In Vitro Model van de mens cutaneous hypertrofische littekens met behulp van macromoleculaire crowding
Summary
Dit protocol beschrijft het gebruik van macromoleculaire verdringing om een in vitro menselijk hypertrofisch littekenweefselmodel te creëren dat lijkt op in vivo omstandigheden. Wanneer gecultiveerd in een drukke macromoleculaire omgeving, menselijke huid fibroblasten vertonen fenotypes, biochemie, fysiologie, en functionele kenmerken die lijken op littekenweefsel.
Abstract
Het is aangetoond dat in vivo weefsels zijn zeer druk door eiwitten, nucleïnezuren, ribonucleoproteïnen, polysachariden, enz. Het volgende protocol past een macromoleculaire crowding (MMC) techniek toe om deze fysiologische verdringing na te bootsen door de toevoeging van neutrale polymeren (crowders) aan celculturen in vitro. Eerdere studies met behulp van Ficoll of dextran als crowders tonen aan dat de expressie van collageen I en fibronectine in WI38 en WS-1 cellijnen aanzienlijk worden verbeterd met behulp van de MMC-techniek. Deze techniek is echter niet gevalideerd in primaire hypertrofische litteken-afgeleide menselijke huid fibroblasten (hHSFs). Aangezien hypertrofische littekens het gevolg zijn van de overmatige afzetting van collageen, is dit protocol bedoeld om een collageenrijk in vitro hypertrofisch littekenmodel te construeren door de MMC-techniek toe te passen met hHSFs. Dit geoptimaliseerde MMC-model vertoont meer overeenkomsten met in vivo littekenweefsel in vergelijking met traditionele 2-dimensionale (2D) celkweeksystemen. Bovendien is het kosteneffectief, tijdefficiënt en ethisch wenselijk in vergelijking met diermodellen. Daarom biedt het hier gerapporteerde geoptimaliseerde model een geavanceerd “in vivo-achtig” model voor hypertrofische littekengerelateerde studies.
Introduction
Littekenweefsel vertegenwoordigt het eindpunt van weefselherstel. Echter, bij veel individuen, vooral die lijden aan brandwonden of trauma1, littekens kan worden overdreven en ongewenste effecten op te leggen aan de morfologie en het functioneren van genezen huid. Hoewel de exacte mechanismen van pathologische (hypertrofische littekens en keloïden) littekenvorming niet volledig worden begrepen, is aangetoond dat overmatige afzetting van collageen tijdens wondgenezing een essentiële bijdrage is2.
Het is algemeen vastgesteld dat het transformeren van groeifactor bèta 1 (TGF-β1) en alfa gladde spieractine (αSMA) een belangrijke rol spelen bij de vorming van hypertrofische littekens. Er zijn aanwijzingen dat verhoogde TGF-β1 overmatige afzetting van collageen direct stimuleert via het reguleren van het SMAD-signaleringstraject3. Bovendien is αSMA gevonden om bij te dragen aan hypertrofische littekenvorming door het reguleren van celcontractie en reepithelialisatie in het wondgenezingsproces4. Het ontbreken van geschikte in vitro en in vivo modellen is een belangrijke belemmering voor het ontwikkelen en evalueren van interventies en therapieën voor littekensanering. Het doel van deze studie is om de bestaande MMC-techniek te gebruiken om een “in vivo-achtig” hypertrofisch littekenmodel te construeren dat geschikt is voor het evalueren van nieuwe en opkomende littekengerelateerde interventies.
Het reproduceren van levend weefsel buiten het lichaam is al jaren een doel in de wetenschappelijke gemeenschap. De ontwikkeling van in vitro technieken in het begin van de twintigste eeuw heeft dit doel gedeeltelijk bereikt. De huidige in vitro technieken zijn licht geëvolueerd uit roux’s oorspronkelijke demonstratie dat embryonale cellen ex vivo meerdere dagen kunnen overleven in warme zoutlijn5. Echter, in vitro methodologieën zijn meestal beperkt tot eencellige types geteeld in 2-D en niet nauwkeurig recapituleren weefsels in vivo. Hoewel nuttig voor het onderzoeken van celbiochemie, fysiologie en genetica, inheemse weefsels zijn 3-D en bevatten meerdere celtypes. Eenvoudige 2-D in vitro systemen onderwerpen zoogdiercellen aan zeer kunstmatige omgevingen waarin native weefselspecifieke architectuur verloren gaat6. Op zijn beurt beïnvloedt dit intracellulaire en extracellulaire voorvallen, wat resulteert in abnormale celmorfologie, fysiologie en gedrag7.
