في النموذج الفيترو من الإنسان التشعب التشعبي تندب باستخدام الزحام الجزيئي الكلي
Summary
يصف هذا البروتوكول استخدام الزحام الجزيئي الكلي لإنشاء نموذج ندبة تضخمية في المختبر يشبه في ظروف الجسم الحي. عندما تزرع في بيئة جزيئات ية كبيرة مزدحمة، الخلايا الليفية الجلد الإنسان عرض الأنماط الظاهرية، والكيمياء الحيوية، وعلم وظائف الأعضاء، وخصائص وظيفية تشبه ندبا.
Abstract
وقد ثبت أن في أنسجة الجسم الحي مزدحمة للغاية من البروتينات والأحماض النووية، والبروتينات الريبونوكليو، السكريات، الخ. البروتوكول التالي يطبق تقنية الزحام الجزيئي الكلي (MMC) لمحاكاة هذا الازدحام الفسيولوجي من خلال إضافة البوليمرات المحايدة (الزاحمة) إلى ثقافات الخلايا في المختبر. الدراسات السابقة باستخدام Ficoll أو dextran كما crowders تثبت أن التعبير عن الكولاجين الأول وfibronectin في خطوط الخلايا WI38 و WS-1 يتم تعزيزها بشكل كبير باستخدام تقنية MMC. ومع ذلك، لم يتم التحقق من صحة هذه التقنية في الخلايا الليفية البشرية المشتقة من الندبة الأولية المشتقة من الندبة (hHSFs). كما تندب تضخم ينشأ من الترسب المفرط للكولاجين, يهدف هذا البروتوكول إلى بناء الكولاجين الغنية في نموذج ندبة فرط الترو عن طريق تطبيق تقنية MMC مع hHSFs. وقد ثبت هذا النموذج الأمثل MMC لامتلاك المزيد من أوجه التشابه مع في ندبا في الجسم الحي مقارنة مع التقليدية 2 الأبعاد (2-D) أنظمة زراعة الخلايا. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه فعال من حيث التكلفة، وموفر للوقت، ومرغوب فيه أخلاقيا ً مقارنة بالنماذج الحيوانية. ولذلك, النموذج الأمثل ذكرت هنا يقدم متقدمة “في الجسم الحي مثل” نموذج للدراسات ذات الصلة ندبة تضخم.
Introduction
الأنسجة ندبة يمثل نقطة النهاية لإصلاح الأنسجة. ومع ذلك ، في العديد من الأفراد ، وخاصة أولئك الذين يعانون من حروق أو صدمة1، يمكن أن تكون الندوب مفرطة وتفرض آثارًا غير مرغوب فيها على مورفولوجيا وعمل الجلد الشفاء. على الرغم من أن الآليات الدقيقة للإصابة المرضية (الندوب الضخامية والقناق) هي تشكيل ندبة غير مفهومة تماما، وقد ثبت ترسب مفرط من الكولاجين أثناء التئام الجروح لتكون مساهمة أساسية2.
ومن الثابت أن تحويل عامل النمو بيتا 1 (TGF-α1) وألفا العضلات الملساء actin (αSMA) تلعب أدوارا رئيسية في تشكيل ندوب تضخمي. تشير الأدلة إلى أن ارتفاع TGF-α1 يحفز مباشرة الترسب المفرط للكولاجين عن طريق تنظيم مسار إشارة SMAD3. بالإضافة إلى ذلك ، تم العثور على αSMA للمساهمة في تكوين ندبة تضخمية من خلال تنظيم تقلص الخلايا وreepithelialization في عملية التئام الجروح4. عدم وجود مناسبة في المختبر وفي نماذج على الجسم الحي هو عائق رئيسي أمام تطوير وتقييم التدخلات والعلاجات لمعالجة ندبة. والهدف من هذه الدراسة هو استخدام تقنية MMC القائمة لبناء نموذج ندبة تضخمية “تشبه الجسم الحي” مناسبة لتقييم التدخلات الجديدة والناشئة المتعلقة بالندبة.
