In Vitro Modell der menschlichen kutanen hypertrophen Narbenbildung mit makromolekularer Crowding
Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von makromolekularem Crowding, um ein in vitro menschliches hypertrophes Narbengewebemodell zu erstellen, das in vivo-Bedingungen ähnelt. Wenn sie in einer überfüllten makromolekularen Umgebung kultiviert werden, weisen menschliche Hautfibroblasten Phänotypen, Biochemie, Physiologie und funktionelle Eigenschaften auf, die Narbengewebe ähneln.
Abstract
Es hat sich gezeigt, dass In-vivo-Gewebe stark von Proteinen, Nukleinsäuren, Ribonukleoproteinen, Polysacchariden usw. überfüllt sind. Das folgende Protokoll wendet eine makromolekulare Crowding-Technik (MMC) an, um diese physiologische Verdrängung durch die Zugabe von neutralen Polymeren (Crowdern) zu Zellkulturen in vitro nachzuahmen. Frühere Studien mit Ficoll oder Dextran als Crowder zeigen, dass die Expression von Kollagen I und Fibronectin in WI38 und WS-1 Zelllinien mit der MMC-Technik deutlich verbessert werden. Diese Technik wurde jedoch nicht bei primären hypertrophen Narben-abgeleiteten menschlichen Hautfibroblasten (hHSFs) validiert. Da hypertrophe Narbenbildung aus der übermäßigen Ablagerung von Kollagen entsteht, zielt dieses Protokoll darauf ab, ein kollagenreiches in vitro hypertrophes Narbenmodell zu konstruieren, indem die MMC-Technik mit hHSFs angewendet wird. Dieses optimierte MMC-Modell hat nachweislich mehr Ähnlichkeiten mit in vivo Narbengewebe als herkömmliche 2-dimensionale (2-D) Zellkultursysteme. Darüber hinaus ist es im Vergleich zu Tiermodellen kostengünstig, zeiteffizient und ethisch wünschenswert. Daher bietet das hier beschriebene optimierte Modell ein fortschrittliches “in vivo-ähnliches” Modell für hypertrophe Narbenstudien.
Introduction
Narbengewebe stellt den Endpunkt der Gewebereparatur dar. Jedoch, bei vielen Personen, vor allem diejenigen, die an Verbrennungen oder Trauma1leiden, Narbenbildung kann übermäßig sein und unerwünschte Auswirkungen auf die Morphologie und Funktion der geheilten Haut. Obwohl die genauen Mechanismen der pathologischen (hypertrophen Narben und Keloide) Narbenbildung nicht vollständig verstanden werden, hat sich gezeigt, dass übermäßige Ablagerung von Kollagen während der Wundheilung ein wesentlicher Beitrag2ist.
Es ist allgemein bekannt, dass die Transformation des Wachstumsfaktors Beta 1 (TGF-1) und alpha-glatter Muskelaktin (SMA) eine Schlüsselrolle bei der Bildung von hypertrophen Narben spielen. Es gibt Hinweise darauf, dass erhöhte TGF-Nr. 1 direkt die übermäßige Ablagerung von Kollagen durch Regulierung des SMAD-Signalwegs3stimuliert. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass SMA zur hypertrophen Narbenbildung beiträgt, indem die Zellkontraktion und Reepithelisierung im Wundheilungsprozess reguliertwird 4. Das Fehlen geeigneter In-vitro- und In-vivo-Modelle ist ein großes Hindernis für die Entwicklung und Bewertung von Interventionen und Therapien zur Narbensanierung. Ziel dieser Studie ist es, die bestehende MMC-Technik zu nutzen, um ein “in vivo-ähnliches” hypertrophes Narbenmodell zu konstruieren, das sich für die Bewertung neuartiger und aufkommender Narbeninterventionen eignet.
Die Reproduktion von lebendem Gewebe außerhalb des Körpers ist seit Jahren ein Ziel in der wissenschaftlichen Gemeinschaft. Mit der Entwicklung von In-vitro-Techniken im frühen 20. Jahrhundert wurde dieses Ziel teilweise erreicht. Aktuelle In-vitro-Techniken haben sich leicht aus Roux’ ursprünglicher Demonstration entwickelt, dass embryonale Zellen ex vivo für mehrere Tage in warmer Saline überleben können5. In-vitro-Methoden sind jedoch meist auf Einzelzelltypen beschränkt, die in 2D kultiviert werden, und rekapitulieren Gewebe in vivo nicht genau. Während nützlich für die Untersuchung der Zellbiochemie, Physiologie, und Genetik, native Gewebe sind 3-D und enthalten mehrere Zelltypen. Einfache 2-D-In-vitro-Systeme unterwerfen Säugetierzellen hochgradig künstlichen Umgebungen, in denen die native gewebespezifische Architektur verloren geht6. Dies wiederum wirkt sich auf intrazelluläre und extrazelluläre Ereignisse aus, was zu abnormaler Zellmorphologie, Physiologie undVerhalten7 führt.