De interesse achter dit protocol ligt in de ontwikkeling en het klinisch beheer van hypertrofische littekens en keloïden. Hoewel het algemeen bekend is dat huidfibroblasten grotendeels verantwoordelijk zijn voor de overvloedige productie van collageen aanwezig in littekenweefsel, het cultiveren van huidfibroblasten met behulp van 2-D in vitro systemen niet aan de omzet van collageen waargenomen in vivo8te reproduceren . Hedendaagse in vitro methoden nog steeds in wezen gebruik maken van “warme zoutwater”, een omgeving die totaal verschilt van die in levende weefsels. Weefsels in vivo zijn extreem druk, met eiwitten, nucleïnezuren, ribonucleoproteïnen en polysachariden, die 5%-40% van het totale volume innemen. Aangezien geen twee moleculen tegelijkertijd dezelfde ruimte kunnen innemen, is er weinig vrije ruimte beschikbaar en een bijna volledige afwezigheid van vrij water9.
De MMC-techniek legt beperkingen op die de thermodynamische eigenschappen van cytosol en interstitiële vloeistoffen beïnvloeden. Moleculaire interacties, receptor-ligand signalering complexen, enzymen, en organellen zijn beperkt en beperkt van de interactie vrij9. Interacties binnen de pericellulaire omgeving (d.w.z. interstitium) zijn ook beperkt. Recent bewijs bevestigt dat hoge concentraties van inerte macromoleculen in overvolle oplossingen diffusie, fysieke associatie, viscositeit en hydrodynamische eigenschappen10.
Interessant is dat verschillende populaire crowding agenten (dat wil zeggen, Ficoll, dextran, polyvinylpyrrolidone [PVP], en natrium 4-styrenesulfonate [PSS]) zijn niet gelijkwaardig wanneer toegepast op verschillende celtypes en in verschillende instellingen. In een eerdere studie, Ficoll werd gemeld dat minder cytotoxische voor mesenchymale stamcellen in vergelijking met PVP. Deze resultaten werden geïnterpreteerd als het gevolg van de neutrale lading en de relatief kleine hydrodynamische straal11. In tegenstelling, een tweede studie bleek dat dextran is effectiever in het stimuleren van collageen I afzetting door menselijke longfibroblasten in vergelijking met Ficoll12. Gegevens uit onze eigen studie suggereert dat Ficoll verbetert collageen depositie door hypertrofische litteken-afgeleide fibroblasten, terwijl PVP is giftig voor deze cellen13.
Het is aangetoond dat de omzetting van procollageen naar collageen sneller is in een zeer drukke in vivo omgeving14, terwijl de snelheid van biologische reacties wordt vertraagd in een verdund 2D-cultuursysteem15. We hebben het in vitro protocol hier geoptimaliseerd, waarbij MMC is opgenomen om de teelt van dermale fibroblasten te laten zien die dienen als een meer “in vivo-achtig” model voor huidfibrose en littekenvorming. In tegenstelling tot het gemeenschappelijke 2D-kweeksysteem stimuleert het cultiveren van hHSFs met MMC de biosynthese en depositie van collageen aanzienlijk13. Met name andere kenmerken van fibrose (d.w.z. verhoogde expressie van matrixmetalloproteinases [MSP’s] en ontstekingscytokines) zijn ook zichtbaar onder dit geoptimaliseerde MMC-protocol13. Wanneer ze met deze methode worden gekweekt, wordt aangetoond dat huidcellen de fysiologische, biochemische en functionele parameters recapituleren die in vivo worden gemeten.
De geoptimaliseerde MMC in vitro protocol is gebruikt om de expressie van collageen en andere ECM eiwitten te evalueren door dermale fibroblasten geïsoleerd van hypertrofische littekendermis en niet-betrokken aangrenzende dermis. Wanneer gekweekt in MMC-omgevingen in vitro, is geconstateerd dat hHSFs bepaalde kenmerken uitdrukken (d.w.z. mRNA, biochemie, fysiologie en fenotype) vergelijkbaar met huidhypertrofisch littekenweefsel in vivo. Het bewijs geeft aan dat fysische en chemische eigenschappen belangrijke overwegingen zijn bij het selecteren van crowders en het optimaliseren van MMC-omstandigheden voor teelt in vitro.
