거대 분자 군중을 사용하여 인간의 절단 비대 흉터의 시험관 내 모델
Summary
이 프로토콜은 생체 외 조건에서 유사한 시험관 내 인간 비대 흉터 조직 모델을 만들기 위해 거대 분자 crowding의 사용을 설명합니다. 혼잡한 거대 분자 환경에서 재배될 때, 인간의 피부 섬유아세포는 흉터 조직을 닮은 표현형, 생화학, 생리학 및 기능적 특성을 나타낸다.
Abstract
생체 내 조직은 단백질, 핵산, 리보뉴클레오 단백질, 다당류 등에 의해 매우 혼잡한 것으로 나타났습니다. 다음 프로토콜은 시험관 내 세포 배양에 중성 중합체(crowders)를 첨가하여 이러한 생리적 군중을 모방하기 위해 거대 분자 crowding(MMC) 기술을 적용한다. 크라우드로 Ficoll 또는 dextran을 사용하여 이전 연구는 WI38 및 WS-1 세포주에서 콜라겐 I과 섬유넥틴의 발현이 MMC 기술을 사용하여 현저하게 향상된다는 것을 보여줍니다. 그러나, 이 기술은 1 차적인 비대 흉터 유래 인간 피부 섬유아세포 (hHSFs)에서 검증되지 않았습니다. 콜라겐의 과도한 증착로 인해 비대성 흉터가 발생함에 따라, 이 프로토콜은 hHSFs로 MMC 기술을 적용하여 시험관 내 비대 흉터 모델이 풍부한 콜라겐을 구성하는 것을 목표로 합니다. 이 최적화된 MMC 모델은 기존의 2차원(2-D) 세포 배양 시스템에 비해 생체 내 흉터 조직과 더 많은 유사성을 갖는다는 것을 보여주었다. 또한 동물 모델에 비해 비용 효율적이고 시간 효율적이며 윤리적으로 바람직합니다. 따라서 여기에 보고된 최적화된 모델은 비대 성 흉터 관련 연구를 위한 고급 “생체 내”모델을 제공합니다.
Introduction
흉터 조직은 조직 복구의 종점을 나타냅니다. 그러나, 많은 개인에서, 특히 화상이나 외상으로 고통받는 사람들1,흉터는 과도 할 수 있으며 치유 된 피부의 형태와 기능에 바람직하지 않은 영향을 미칠 수 있습니다. 병리학적(비대 흉터 및 켈로이드) 흉터 형성의 정확한 메커니즘은 완전히 이해되지 않지만, 상처 치유 시 콜라겐의 과도한 침착은 필수적인 기여로 입증되었다2.
성장 인자 베타 1 (TGF-β1)과 알파 평활근 액틴 (αSMA)을 변형시키는 것이 비대 흉터의 형성에 중요한 역할을한다는 것은 잘 확립되어 있습니다. 증거는 높은 TGF-β1이 SMAD 신호 통로를 조절해서 콜라겐의 과도한 침착을 직접 자극한다는 것을 시사한다3. 또한, αSMA는 상처 치유 과정에서 세포 수축 및 재피상화를 조절함으로써 비대성 흉터 형성에 기여하는 것으로 밝혀졌다4. 시험관 내 및 생체 내 모델의 부족은 흉터 치료에 대한 내정간섭 및 치료법을 개발하고 평가하는 데 큰 장애가 됩니다. 이 연구의 목적은 기존의 MMC 기술을 활용하여 신규 및 신흥 흉터 관련 개입을 평가하는 데 적합한 “생체 내 와 같은” 비대 흉터 모델을 구축하는 것입니다.
신체 외부의 살아있는 조직을 재현하는 것은 과학 계에서 수년 동안 목표였습니다. 20 세기 초에 체외 기술의 발달은 부분적으로 이 목표를 달성했습니다. 현재 시험관내 기술은 배아 세포가 따뜻한 식염수5에서며칠 동안 생체 내에서 살아남을 수 있다는 루의 원래 데모에서 약간 진화했다. 그러나, 시험관내 방법론은 대부분 2-D에서 재배된 단일 세포 유형으로 제한되며 생체 내에서 조직을 정확하게 재봉화하지 는 않는다. 세포 생화학, 생리학 및 유전학을 검사하는 데 유용하지만, 네이티브 조직은 3-D이며 여러 세포 유형을 통합합니다. 간단한 2-D 체외 시스템에서는 포유동물 세포를 고도로 인공적인 환경으로 적용하여 원어민 조직 특이적 아키텍처가 손실되는6. 차례로, 이것은 비정상적인 세포 형태, 생리학 및 행동7의결과로 세포 내 및 세포 외 사건에 영향을 미칩니다.