كان استنساخ الأنسجة الحية خارج الجسم هدفًا لسنوات في المجتمع العلمي. وقد حقق تطوير التقنيات المختبرية في أوائل القرن العشرين هذا الهدف جزئياً. وقد تطورت حاليا في تقنيات المختبر قليلا من عرض رو الأصلي أن الخلايا الجنينية يمكن البقاء على قيد الحياة على قيد الحياة على سبيل الكيفو لعدة أيام في الملاخطالدافئ5. ومع ذلك ، تقتصر في المنهجيات المختبرية في الغالب على أنواع الخلايا المفردة المزروعة في 2-D ولا تُلخص الأنسجة بدقة في الجسم الحي. في حين مفيدة لفحص الكيمياء الحيوية للخلايا، وعلم وظائف الأعضاء، وعلم الوراثة، والأنسجة الأصلية هي 3-D ودمج أنواع متعددة من الخلايا. بسيطة 2-D في أنظمة المختبر تخضع خلايا الثدييات لبيئات اصطناعية للغاية حيث يتم فقدان العمارة الخاصة بالأنسجة الأصلية6. بدوره، وهذا يؤثر على الأحداث داخل الخلايا وخارج الخلية، مما أدى إلى مورفولوجيا الخلايا غير طبيعية، علم وظائف الأعضاء، والسلوك7.
يكمن الاهتمام وراء هذا البروتوكول في تطوير وإدارة السريرية للندوب الضخامية والنُكُر. في حين أنه من الثابت أن الخلايا الليفية الجلدية هي المسؤولة إلى حد كبير عن إنتاج وفيرة من الكولاجين الموجودة في الأنسجة ندبا، وزراعة الخلايا الليفية الجلدية باستخدام 2-D في النظم المختبرية فشل في استنساخ دوران الكولاجين لوحظ في الجسم الحي8. المعاصرة في أساليب المختبر لا تزال تستخدم أساسا “المالحة الدافئة”، بيئة مختلفة تماما عن تلك الموجودة في الأنسجة الحية. الأنسجة في الجسم الحي مزدحمة للغاية، مع البروتينات والأحماض النووية، والبروتينات الريبونوكليو، والسكريات، وتحتل 5٪-40٪ من الحجم الإجمالي. كما لا يوجد جزيئين يمكن أن تشغل نفس المساحة في نفس الوقت، وهناك مساحة حرة قليلة المتاحة وغياب كامل تقريبا من الماء الحر9.
تفرض تقنية MMC قيودًا تؤثر على الخصائص الحرارية للسيتوسول والسوائل الخلالية. التفاعلات الجزيئية، مستقبلات ligand إشارات المجمعات، والإنزيمات، والعضيات تقتصر على التفاعل بحرية9. كما أن التفاعلات داخل البيئة المحيطة بالخلية (أي الإنترستيوم) مقيدة أيضاً. تؤكد الأدلة الحديثة أن التركيزات العالية من الجزيئات الكلية الخاملة في حلول مزدحمة تعكر الانتشار، والارتباط المادي، واللزوجة والخصائص الهيدروديناميكية10.
ومن المثير للاهتمام، العديد من وكلاء الحشد شعبية (أي فيكول، dextran، polyvinylpyrrolidone [PVP]، والصوديوم 4-styrenesulfonate [PSS]) ليست متساوية عند تطبيقها على أنواع مختلفة من الخلايا وفي إعدادات مختلفة. في دراسة سابقة واحدة، أفيد فيكول أن تكون أقل سمية للخلايا الخلايا الجذعية mesenchymal بالمقارنة مع PVP. وقد فسرت هذه النتائج على أنها نتيجة لشحنتها المحايدة ونصف قطرها الهيدروديناميكي الصغيرنسبياً 11. في المقابل، وجدت دراسة ثانية أن dextran هو أكثر فعالية في تحفيز الكولاجين الأول ترسب من الخلايا الليفية الرئة البشرية مقارنة مع فيكول12. تشير البيانات الواردة من دراستنا الخاصة إلى أن فيكول يعزز ترسب الكولاجين بواسطة الخلايا الليفية المشتقة من الندبة الضخامية ، في حين أن PVP سام لهذه الخلايا13.
