC Cancer. 6, 86 (2006).
- Nagaraj, A. S., et al. Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing. Journal of Visualized Experiments. (141), e58569 (2018).
- Naipal, K. A., et al. Tumor slice culture system to assess drug response of primary breast cancer. BMC Cancer. 16, 78 (2016).
- Jiang, X., et al. Long-lived pancreatic ductal adenocarcinoma slice cultures enable precise study of the immune microenvironment. Oncoimmunology. 6 (7), 1333210 (2017).
- Sivakumar, R., et al. Organotypic tumor slice cultures provide a versatile platform for immuno-oncology and drug discovery. Oncoimmunology. 8 (12), 1670019 (2019).
- Duellman, S. J., et al. Real-Time Cell Viability Assay and Use in Inhibitor Screening. Assay and Drug Development Technologies. 13 (8), 456-465 (2015).
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17 (11), 1514-1520 (2011).
- Lazaro, C. A., et al. Establishment, characterization, and long-term maintenance of cultures of human fetal hepatocytes. Hepatology. 38 (5), 1095-1106 (2003).
- Chadwick, E. J., et al. A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies. Journal of Visualized Experiments. (105), e53304 (2015).
- Parker, J. J., Lizarraga, M., Waziri, A., Foshay, K. M. A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs. Journal of Visualized Experiments. (105), e53304 (2017).