Voor proof-of-principle wordt het MMC-protocol hier toegepast om het vermogen van Shikonin en zijn analogen om apoptose te induceren kwalitatief en kwantitatief te evalueren. Dit maakt evaluatie van de potentiële toepassingen van deze natuurlijk afgeleide traditionele Chinese geneeskunde (TCM) verbindingen voor het beheer van dermale littekens13. Niettegenstaande voldoet de eenvoud, kosteneffectiviteit en actualiteit van dit in vitro MMC-protocol ook aan recente voorschriften om experimenten bij zoogdieren door de EU-richtlijn 2010/63/EU en het Amerikaanse Environmental Protection Agency (EPA) uit te bannen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol is gericht op het optimaliseren en verifiëren van een verbeterd :scar-in-a-jar” in vitro model voor menselijk huidlittekenweefsel. Eerdere studies hebben gemeld de toepassing van MMC techniek om menselijke longfibroblasten12, menselijke beenmerg mesenchymale stamcellen23, en menselijke dermale fibroblasten23 met behulp van dextran12, Ficoll12, en PVP23 als crowders….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door financiering van het Singaporese Agentschap voor Wetenschap, Technologie en Onderzoek “SPF 2013/004: Skin Biology Basic Research” en de “Wound Care Innovation for the Tropics” IAF-PP/2017 (HBMS) H17/01/a0/009. De auteurs dankbaar erkennen advies en hulp van Dr Paula Benny en Dr Michael Raghunath.
Materials
| 0.2 μm filter | Sartorius | 16534 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | P36962 | |
| Alexa Fluor 680 | Thermo Fisher Scientific | A-21076 | |
| Alexa Fluor 800 | Thermo Fisher Scientific | A-11371 | |
| alpha smooth muscle actin (αSMA) primary antibody | Abcam | ab5694 | |
| Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (thermal cycler ) | Thermo Fisher Scientific | 4351106 | |
| Ascorbic acid | Wako | #013-12061 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | #A2153 | |
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 500-0006 | |
| Collagen I primary antibody (for immunostaining) | Abcam | 6308 | |
| Collagen I primary antibody (for western blot) | Abcam | ab21286 | |
| Collagen III primary antibody | Abcam | ab7778 | |
| Collagen IV primary antibody | Abcam | ab6586 | |
| Direct Red 80 | Sigma-Aldrich | 2610108 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Life Technologies | 11996-065 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Life Technologies | 6000-044 | |
| Ficoll 400 | GE HealthCare | #17-0300-10 | |
| Ficoll 70 | GE HealthCare | #17-0310-10 | |
| GAPDH primary antibody | Sigma-Aldrich | G8795 | |
| Goat Anti-Rabbit secondary antibody | Abcam | ab97050 | |
| Human hypertrophic scar/normal fibroblasts (hHSF/hNSF) | Cell Research Corporation | 106, 107, 108 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | #1708890 | |
| MMP-1 primary antibody | Abcam | ab38929 | |
| MMP-13 primary antibody | Abcam | ab39012 | |
| MMP-2 primary antibody | Abcam | ab37150 | |
| MMP-9 primary antibody | Abcam | ab38898 | |
| NanoDrop Microvolume Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 10484060 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | NP0321BOX | |
| Odyssey blocking buffer | LI-COR Biosciences | 927–40000 | |
| Odyssey Fc Imaging System | LI-COR Biosciences | N/A | |
| Olympus IX-81 HCS microscope (for immunostaining) | Olympus | N/A | |
| Penicillin/streptomycin solution (P/S) | Life Technologies | 15140-122 | |
| PrimePCR Assays | Bio-Rad | Customized primers pre-coated in 96-well plates based on requirement | |
| Protease inhibitor cocktail (PIC) | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
| PVP 360 | Sigma | #PVP360 | |
| PVP 40 | Sigma | #PVP40 | |
| RIPA buffer | Merck | R0278 | |
| RNeasy Plus Mini Kit | QIAGEN | #74134 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 450022 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 450243 | |
| SpectraMax M5 Multi-Mode microplate reader | Molecular Devices | N/A | |
| SsoAdvanced universal SYBR green supermix | Bio-Rad | #172-5270 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 |
References
- vander Veer, W. M., et al. Potential cellular and molecular causes of hypertrophic scar formation. Burns. 35 (1), 15-29 (2009).
- Linge, C., et al. Hypertrophic Scar Cells Fail to Undergo a Form of Apoptosis Specific to Contractile Collagen[mdash]The Role of Tissue Transglutaminase. Journal of Investigative Dermatology. 125 (1), 72-82 (2005).
- Penn, J. W., Grobbelaar, A. O., Rolfe, K. J. The role of the TGF-beta family in wound healing, burns and scarring: a review. International Journal of Burns and Trauma. 2 (1), 18-28 (2012).
- Wang, X. Q., Kravchuk, O., Winterford, C., Kimble, R. M. The correlation of in vivo burn scar contraction with the level of alpha-smooth muscle actin expression. Burns. 37 (8), 1367-1377 (2011).
