In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding
Summary
Ce protocole décrit l’utilisation de l’encombrement macromoléculaire pour créer un modèle de tissu cicatriciel hypertrophique humain in vitro qui ressemble à des conditions in vivo. Lorsqu’ils sont cultivés dans un environnement macromoléculaire surpeuplé, les fibroblastes de peau humaine présentent des phénotypes, de la biochimie, de la physiologie et des caractéristiques fonctionnelles ressemblant au tissu cicatriciel.
Abstract
Il a été démontré que les tissus in vivo sont fortement encombrés par les protéines, les acides nucléiques, les ribonucléoprotéines, les polysaccharides, etc. Le protocole suivant applique une technique d’encombrement macromoléculaire (MMC) pour imiter cette encombrement physiologique par l’ajout de polymères neutres (crowders) aux cultures cellulaires in vitro. Des études antérieures utilisant Ficoll ou dextran comme crowders démontrent que l’expression du collagène I et de la fibronectine dans les lignées cellulaires WI38 et WS-1 sont considérablement améliorées à l’aide de la technique MMC. Cependant, cette technique n’a pas été validée dans les fibroblastes humains de peau hypertrophiques primaires dérivés de cicatrices (hHSF). Comme la cicatrisation hypertrophique résulte du dépôt excessif du collagène, ce protocole vise à construire un modèle de cicatrice hypertrophique in vitro riche en collagène en appliquant la technique MMC avec des HHSF. Ce modèle MMC optimisé a été montré pour posséder plus de similitudes avec le tissu cicatriciel in vivo par rapport aux systèmes traditionnels de culture cellulaire 2 dimensions (2-D). En outre, il est rentable, rentable et souhaitable sur le plan éthique par rapport aux modèles animaux. Par conséquent, le modèle optimisé rapporté ici offre un modèle avancé “in vivo-like” pour les études hypertrophiques liées aux cicatrices.
Introduction
Le tissu cicatriciel représente le critère final de la réparation des tissus. Cependant, chez de nombreuses personnes, en particulier celles souffrant de brûlures ou detraumatismes 1, les cicatrices peuvent être excessives et imposer des effets indésirables sur la morphologie et le fonctionnement de la peau guérie. Bien que les mécanismes exacts de la formation pathologique (cicatrices hypertrophiques et chéloïdes) ne soient pas entièrement compris, le dépôt excessif du collagène pendant la cicatrisation des plaies a été démontré comme une contribution essentielle2.
Il est bien établi que la transformation du facteur de croissance bêta 1 (TGF-1) et de l’actine alpha lisse du muscle (SMA) jouent un rôle clé dans la formation de cicatrices hypertrophiques. Les preuves suggèrent que le TGF-1 élevé stimule directement le dépôt excessif de collagène par la régulation de la voie de signalisation SMAD3. En outre, il a été constaté que la SAS a contribué à la formation de cicatrices hypertrophiques en régulant la contraction et la réépithelialisation des cellules dans le processus de cicatrisationdes plaies 4. L’absence de modèles in vitro et in vivo appropriés est un obstacle majeur au développement et à l’évaluation des interventions et des thérapies pour l’assainissement des cicatrices. L’objectif de cette étude est d’utiliser la technique MMC existante pour construire un modèle de cicatrice hypertrophique « in vivo » qui convient à l’évaluation des interventions nouvelles et émergentes liées aux cicatrices.
Reproduire des tissus vivants à l’extérieur du corps a été un objectif pendant des années dans la communauté scientifique. Le développement de techniques in vitro au début du XXe siècle a en partie atteint cet objectif. Les techniques in vitro actuelles ont légèrement évolué à partir de la démonstration originale de Roux que les cellules embryonnaires peuvent survivre ex vivo pendant plusieurs jours dans la saline chaude5. Cependant, les méthodologies in vitro sont principalement limitées aux types de cellules individuelles cultivés en 2-D et ne récapitulent pas avec précision les tissus in vivo. Bien qu’ils soient utiles pour examiner la biochimie cellulaire, la physiologie et la génétique, les tissus indigènes sont 3D et intègrent plusieurs types de cellules. Les systèmes in vitro simples en 2D soumettnt les cellules mammifères à des environnements hautement artificiels dans lesquels l’architecture spécifique aux tissus indigènes est perdue6. À son tour, cela affecte les événements intracellulaires et extracellulaires, ayant pour résultat la morphologie anormale de cellules, la physiologie, et le comportement7.
