I Vitro Modell av Human Kutan Hypertrofisk Arrdannelse ved hjelp av makromolekylær trengsel
Summary
Denne protokollen beskriver bruken av makromolekylær trengsel for å skape en in vitro menneskelig hypertrofisk arrvevsmodell som ligner på vivo-forhold. Når dyrket i en overfylt makromolekylærmiljø, menneskelig hud fibroblaster viser fenotyper, biokjemi, fysiologi, og funksjonelle egenskaper som ligner arrvev.
Abstract
Det har vist seg at in vivo vev er svært overfylt av proteiner, nukleinsyrer, ribonucleoproteiner, polysakkarider, etc. Følgende protokoll bruker en makromolekylær trengsel (MMC) teknikk for å etterligne denne fysiologiske trengsel gjennom tillegg av nøytrale polymerer (crowders) til cellekulturer in vitro. Tidligere studier som bruker Ficoll eller dextran som crowders viser at uttrykket av kollagen I og fibronectin i WI38 og WS-1 cellelinjer er betydelig forbedret ved hjelp av MMC-teknikken. Denne teknikken er imidlertid ikke validert i primær hypertrofisk arr-avledet human hudfibroblaster (hHSFs). Som hypertrofisk arrdannelse oppstår fra overdreven avsetning av kollagen, har denne protokollen som mål å konstruere en kollagenrik in vitro hypertrofisk arrmodell ved å bruke MMC-teknikken med hHSFs. Denne optimaliserte MMC-modellen har vist seg å ha flere likheter med in vivo arrvev sammenlignet med tradisjonelle 2-dimensjonale (2D) cellekultursystemer. I tillegg er det kostnadseffektivt, tidseffektivt og etisk ønskelig sammenlignet med dyremodeller. Derfor tilbyr den optimaliserte modellen som er rapportert her, en avansert “in vivo-lignende” modell for hypertrofisk arrrelaterte studier.
Introduction
Arrvev representerer endepunktet for vevreparasjon. Men hos mange individer, spesielt de som lider av brannskader eller traumer1, kan arrdannelse være overdreven og pålegge uønskede effekter på morfologiog funksjon av helbredet hud. Selv om de eksakte mekanismene for patologiske (hypertrofiske arr og keloider) arrdannelse ikke er fullt ut forstått, har overdreven avsetning av kollagen under sårheling vist seg å være et viktig bidrag2.
Det er veletablert at transformere vekstfaktor beta 1 (TGF-β1) og alfa glatt muskel actin (αSMA) spille viktige roller i dannelsen av hypertrofiske arr. Bevis tyder på at forhøyet TGF-β1 direkte stimulerer overdreven avsetning av kollagen via regulere SMAD signalvei3. I tillegg har αSMA blitt funnet å bidra til hypertrofisk arrdannelse ved å regulere cellesammentrekning og reepithelialisering i sårhelingsprosessen4. Mangelen på egnede in vitro- og in vivo-modeller er et stort hinder for å utvikle og evaluere intervensjoner og terapier for arrutbedring. Målet med denne studien er å bruke den eksisterende MMC-teknikken til å konstruere en “in vivo-lignende” hypertrofisk arrmodell som er egnet for evaluering av nye og nye arrrelaterte intervensjoner.
Reprodusere levende vev utenfor kroppen har vært et mål i årevis i det vitenskapelige samfunnet. Utviklingen av in vitro teknikker i begynnelsen av det tjuende århundre delvis oppnådd dette målet. Nåværende in vitro teknikker har litt utviklet seg fra Roux opprinnelige demonstrasjon at embryonale celler kan overleve ex vivo i flere dager i varm saltvann5. In vitro-metodene er imidlertid for det meste begrenset til enkeltcelletyper dyrket i 2D og rekapitulerer ikke nøyaktig vev in vivo. Mens nyttig for å undersøke celle biokjemi, fysiologi, og genetikk, innfødte vev er 3D og innlemme flere celletyper. Enkle 2D in vitro systemer utsette pattedyr celler til svært kunstige miljøer der innfødt vev-spesifikk arkitektur er tapt6. I sin tur påvirker dette intracellulære og ekstracellulære hendelser, noe som resulterer i unormal cellemorfologi, fysiologi og atferd7.