이 프로토콜뒤에 관심은 비대 흉터 및 켈로이드의 발달 그리고 임상 관리에 있습니다. 진피 섬유아세포가 흉터 조직에 존재하는 콜라겐의 풍부한 생산에 크게 책임이 있다는 것은 잘 확립되어 있지만, 생체내 2-D 시스템을 이용한 진피 섬유아세포 배양은 생체 내에서 관찰된 콜라겐의 회전율을 재현하지 못한다8. 현대 체외 방법은 여전히 본질적으로 “따뜻한 식염수”를 사용, 살아있는 조직에서 완전히 다른 환경. 생체 내 조직은 단백질, 핵산, 리보뉴클레오 단백질 및 다당류로 매우 혼잡하여 전체 부피의 5 %-40 %를 차지합니다. 두 분자가 동시에 동일한 공간을 차지할 수 없기 때문에 사용 가능한 공간이 거의 없으며 자유 물9이거의 완전하지 않습니다.
MMC 기술은 시토솔 및 간질 유체의 열역학적 특성에 영향을 미치는 제약 조건을 부과합니다. 분자 상호 작용, 수용체 -리간드 신호 복합체, 효소 및 세포기관은 자유롭게 상호 작용에서 제한됩니다9. pericellular 환경 내의 상호 작용 (즉, interstitium) 또한 제한됩니다. 최근의 증거는 혼잡한 용액에서 불활성 거대분자의 고농도가 확산, 물리적 연관, 점도 및 유체역학적성질(10)을확인한다.
흥미롭게도, 몇몇 대중적인 군집 에이전트 (즉, Ficoll, dextran, 폴리비닐피롤리돈 [PVP], 및 나트륨 4-스티렌설포네이트 [PSS])는 다른 세포 유형 및 다른 설정에 적용될 때 동등하지 않다. 한 이전 연구에서, Ficoll PVP에 비해 중간 엽 줄기 세포에 대 한 덜 세포 독성 것으로 보고 되었다. 이러한 결과는 중전하 및 상대적으로 작은 유체역학적반경(11)의결과로 해석되었다. 대조적으로, 두 번째 연구는 dextran이 Ficoll12에비해 인간 폐 섬유아세포에 의한 콜라겐 I 증착을 자극하는 데 더 효과적이라는 것을 발견했습니다. 우리 자신의 연구에서 데이터는 Ficoll이 비대 흉터 파생 섬유 아세포에 의한 콜라겐 침착을 향상시키는 반면 PVP는 이 세포에 독성이 있음을시사합니다 13.
프로콜라겐에서 콜라겐으로의 전환이 생체 내환경(14)에서더 빠르다는 것이 입증되었으며, 생물학적 반응의 속도는 희석된 2-D 배양시스템(15)에서지연된다. 우리는 여기에서 시험관 내 프로토콜을 최적화했습니다, 진피 섬유아세포의 경작을 보여주기 위하여 MMC를 통합하는 것은 진피 섬유증과 흉터 대형을 위한 더 “생체내” 모형으로 봉사하는. 일반적인 2-D 배양 시스템과는 달리, MMC를 사용하여 hHSFs를 배양하면 콜라겐의 생합성 및 침착을 현저하게자극하는 13. 특히, 섬유증의 다른 특성(즉, 매트릭스 금속종단백체족제[MMPs] 및 전염증성 사이토카인의 증가된 발현)도 이 최적화된 MMC프로토콜(13)에따라 명백하다. 이 방법을 사용하여 경작하면, 진피 세포가 생체 내에서 측정된 생리적, 생화학적 및 기능적 파라미터를 재환기시키는 것으로 나타났다.
최적화된 MMC 체외 프로토콜은 비대성 흉터 진피 및 관련되지 않은 인접 진피로부터 분리된 진피 섬유아세포에 의한 콜라겐 및 기타 ECM 단백질의 발현을 평가하는 데 사용되어 왔다. 시험관내 MMC 환경에서 재배될 때, hHSFs는 생체 내에서 진피 비후성 흉터 조직과 유사한 특정 특성(즉, mRNA, 생화학, 생리학 및 표현형)을 발현하는 것으로 관찰되었다. 증거는 군중을 선택하고 시험관에서 재배를위한 MMC 조건을 최적화 할 때 물리적 및 화학적 특성이 중요한 고려 사항임을 나타냅니다.