L’intérêt derrière ce protocole réside dans le développement et la gestion clinique des cicatrices hypertrophiques et des chéloïdes. Bien qu’il soit bien établi que les fibroblastes dermiques sont en grande partie responsables de la production abondante de collagènes présents dans le tissu cicatriciel, cultiver des fibroblastes dermiques à l’aide de systèmes in vitro 2-D ne parvient pas à reproduire le chiffre d’affaires du collagène observé in vivo8. Les méthodes in vitro contemporaines utilisent encore essentiellement le « salin chaud », un environnement complètement différent de celui des tissus vivants. Les tissus in vivo sont extrêmement encombrés, avec des protéines, des acides nucléiques, des ribonucléoprotéines et des polysaccharides, occupant 5% à 40% du volume total. Comme il n’y a pas deux molécules pouvant occuper le même espace en même temps, il y a peu d’espace libre disponible et une absence presque totale d’eau libre9.
La technique MMC impose des contraintes affectant les propriétés thermodynamiques des cytosols et des fluides interstitiels. Les interactions moléculaires, les complexes de signalisation récepteur-ligand, les enzymes et les organites sont confinés et interdits d’interagir librement9. Les interactions dans l’environnement périellulaire (c.-à-d. interstitium) sont également limitées. Des preuves récentes confirment que des concentrations élevées de macromolécules inertes dans les solutions bondées perturbent la diffusion, l’association physique, la viscosité et les propriétés hydrodynamiques10.
Fait intéressant, plusieurs agents de crowding populaires (c.-à-d. Ficoll, dextran, polyvinylpyrrolidone [PVP] et sodium 4-styrenesulfonate [PSS]) ne sont pas équivalents lorsqu’ils sont appliqués à différents types de cellules et dans différents contextes. Dans une étude précédente, Ficoll a été rapporté pour être moins cytotoxique pour les cellules souches mésenchymales comparées à PVP. Ces résultats ont été interprétés comme la conséquence de sa charge neutre et du rayon hydrodynamique relativement faible11. En revanche, une deuxième étude a constaté que dextran est plus efficace en stimulant le collagène I dépôt par les fibroblastes pulmonaires humains par rapport à Ficoll12. Les données de notre propre étude suggèrent que Ficoll améliore le dépôt de collagène par les fibroblastes hypertrophiques dérivés de cicatrice, tandis que PVP est toxique pour ces cellules13.
Il a été démontré que la conversion du procollagen en collagène est plus rapide dans un environnement in vivo très encombré14, tandis que le taux de réactions biologiques est retardée dans un système de culture 2D dilué15. Nous avons optimisé le protocole in vitro ici, incorporant MMC pour montrer la culture de fibroblastes dermiques servant de modèle plus ” in vivo- comme pour la fibrose cutanée et la formation de cicatrices. Contrairement au système de culture 2D commun, cultiver des HHSF avec MMC stimule la biosynthèse et le dépôt de collagène de manière significative13. Notamment, d’autres caractéristiques de la fibrose (c.-à-d., l’expression accrue des métalloprotéinases matrices [MMPs] et des cytokines proinflammatoires) sont également évidentes en vertu de ce protocole MMC optimisé13. Lorsqu’elles sont cultivées à l’aide de cette méthode, il est démontré que les cellules cutanées récapitulent les paramètres physiologiques, biochimiques et fonctionnels mesurés in vivo.
Le protocole in vitro optimisé MMC a été utilisé pour évaluer l’expression du collagène et d’autres protéines ECM par des fibroblastes dermal isolés du derme de cicatrice hypertrophique et des dermis adjacents non impliqués. Lorsqu’ils sont cultivés dans des environnements MMC in vitro, il a été observé que les HHSF expriment certaines caractéristiques (c.-à-d. l’ARNm, la biochimie, la physiologie et le phénotype) semblables au tissu cicatriciel hypertrophique dermique in vivo. Les preuves indiquent que les propriétés physiques et chimiques sont des considérations importantes lors de la sélection des foules et l’optimisation des conditions MMC pour la culture in vitro.