- Eitan, E., Zhang, S., Witwer, K. W., Mattson, M. P. Extracellular vesicle-depleted fetal bovine and human sera have reduced capacity to support cell growth. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 26373 (2015).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Kapalczynska, M., et al. 2D and 3D cell cultures – a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
- Lareu, R. R., Arsianti, I., Subramhanya, H. K., Yanxian, P., Raghunath, M. In vitro enhancement of collagen matrix formation and crosslinking for applications in tissue engineering: a preliminary study. Tissue Engineering. 13 (2), 385-391 (2007).
- Kuznetsova, I. M., Turoverov, K. K., Uversky, V. N. What macromolecular crowding can do to a protein. International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 23090-23140 (2014).
- Chen, C., Loe, F., Blocki, A., Peng, Y., Raghunath, M. Applying macromolecular crowding to enhance extracellular matrix deposition and its remodeling in vitro for tissue engineering and cell-based therapies. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 277-290 (2011).
- Zeiger, A. S., Loe, F. C., Li, R., Raghunath, M., Van Vliet, K. J. Macromolecular Crowding Directs Extracellular Matrix Organization and Mesenchymal Stem Cell Behavior. PloS one. 7 (5), 37904 (2012).
- Chen, C. Z., et al. The Scar-in-a-Jar: studying potential antifibrotic compounds from the epigenetic to extracellular level in a single well. British Journal of Pharmacology. 158 (5), 1196-1209 (2009).
- Fan, C., et al. Application of “macromolecular crowding” in vitro to investigate the naphthoquinones shikonin, naphthazarin and related analogues for the treatment of dermal scars. Chemico-Biological Interactions. 310, 108747 (2019).
- Canty, E. G., Kadler, K. E. Procollagen trafficking, processing and fibrillogenesis. Journal of Cell Science. 118, 1341-1353 (2005).
- Minton, A. P. Models for Excluded Volume Interaction between an Unfolded Protein and Rigid Macromolecular Cosolutes: Macromolecular Crowding and Protein Stability Revisited. Biophysical Journal. 88 (2), 971-985 (2005).
- Ernst, O., Zor, T. Linearization of the bradford protein assay. Journal of Visualized Experiments. (38), e1918 (2010).
- Beltrame, C. O., Cortes, M. F., Bandeira, P. T., Figueiredo, A. M. Optimization of the RNeasy Mini Kit to obtain high-quality total RNA from sessile cells of Staphylococcus aureus. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 48 (12), 1071-1076 (2015).
- Xue, M., Jackson, C. J. Extracellular Matrix Reorganization During Wound Healing and Its Impact on Abnormal Scarring. Advances in wound care (New Rochelle). 4 (3), 119-136 (2015).
- Rohani, M. G., Parks, W. C. Matrix remodeling by MMPs during wound repair. Matrix Biology. 44-46, 113-121 (2015).
- Ulrich, D., Ulrich, F., Unglaub, F., Piatkowski, A., Pallua, N. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in patients with different types of scars and keloids. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 63 (6), 1015-1021 (2010).
- Ghazizadeh, M., Tosa, M., Shimizu, H., Hyakusoku, H., Kawanami, O. Functional Implications of the IL-6 Signaling Pathway in Keloid Pathogenesis. Journal of Investigative Dermatology. 127 (1), 98-105 (2007).
- Wilgus, T. A., Ferreira, A. M., Oberyszyn, T. M., Bergdall, V. K., Dipietro, L. A. Regulation of scar formation by vascular endothelial growth factor. Laboratory Investigation. 88 (6), 579-590 (2008).
- Rashid, R., et al. Novel use for polyvinylpyrrolidone as a macromolecular crowder for enhanced extracellular matrix deposition and cell proliferation. Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (12), 994-1002 (2014).
- Lago, J. C., Puzzi, M. B. The effect of aging in primary human dermal fibroblasts. PloS one. 14 (7), 0219165 (2019).
- Cigognini, D., et al. Macromolecular crowding meets oxygen tension in human mesenchymal stem cell culture – A step closer to physiologically relevant in vitro organogenesis. Scientific Reports. 6, 30746 (2016).
- Cuttle, L., et al. A porcine deep dermal partial thickness burn model with hypertrophic scarring. Burns. 32 (7), 806-820 (2006).
- Fan, C., Xie, Y., Dong, Y., Su, Y., Upton, Z. Investigating the potential of Shikonin as a novel hypertrophic scar treatment. Journal of Biomedical Science. 22, 70 (2015).
- Fan, C., et al. Shikonin reduces TGF-beta1-induced collagen production and contraction in hypertrophic scar-derived human skin fibroblasts. International Journal of Molecular Medicine. 36 (4), 985-991 (2015).
- Werner, S., Krieg, T., Smola, H. Keratinocyte-Fibroblast Interactions in Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 127 (5), 998-1008 (2007).