وقد ثبت أن تحويل procollagen إلى الكولاجين هو أسرع في بيئة مزدحمة للغاية في الجسم الحي14، في حين يتم تأخير معدل التفاعلات البيولوجية في نظام الثقافة المخفف 2 -D15. لقد قمنا بتحسين بروتوكول المختبر هنا ، ودمج MMC لإظهار زراعة الخلايا الليفية الجلدية بمثابة نموذج أكثر “في الجسم الحي” للتليف الجلدي وتشكيل الندبة. على النقيض من نظام الثقافة المشتركة 2-D، زراعة hHSFs مع MMC يحفز التمثيل الحيوي وترسب الكولاجين بشكل ملحوظ13. وتجدر الإشارة إلى أن الخصائص الأخرى للتليف (أي زيادة التعبير عن مصفوفة المعادن [MMPs] والسيتوكينات البرولية) واضحة أيضاً في إطار هذا البروتوكول الأمثل MMC13. عند زراعتها باستخدام هذه الطريقة ، يظهر أن الخلايا الجلدية تُلخص المعلمات الفسيولوجية والبيوكيميائية والوظيفية التي تقاس في الجسم الحي.
وقد استخدمت MMC الأمثل في بروتوكول المختبر لتقييم التعبير عن الكولاجين والبروتينات ECM الأخرى بواسطة الخلايا الليفية الجلدية معزولة عن الأدمة ندبة تضخم يفرط في التأثر والأدمة المجاورة غير المعنية. عندما تزرع في بيئات MMC في المختبر، وقد لوحظ أن hHSFs التعبير عن خصائص معينة (مثل، مرنا، الكيمياء الحيوية، علم وظائف الأعضاء، والنمط الظاهري) مماثلة لأنسجة ندبة فرط التغذية الجلدية في الجسم الحي. وتشير الأدلة إلى أن الخصائص الفيزيائية والكيميائية هي اعتبارات هامة عند اختيار الزحام وتحسين ظروف MMC للزراعة في المختبر.
لإثبات المبدأ ، يتم تطبيق بروتوكول MMC هنا لتقييم نوعي وكمي لقدرة شيكونين ونظائرها على الحث على الخلايا المبرمجة. وهذا يسمح بتقييم التطبيقات المحتملة لهذه المركبات الطبية الصينية التقليدية المشتقة بشكل طبيعي (TCM) لإدارة ندبات الجلد13. وعلى الرغم من ذلك، فإن بساطة هذا البروتوكول في المختبر وفعاليته من حيث التكلفة وحسن توقيته يفي أيضاً باللوائح الحديثة للقضاء على التجارب في الثدييات بموجب توجيه الاتحاد الأوروبي 2010/63/EU ووكالة حماية البيئة الأمريكية( EPA).
Protocol
Representative Results
Discussion
يهدف هذا البروتوكول إلى تحسين وتوثيق الندبة في جرة محسنة” في نموذج المختبر للأنسجة الندبة الجلدية البشرية. وقد ذكرت الدراسات السابقة تطبيق تقنية MMC على الخلايا الليفية الرئة البشرية12,الخلايا الجذعية نخاع العظم البشري mesenchymal23,والخلايا الليفية الجلد الإنسان<sup class…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل بتمويل من وكالة سنغافورة للعلوم والتكنولوجيا والبحوث “SPF 2013/004: بحوث بيولوجيا الجلد الأساسية” و “ابتكار رعاية الجروح للمناطق المدارية” IAF-PP/2017 H17/01/a0/009. ويعرب المؤلفان عن امتنانهما للمشورة والمساعدة المقدمة من الدكتورة بولا بيني والدكتور مايكل راغوناث.