원리 증명을 위해, MMC 프로토콜은 세포 자멸을 유도하는 Shikonin 및 그것의 유사체의 능력을 질적으로 그리고 정량적으로 평가하기 위하여 여기에서 적용됩니다. 이것은 진피 흉터 를 관리하기위한 이러한 자연적으로 파생 된 중국 의학 (한의학) 화합물의 잠재적 인 응용 프로그램의 평가를 허용13. 그럼에도 불구하고, 이 시험관 내 MMC 프로토콜의 단순성, 비용 효율성 및 적시성은 EU 지침 2010/63/EU 및 미국 환경 보호국(EPA)에 의한 포유류 실험을 제거하기 위한 최근의 규정을 만족시고 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 인간 절단 흉터 조직에 대한 시험관 내 모델에서 개선 된 :scar-in-a-jar”을 최적화하고 인증하는 것을 목표로합니다. 이전 연구는 인간 폐섬유아세포(12)및 인간 골수 중간엽줄기세포(23)에MMC 기법을 적용한 것으로 보고하였고, 인간 진피섬유아세포(23)는 덱스트렌12,Ficoll12,및 PVP23을</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 싱가포르 과학 기술 연구 기관 “SPF 2013/004: 피부 생물학 기초 연구”와 “열대 지방을 위한 상처 관리 혁신” IAF-PP/2017 (HBMS) H17/01/a0/009의 자금 지원을 받았습니다. 저자들은 폴라 베니 박사와 마이클 라구나스 박사의 조언과 도움을 감사하게 도배합니다.
Materials
| 0.2 μm filter | Sartorius | 16534 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | P36962 | |
| Alexa Fluor 680 | Thermo Fisher Scientific | A-21076 | |
| Alexa Fluor 800 | Thermo Fisher Scientific | A-11371 | |
| alpha smooth muscle actin (αSMA) primary antibody | Abcam | ab5694 | |
| Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (thermal cycler ) | Thermo Fisher Scientific | 4351106 | |
| Ascorbic acid | Wako | #013-12061 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | #A2153 | |
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 500-0006 | |
| Collagen I primary antibody (for immunostaining) | Abcam | 6308 | |
| Collagen I primary antibody (for western blot) | Abcam | ab21286 | |
| Collagen III primary antibody | Abcam | ab7778 | |
| Collagen IV primary antibody | Abcam | ab6586 | |
| Direct Red 80 | Sigma-Aldrich | 2610108 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Life Technologies | 11996-065 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Life Technologies | 6000-044 | |
| Ficoll 400 | GE HealthCare | #17-0300-10 | |
| Ficoll 70 | GE HealthCare | #17-0310-10 | |
| GAPDH primary antibody | Sigma-Aldrich | G8795 | |
| Goat Anti-Rabbit secondary antibody | Abcam | ab97050 | |
| Human hypertrophic scar/normal fibroblasts (hHSF/hNSF) | Cell Research Corporation | 106, 107, 108 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | #1708890 | |
| MMP-1 primary antibody | Abcam | ab38929 | |
| MMP-13 primary antibody | Abcam | ab39012 | |
| MMP-2 primary antibody | Abcam | ab37150 | |
| MMP-9 primary antibody | Abcam | ab38898 | |
| NanoDrop Microvolume Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 10484060 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | NP0321BOX | |
| Odyssey blocking buffer | LI-COR Biosciences | 927–40000 | |
| Odyssey Fc Imaging System | LI-COR Biosciences | N/A | |
| Olympus IX-81 HCS microscope (for immunostaining) | Olympus | N/A | |
| Penicillin/streptomycin solution (P/S) | Life Technologies | 15140-122 | |
| PrimePCR Assays | Bio-Rad | Customized primers pre-coated in 96-well plates based on requirement | |
| Protease inhibitor cocktail (PIC) | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
| PVP 360 | Sigma | #PVP360 | |
| PVP 40 | Sigma | #PVP40 | |
| RIPA buffer | Merck | R0278 | |
| RNeasy Plus Mini Kit | QIAGEN | #74134 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 450022 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 450243 | |
| SpectraMax M5 Multi-Mode microplate reader | Molecular Devices | N/A | |
| SsoAdvanced universal SYBR green supermix | Bio-Rad | #172-5270 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 |
References
- vander Veer, W. M., et al. Potential cellular and molecular causes of hypertrophic scar formation. Burns. 35 (1), 15-29 (2009).
- Linge, C., et al. Hypertrophic Scar Cells Fail to Undergo a Form of Apoptosis Specific to Contractile Collagen[mdash]The Role of Tissue Transglutaminase. Journal of Investigative Dermatology. 125 (1), 72-82 (2005).
- Penn, J. W., Grobbelaar, A. O., Rolfe, K. J. The role of the TGF-beta family in wound healing, burns and scarring: a review. International Journal of Burns and Trauma. 2 (1), 18-28 (2012).
- Wang, X. Q., Kravchuk, O., Winterford, C., Kimble, R. M. The correlation of in vivo burn scar contraction with the level of alpha-smooth muscle actin expression. Burns. 37 (8), 1367-1377 (2011).