Das Interesse hinter diesem Protokoll liegt in der Entwicklung und dem klinischen Management von hypertrophen Narben und Keloiden. Während es allgemein bekannt ist, dass dermale Fibroblasten in hohem Maße für die reichliche Produktion von Kollagen enden, die im Narbengewebe vorhanden sind, gelingt es bei der Kultivierung dermaler Fibroblasten mit 2-D-In-vitro-Systemen nicht, den Umsatz von Kollagen zu reproduzieren, das in vivo8beobachtet wurde. Zeitgenössische In-vitro-Methoden verwenden nach wie vor im Wesentlichen “warme Saline”, eine Umgebung, die sich völlig von der in lebenden Geweben unterscheidet. Gewebe in vivo sind extrem überfüllt, mit Proteinen, Nukleinsäuren, Ribonukleoproteinen und Polysacchariden, die 5% –40% des Gesamtvolumens einnehmen. Da keine zwei Moleküle den gleichen Raum gleichzeitig einnehmen können, gibt es wenig freien Raum und eine fast vollständige Abwesenheit von freiem Wasser9.
Die MMC-Technik setzt Einschränkungen auf, die die thermodynamischen Eigenschaften von Zytosol und interstitiellen Flüssigkeiten beeinflussen. Molekulare Wechselwirkungen, Rezeptor-Ligand-Signalkomplexe, Enzyme und Organellen sind beschränkt und von der freien Interaktion eingeschränkt9. Wechselwirkungen innerhalb der perizellulären Umgebung (d. h. Interstitium) sind ebenfalls eingeschränkt. Jüngste Erkenntnisse bestätigen, dass hohe Konzentrationen von inerten Makromolekülen in überfüllten Lösungen Diffusion, physikalische Assoziation, Viskosität und hydrodynamische Eigenschaften stören10.
Interessanterweise sind mehrere beliebte Crowding-Agenten (z.B. Ficoll, Dextran, Polyvinylpyrrolidon [PVP] und Natrium 4-Styrenesulfonat [PSS]) nicht gleichwertig, wenn sie auf verschiedene Zelltypen und in unterschiedlichen Einstellungen angewendet werden. In einer früheren Studie, Ficoll wurde berichtet, dass weniger zytotoxisch für mesenchymale Stammzellen im Vergleich zu PVP. Diese Ergebnisse wurden als Folge ihrer neutralen Ladung und des relativ kleinen hydrodynamischen Radius11interpretiert. Im Gegensatz dazu ergab eine zweite Studie, dass Dextran effektiver bei der Stimulierung der Kollagen-I-Abscheidung durch menschliche Lungenfibroblasten im Vergleich zu Ficoll12ist. Daten aus unserer eigenen Studie deuten darauf hin, dass Ficoll die Kollagenablagerung durch hypertrophe Narbe-abgeleitete Fibroblasten verbessert, während PVP für diese Zellen toxisch ist13.
Es wurde gezeigt, dass die Umwandlung von Prokollagen zu Kollagen in einer stark überfüllten in vivo Umgebung14schneller ist, während die Rate der biologischen Reaktionen in einem verdünnten 2D-Kultursystem verzögert wird15. Wir haben hier das In-vitro-Protokoll optimiert und MMC integriert, um die Kultivierung von dermalen Fibroblasten zu zeigen, die als “in vivo-ähnliches” Modell für dermale Fibrose und Narbenbildung dienen. Im Gegensatz zum gemeinsamen 2-D-Kultursystem stimuliert die Kultivierung von hHSFs mit MMC die Biosynthese und Ablagerung von Kollagen signifikant13. Insbesondere sind unter diesem optimierten MMC-Protokoll13auch andere Merkmale der Fibrose (d.h. erhöhte Expression von Matrixmetalloproteinasen [MMPs] und proinflammatorischen Zytokinen) zu erkennen. Bei der Kultivieren mit dieser Methode wird gezeigt, dass dermale Zellen die physiologischen, biochemischen und funktionellen Parameter rekapitulieren, die in vivo gemessen werden.