Materials
| 0.2 μm filter | Sartorius | 16534 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | P36962 | |
| Alexa Fluor 680 | Thermo Fisher Scientific | A-21076 | |
| Alexa Fluor 800 | Thermo Fisher Scientific | A-11371 | |
| alpha smooth muscle actin (αSMA) primary antibody | Abcam | ab5694 | |
| Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (thermal cycler ) | Thermo Fisher Scientific | 4351106 | |
| Ascorbic acid | Wako | #013-12061 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | #A2153 | |
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 500-0006 | |
| Collagen I primary antibody (for immunostaining) | Abcam | 6308 | |
| Collagen I primary antibody (for western blot) | Abcam | ab21286 | |
| Collagen III primary antibody | Abcam | ab7778 | |
| Collagen IV primary antibody | Abcam | ab6586 | |
| Direct Red 80 | Sigma-Aldrich | 2610108 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Life Technologies | 11996-065 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Life Technologies | 6000-044 | |
| Ficoll 400 | GE HealthCare | #17-0300-10 | |
| Ficoll 70 | GE HealthCare | #17-0310-10 | |
| GAPDH primary antibody | Sigma-Aldrich | G8795 | |
| Goat Anti-Rabbit secondary antibody | Abcam | ab97050 | |
| Human hypertrophic scar/normal fibroblasts (hHSF/hNSF) | Cell Research Corporation | 106, 107, 108 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | #1708890 | |
| MMP-1 primary antibody | Abcam | ab38929 | |
| MMP-13 primary antibody | Abcam | ab39012 | |
| MMP-2 primary antibody | Abcam | ab37150 | |
| MMP-9 primary antibody | Abcam | ab38898 | |
| NanoDrop Microvolume Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 10484060 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | NP0321BOX | |
| Odyssey blocking buffer | LI-COR Biosciences | 927–40000 | |
| Odyssey Fc Imaging System | LI-COR Biosciences | N/A | |
| Olympus IX-81 HCS microscope (for immunostaining) | Olympus | N/A | |
| Penicillin/streptomycin solution (P/S) | Life Technologies | 15140-122 | |
| PrimePCR Assays | Bio-Rad | Customized primers pre-coated in 96-well plates based on requirement | |
| Protease inhibitor cocktail (PIC) | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
| PVP 360 | Sigma | #PVP360 | |
| PVP 40 | Sigma | #PVP40 | |
| RIPA buffer | Merck | R0278 | |
| RNeasy Plus Mini Kit | QIAGEN | #74134 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 450022 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 450243 | |
| SpectraMax M5 Multi-Mode microplate reader | Molecular Devices | N/A | |
| SsoAdvanced universal SYBR green supermix | Bio-Rad | #172-5270 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 |
References
- vander Veer, W. M., et al. Potential cellular and molecular causes of hypertrophic scar formation. Burns. 35 (1), 15-29 (2009).
- Linge, C., et al. Hypertrophic Scar Cells Fail to Undergo a Form of Apoptosis Specific to Contractile Collagen[mdash]The Role of Tissue Transglutaminase. Journal of Investigative Dermatology. 125 (1), 72-82 (2005).
- Penn, J. W., Grobbelaar, A. O., Rolfe, K. J. The role of the TGF-beta family in wound healing, burns and scarring: a review. International Journal of Burns and Trauma. 2 (1), 18-28 (2012).
- Wang, X. Q., Kravchuk, O., Winterford, C., Kimble, R. M. The correlation of in vivo burn scar contraction with the level of alpha-smooth muscle actin expression. Burns. 37 (8), 1367-1377 (2011).
- Eitan, E., Zhang, S., Witwer, K. W., Mattson, M. P. Extracellular vesicle-depleted fetal bovine and human sera have reduced capacity to support cell growth. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 26373 (2015).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Kapalczynska, M., et al. 2D and 3D cell cultures – a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
- Lareu, R. R., Arsianti, I., Subramhanya, H. K., Yanxian, P., Raghunath, M. In vitro enhancement of collagen matrix formation and crosslinking for applications in tissue engineering: a preliminary study. Tissue Engineering. 13 (2), 385-391 (2007).
- Kuznetsova, I. M., Turoverov, K. K., Uversky, V. N. What macromolecular crowding can do to a protein. International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 23090-23140 (2014).