- Eitan, E., Zhang, S., Witwer, K. W., Mattson, M. P. Extracellular vesicle-depleted fetal bovine and human sera have reduced capacity to support cell growth. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 26373 (2015).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Kapalczynska, M., et al. 2D and 3D cell cultures – a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
- Lareu, R. R., Arsianti, I., Subramhanya, H. K., Yanxian, P., Raghunath, M. In vitro enhancement of collagen matrix formation and crosslinking for applications in tissue engineering: a preliminary study. Tissue Engineering. 13 (2), 385-391 (2007).
- Kuznetsova, I. M., Turoverov, K. K., Uversky, V. N. What macromolecular crowding can do to a protein. International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 23090-23140 (2014).
- Chen, C., Loe, F., Blocki, A., Peng, Y., Raghunath, M. Applying macromolecular crowding to enhance extracellular matrix deposition and its remodeling in vitro for tissue engineering and cell-based therapies. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 277-290 (2011).
- Zeiger, A. S., Loe, F. C., Li, R., Raghunath, M., Van Vliet, K. J. Macromolecular Crowding Directs Extracellular Matrix Organization and Mesenchymal Stem Cell Behavior. PloS one. 7 (5), 37904 (2012).
- Chen, C. Z., et al. The Scar-in-a-Jar: studying potential antifibrotic compounds from the epigenetic to extracellular level in a single well. British Journal of Pharmacology. 158 (5), 1196-1209 (2009).
- Fan, C., et al. Application of “macromolecular crowding” in vitro to investigate the naphthoquinones shikonin, naphthazarin and related analogues for the treatment of dermal scars. Chemico-Biological Interactions. 310, 108747 (2019).
- Canty, E. G., Kadler, K. E. Procollagen trafficking, processing and fibrillogenesis. Journal of Cell Science. 118, 1341-1353 (2005).
- Minton, A. P. Models for Excluded Volume Interaction between an Unfolded Protein and Rigid Macromolecular Cosolutes: Macromolecular Crowding and Protein Stability Revisited. Biophysical Journal. 88 (2), 971-985 (2005).
- Ernst, O., Zor, T. Linearization of the bradford protein assay. Journal of Visualized Experiments. (38), e1918 (2010).
- Beltrame, C. O., Cortes, M. F., Bandeira, P. T., Figueiredo, A. M. Optimization of the RNeasy Mini Kit to obtain high-quality total RNA from sessile cells of Staphylococcus aureus. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 48 (12), 1071-1076 (2015).
- Xue, M., Jackson, C. J. Extracellular Matrix Reorganization During Wound Healing and Its Impact on Abnormal Scarring. Advances in wound care (New Rochelle). 4 (3), 119-136 (2015).
- Rohani, M. G., Parks, W. C. Matrix remodeling by MMPs during wound repair. Matrix Biology. 44-46, 113-121 (2015).
- Ulrich, D., Ulrich, F., Unglaub, F., Piatkowski, A., Pallua, N. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in patients with different types of scars and keloids. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 63 (6), 1015-1021 (2010).
- Ghazizadeh, M., Tosa, M., Shimizu, H., Hyakusoku, H., Kawanami, O. Functional Implications of the IL-6 Signaling Pathway in Keloid Pathogenesis. Journal of Investigative Dermatology. 127 (1), 98-105 (2007).
- Wilgus, T. A., Ferreira, A. M., Oberyszyn, T. M., Bergdall, V. K., Dipietro, L. A. Regulation of scar formation by vascular endothelial growth factor. Laboratory Investigation. 88 (6), 579-590 (2008).
- Rashid, R., et al. Novel use for polyvinylpyrrolidone as a macromolecular crowder for enhanced extracellular matrix deposition and cell proliferation. Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (12), 994-1002 (2014).
- Lago, J. C., Puzzi, M. B. The effect of aging in primary human dermal fibroblasts. PloS one. 14 (7), 0219165 (2019).
- Cigognini, D., et al. Macromolecular crowding meets oxygen tension in human mesenchymal stem cell culture – A step closer to physiologically relevant in vitro organogenesis. Scientific Reports. 6, 30746 (2016).
- Cuttle, L., et al. A porcine deep dermal partial thickness burn model with hypertrophic scarring. Burns. 32 (7), 806-820 (2006).
- Fan, C., Xie, Y., Dong, Y., Su, Y., Upton, Z. Investigating the potential of Shikonin as a novel hypertrophic scar treatment. Journal of Biomedical Science. 22, 70 (2015).
- Fan, C., et al. Shikonin reduces TGF-beta1-induced collagen production and contraction in hypertrophic scar-derived human skin fibroblasts. International Journal of Molecular Medicine. 36 (4), 985-991 (2015).
- Werner, S., Krieg, T., Smola, H. Keratinocyte-Fibroblast Interactions in Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 127 (5), 998-1008 (2007).