Das optimierte MMC-In-vitro-Protokoll wurde verwendet, um die Expression von Kollagen und anderen ECM-Proteinen durch dermale Fibroblasten zu bewerten, die aus hypertrophen Narbendermisen und unbeteiligten angrenzenden Dermis isoliert wurden. Bei der Kultiviertheit in MMC-Umgebungen in vitro wurde beobachtet, dass hHSFs bestimmte Eigenschaften (z. B. mRNA, Biochemie, Physiologie und Phänotyp) ähnlich wie dermale hypertrophe Narbengewebe in vivo exprimieren. Die Beweise deuten darauf hin, dass physikalische und chemische Eigenschaften wichtige Überlegungen bei der Auswahl von Crowdern und der Optimierung der MMC-Bedingungen für den Anbau in vitro sind.
Zum Proof-of-Prinzip wird hier das MMC-Protokoll angewendet, um die Fähigkeit von Shikonin und seinen Analoga, Apoptose zu induzieren, qualitativ und quantitativ zu bewerten. Dies ermöglicht die Bewertung der möglichen Anwendungen dieser natürlich abgeleiteten traditionellen chinesischen Medizin (TCM) Verbindungen für die Verwaltung dermal Narben13. Ungeachtet der Einfachheit, Kostenwirksamkeit und Aktualität dieses In-vitro-MMC-Protokolls erfüllt es auch die jüngsten Vorschriften zur Beseitigung von Säugetierexperimenten durch die EU-Richtlinie 2010/63/EU und die US-Umweltbehörde EPA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll zielt darauf ab, ein verbessertes In-vitro-Modell von :scar-in-a-jar für menschliches Kutanennarbengewebe zu optimieren und zu authentifizieren. Frühere Studien haben die Anwendung der MMC-Technik auf menschliche Lungen-Fibroblasten12, menschliche Knochenmark mesenchymale Stammzellen23und menschliche dermale Fibroblasten23 mit Dextran12, Ficoll12und PVP23 als C…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Fördermittel der Singapurer Agentur für Wissenschaft, Technologie und Forschung “SPF 2013/004: Skin Biology Basic Research” und der “Wound Care Innovation for the Tropics” IAF-PP/2017 (HBMS) H17/01/a0/009 unterstützt. Die Autoren danken Ihnen bei Dr. Paula Benny und Dr. Michael Raghunath.
Materials
| 0.2 μm filter | Sartorius | 16534 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | P36962 | |
| Alexa Fluor 680 | Thermo Fisher Scientific | A-21076 | |
| Alexa Fluor 800 | Thermo Fisher Scientific | A-11371 | |
| alpha smooth muscle actin (αSMA) primary antibody | Abcam | ab5694 | |
| Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (thermal cycler ) | Thermo Fisher Scientific | 4351106 | |
| Ascorbic acid | Wako | #013-12061 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | #A2153 | |
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 500-0006 | |
| Collagen I primary antibody (for immunostaining) | Abcam | 6308 | |
| Collagen I primary antibody (for western blot) | Abcam | ab21286 | |
| Collagen III primary antibody | Abcam | ab7778 | |
| Collagen IV primary antibody | Abcam | ab6586 | |
| Direct Red 80 | Sigma-Aldrich | 2610108 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Life Technologies | 11996-065 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Life Technologies | 6000-044 | |
| Ficoll 400 | GE HealthCare | #17-0300-10 | |
| Ficoll 70 | GE HealthCare | #17-0310-10 | |
| GAPDH primary antibody | Sigma-Aldrich | G8795 | |
| Goat Anti-Rabbit secondary antibody | Abcam | ab97050 | |
| Human hypertrophic scar/normal fibroblasts (hHSF/hNSF) | Cell Research Corporation | 106, 107, 108 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | #1708890 | |
| MMP-1 primary antibody | Abcam | ab38929 | |
| MMP-13 primary antibody | Abcam | ab39012 | |
| MMP-2 primary antibody | Abcam | ab37150 | |
| MMP-9 primary antibody | Abcam | ab38898 | |
| NanoDrop Microvolume Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 10484060 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | NP0321BOX | |
| Odyssey blocking buffer | LI-COR Biosciences | 927–40000 | |
| Odyssey Fc Imaging System | LI-COR Biosciences | N/A | |
| Olympus IX-81 HCS microscope (for immunostaining) | Olympus | N/A | |
| Penicillin/streptomycin solution (P/S) | Life Technologies | 15140-122 | |
| PrimePCR Assays | Bio-Rad | Customized primers pre-coated in 96-well plates based on requirement | |
| Protease inhibitor cocktail (PIC) | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
| PVP 360 | Sigma | #PVP360 | |
| PVP 40 | Sigma | #PVP40 | |
| RIPA buffer | Merck | R0278 | |
| RNeasy Plus Mini Kit | QIAGEN | #74134 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 450022 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 450243 | |
| SpectraMax M5 Multi-Mode microplate reader | Molecular Devices | N/A | |
| SsoAdvanced universal SYBR green supermix | Bio-Rad | #172-5270 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 |
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