Interessen bak denne protokollen ligger i utvikling og klinisk forvaltning av hypertrofiske arr og keloider. Mens det er veletablert at dermal fibroblaster er i stor grad ansvarlig for rikelig produksjon av kollagen er tilstede i arrvev, dyrke dermal fibroblaster ved hjelp av 2-D in vitro systemer ikke klarer å reprodusere omsetningen av kollagen observert i vivo8. Moderne in vitro metoder fortsatt i hovedsak bruke “varm saltvann”, et miljø helt forskjellig fra det i levende vev. Vev in vivo er ekstremt overfylt, med proteiner, nukleinsyrer, ribonucleoproteiner og polysakkarider, opptar 5%-40% av det totale volumet. Som ingen to molekyler kan okkupere samme plass samtidig, er det lite ledig plass tilgjengelig og et nesten fullstendig fravær av fritt vann9.
MMC-teknikken pålegger begrensninger som påvirker de termodynamiske egenskapene til cytosol og interstitielle væsker. Molekylære interaksjoner, reseptor-ligand signalering komplekser, enzymer, og organeller er begrenset og begrenset fra å samhandle fritt9. Interaksjoner i det pericellulære miljøet (dvs. interstitium) er også begrenset. Nyere bevis bekrefter at høye konsentrasjoner av inerte makromolekyler i overfylte løsninger perturb diffusjon, fysisk tilknytning, viskositet og hydrodynamiske egenskaper10.
Interessant, flere populære trengselagenter (dvs. Ficoll, dextran, polyvinylpyrrolidon [PVP], og natrium 4-styrensulfonat [PSS]) er ikke like når det brukes på forskjellige celletyper og i forskjellige innstillinger. I en tidligere studie ble Ficoll rapportert å være mindre cytotoksisk for mesenchymale stamceller sammenlignet med PVP. Disse resultatene ble tolket som konsekvensen av den nøytrale ladningen og relativt liten hydrodynamisk radius11. I motsetning fant en annen studie at dextran er mer effektiv i å stimulere kollagen jeg deponerer av humane lungefibroblaster sammenlignet med Ficoll12. Data fra vår egen studie tyder på at Ficoll forbedrer kollagenavsetning ved hypertrofisk arravledede fibroblaster, mens PVP er giftig for disse cellene13.
Det har blitt vist at konvertering av prokolen til kollagen er raskere i et svært overfylt in vivo-miljø14, mens frekvensen av biologiske reaksjoner er forsinket i et fortynnet 2D-kultursystem15. Vi har optimalisert in vitro-protokollen her, og innlemmer MMC for å vise dyrking av dermal fibroblaster som fungerer som en mer “in vivo-lignende” modell for dermal fibrose og arrdannelse. I motsetning til det vanlige 2D-kultursystemet stimulerer dyrking av hHSFs med MMC biosyntesen og avsetningen av kollagen betydelig13. Spesielt andre egenskaper av fibrose (dvs. økt uttrykk for matrise metalloproteinaser [MMPs] og proinflammatoriske cytokiner) er også tydelig under denne optimaliserte MMC-protokollen13. Når dyrket ved hjelp av denne metoden, er det vist at dermal celler rekapitulere fysiologiske, biokjemiske og funksjonelle parametere målt i vivo.
Den optimaliserte MMC in vitro-protokollen har blitt brukt til å evaluere uttrykket av kollagen og andre ECM-proteiner ved dermal fibroblaster isolert fra hypertrofisk arrdermis og uinvolvert tilstøtende dermis. Når dyrket i MMC miljøer in vitro, Det har blitt observert at hHSFs uttrykke visse egenskaper (dvs. mRNA, biokjemi, fysiologi, og fenotype) ligner dermal hypertrofisk arrvev i vivo. Bevisene indikerer at fysiske og kjemiske egenskaper er viktige hensyn når du velger crowders og optimaliserer MMC-forhold for dyrking in vitro.
For proof-of-principle brukes MMC-protokollen her for å kvalitativt og kvantitativt evaluere Shikonins evne og dets analoger til å indusere apoptose. Dette tillater evaluering av de potensielle anvendelsene av disse naturlig avledede tradisjonellkinesisk medisin (TCM) forbindelser for å administrere dermal arrdannelse13. Til tross for at enkelheten, kostnadseffektiviteten og aktualiteten til denne in vitro MMC-protokollen også tilfredsstiller nylige forskrifter for å eliminere eksperimentering hos pattedyr i EU-direktivet 2010/63/EU og US Environmental Protection Agency (EPA).