- Chen, C., Loe, F., Blocki, A., Peng, Y., Raghunath, M. Applying macromolecular crowding to enhance extracellular matrix deposition and its remodeling in vitro for tissue engineering and cell-based therapies. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 277-290 (2011).
- Zeiger, A. S., Loe, F. C., Li, R., Raghunath, M., Van Vliet, K. J. Macromolecular Crowding Directs Extracellular Matrix Organization and Mesenchymal Stem Cell Behavior. PloS one. 7 (5), 37904 (2012).
- Chen, C. Z., et al. The Scar-in-a-Jar: studying potential antifibrotic compounds from the epigenetic to extracellular level in a single well. British Journal of Pharmacology. 158 (5), 1196-1209 (2009).
- Fan, C., et al. Application of “macromolecular crowding” in vitro to investigate the naphthoquinones shikonin, naphthazarin and related analogues for the treatment of dermal scars. Chemico-Biological Interactions. 310, 108747 (2019).
- Canty, E. G., Kadler, K. E. Procollagen trafficking, processing and fibrillogenesis. Journal of Cell Science. 118, 1341-1353 (2005).
- Minton, A. P. Models for Excluded Volume Interaction between an Unfolded Protein and Rigid Macromolecular Cosolutes: Macromolecular Crowding and Protein Stability Revisited. Biophysical Journal. 88 (2), 971-985 (2005).
- Ernst, O., Zor, T. Linearization of the bradford protein assay. Journal of Visualized Experiments. (38), e1918 (2010).
- Beltrame, C. O., Cortes, M. F., Bandeira, P. T., Figueiredo, A. M. Optimization of the RNeasy Mini Kit to obtain high-quality total RNA from sessile cells of Staphylococcus aureus. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 48 (12), 1071-1076 (2015).
- Xue, M., Jackson, C. J. Extracellular Matrix Reorganization During Wound Healing and Its Impact on Abnormal Scarring. Advances in wound care (New Rochelle). 4 (3), 119-136 (2015).
- Rohani, M. G., Parks, W. C. Matrix remodeling by MMPs during wound repair. Matrix Biology. 44-46, 113-121 (2015).
- Ulrich, D., Ulrich, F., Unglaub, F., Piatkowski, A., Pallua, N. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in patients with different types of scars and keloids. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 63 (6), 1015-1021 (2010).
- Ghazizadeh, M., Tosa, M., Shimizu, H., Hyakusoku, H., Kawanami, O. Functional Implications of the IL-6 Signaling Pathway in Keloid Pathogenesis. Journal of Investigative Dermatology. 127 (1), 98-105 (2007).
- Wilgus, T. A., Ferreira, A. M., Oberyszyn, T. M., Bergdall, V. K., Dipietro, L. A. Regulation of scar formation by vascular endothelial growth factor. Laboratory Investigation. 88 (6), 579-590 (2008).
- Rashid, R., et al. Novel use for polyvinylpyrrolidone as a macromolecular crowder for enhanced extracellular matrix deposition and cell proliferation. Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (12), 994-1002 (2014).
- Lago, J. C., Puzzi, M. B. The effect of aging in primary human dermal fibroblasts. PloS one. 14 (7), 0219165 (2019).
- Cigognini, D., et al. Macromolecular crowding meets oxygen tension in human mesenchymal stem cell culture – A step closer to physiologically relevant in vitro organogenesis. Scientific Reports. 6, 30746 (2016).
- Cuttle, L., et al. A porcine deep dermal partial thickness burn model with hypertrophic scarring. Burns. 32 (7), 806-820 (2006).
- Fan, C., Xie, Y., Dong, Y., Su, Y., Upton, Z. Investigating the potential of Shikonin as a novel hypertrophic scar treatment. Journal of Biomedical Science. 22, 70 (2015).
- Fan, C., et al. Shikonin reduces TGF-beta1-induced collagen production and contraction in hypertrophic scar-derived human skin fibroblasts. International Journal of Molecular Medicine. 36 (4), 985-991 (2015).
- Werner, S., Krieg, T., Smola, H. Keratinocyte-Fibroblast Interactions in Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 127 (5), 998-1008 (2007).