Pour preuve de principe, le protocole MMC est appliqué ici pour évaluer qualitativement et quantitativement la capacité de Shikonin et de ses analogues à induire l’apoptose. Cela permet l’évaluation des applications potentielles de ces composés de médecine traditionnelle chinoise (TCM) d’origine naturelle pour la gestion des cicatrices cutanées13. Malgré tout, la simplicité, la rentabilité et la rapidité de ce protocole MMC in vitro satisfont également aux réglementations récentes visant à éliminer l’expérimentation chez les mammifères par la directive de l’UE 2010/63/EU et l’Environmental Protection Agency (EPA) des États-Unis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole vise à optimiser et à authentifier un modèle in vitro amélioré : cicatrice-dans-un-jar ” pour le tissu cicatriciel cutané humain. Des études antérieures ont rapporté l’application de la technique MMC aux fibroblastes pulmonaires humains12, les cellules souches mésenchymales de moelle osseuse humaine23, et les fibroblastes cutanées humains23 utilisant dextran12, Ficoll12, et PVP…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été soutenus par le financement de l’Agence singapourienne pour la science, la technologie et la recherche “SPF 2013/004: Skin Biology Basic Research” et de l’IAF-PP/2017 (HBMS) H17/01/a0/009. Les auteurs reconnaissent avec gratitude les conseils et l’aide du Dr Paula Benny et du Dr Michael Raghunath.
Materials
| 0.2 μm filter | Sartorius | 16534 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | P36962 | |
| Alexa Fluor 680 | Thermo Fisher Scientific | A-21076 | |
| Alexa Fluor 800 | Thermo Fisher Scientific | A-11371 | |
| alpha smooth muscle actin (αSMA) primary antibody | Abcam | ab5694 | |
| Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (thermal cycler ) | Thermo Fisher Scientific | 4351106 | |
| Ascorbic acid | Wako | #013-12061 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | #A2153 | |
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 500-0006 | |
| Collagen I primary antibody (for immunostaining) | Abcam | 6308 | |
| Collagen I primary antibody (for western blot) | Abcam | ab21286 | |
| Collagen III primary antibody | Abcam | ab7778 | |
| Collagen IV primary antibody | Abcam | ab6586 | |
| Direct Red 80 | Sigma-Aldrich | 2610108 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Life Technologies | 11996-065 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Life Technologies | 6000-044 | |
| Ficoll 400 | GE HealthCare | #17-0300-10 | |
| Ficoll 70 | GE HealthCare | #17-0310-10 | |
| GAPDH primary antibody | Sigma-Aldrich | G8795 | |
| Goat Anti-Rabbit secondary antibody | Abcam | ab97050 | |
| Human hypertrophic scar/normal fibroblasts (hHSF/hNSF) | Cell Research Corporation | 106, 107, 108 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | #1708890 | |
| MMP-1 primary antibody | Abcam | ab38929 | |
| MMP-13 primary antibody | Abcam | ab39012 | |
| MMP-2 primary antibody | Abcam | ab37150 | |
| MMP-9 primary antibody | Abcam | ab38898 | |
| NanoDrop Microvolume Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 10484060 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | NP0321BOX | |
| Odyssey blocking buffer | LI-COR Biosciences | 927–40000 | |
| Odyssey Fc Imaging System | LI-COR Biosciences | N/A | |
| Olympus IX-81 HCS microscope (for immunostaining) | Olympus | N/A | |
| Penicillin/streptomycin solution (P/S) | Life Technologies | 15140-122 | |
| PrimePCR Assays | Bio-Rad | Customized primers pre-coated in 96-well plates based on requirement | |
| Protease inhibitor cocktail (PIC) | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
| PVP 360 | Sigma | #PVP360 | |
| PVP 40 | Sigma | #PVP40 | |
| RIPA buffer | Merck | R0278 | |
| RNeasy Plus Mini Kit | QIAGEN | #74134 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 450022 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 450243 | |
| SpectraMax M5 Multi-Mode microplate reader | Molecular Devices | N/A | |
| SsoAdvanced universal SYBR green supermix | Bio-Rad | #172-5270 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 |
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