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen tar sikte på å optimalisere og autentisere en forbedret :arr-i-en-krukke” in vitro modell for menneskelig kutan arrvev. Tidligere studier har rapportert anvendelsen av MMC teknikk til humanlungefibroblaster12, human benmarg mesenchymal stamceller23, og menneskelige dermal fibroblaster23 ved hjelp av dextran12, Ficoll12, og PVP23 som crowders. I studien som ble…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av finansiering fra Singapores Agency for Science, Technology and Research “SPF 2013/004: Skin Biology Basic Research” og “Wound Care Innovation for the Tropics” IAF-PP/2017 (HBMS) H17/01/a0/009. Forfatterne anerkjenner takknemlig råd og hjelp fra Dr. Paula Benny og Dr. Michael Raghunath.
Materials
| 0.2 μm filter | Sartorius | 16534 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | P36962 | |
| Alexa Fluor 680 | Thermo Fisher Scientific | A-21076 | |
| Alexa Fluor 800 | Thermo Fisher Scientific | A-11371 | |
| alpha smooth muscle actin (αSMA) primary antibody | Abcam | ab5694 | |
| Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (thermal cycler ) | Thermo Fisher Scientific | 4351106 | |
| Ascorbic acid | Wako | #013-12061 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | #A2153 | |
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 500-0006 | |
| Collagen I primary antibody (for immunostaining) | Abcam | 6308 | |
| Collagen I primary antibody (for western blot) | Abcam | ab21286 | |
| Collagen III primary antibody | Abcam | ab7778 | |
| Collagen IV primary antibody | Abcam | ab6586 | |
| Direct Red 80 | Sigma-Aldrich | 2610108 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Life Technologies | 11996-065 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Life Technologies | 6000-044 | |
| Ficoll 400 | GE HealthCare | #17-0300-10 | |
| Ficoll 70 | GE HealthCare | #17-0310-10 | |
| GAPDH primary antibody | Sigma-Aldrich | G8795 | |
| Goat Anti-Rabbit secondary antibody | Abcam | ab97050 | |
| Human hypertrophic scar/normal fibroblasts (hHSF/hNSF) | Cell Research Corporation | 106, 107, 108 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | #1708890 | |
| MMP-1 primary antibody | Abcam | ab38929 | |
| MMP-13 primary antibody | Abcam | ab39012 | |
| MMP-2 primary antibody | Abcam | ab37150 | |
| MMP-9 primary antibody | Abcam | ab38898 | |
| NanoDrop Microvolume Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 10484060 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | NP0321BOX | |
| Odyssey blocking buffer | LI-COR Biosciences | 927–40000 | |
| Odyssey Fc Imaging System | LI-COR Biosciences | N/A | |
| Olympus IX-81 HCS microscope (for immunostaining) | Olympus | N/A | |
| Penicillin/streptomycin solution (P/S) | Life Technologies | 15140-122 | |
| PrimePCR Assays | Bio-Rad | Customized primers pre-coated in 96-well plates based on requirement | |
| Protease inhibitor cocktail (PIC) | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
| PVP 360 | Sigma | #PVP360 | |
| PVP 40 | Sigma | #PVP40 | |
| RIPA buffer | Merck | R0278 | |
| RNeasy Plus Mini Kit | QIAGEN | #74134 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 450022 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 450243 | |
| SpectraMax M5 Multi-Mode microplate reader | Molecular Devices | N/A | |
| SsoAdvanced universal SYBR green supermix | Bio-Rad | #172-5270 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 |
References
- vander Veer, W. M., et al. Potential cellular and molecular causes of hypertrophic scar formation. Burns. 35 (1), 15-29 (2009).
- Linge, C., et al. Hypertrophic Scar Cells Fail to Undergo a Form of Apoptosis Specific to Contractile Collagen[mdash]The Role of Tissue Transglutaminase. Journal of Investigative Dermatology. 125 (1), 72-82 (2005).
- Penn, J. W., Grobbelaar, A. O., Rolfe, K. J. The role of the TGF-beta family in wound healing, burns and scarring: a review. International Journal of Burns and Trauma. 2 (1), 18-28 (2012).
- Wang, X. Q., Kravchuk, O., Winterford, C., Kimble, R. M. The correlation of in vivo burn scar contraction with the level of alpha-smooth muscle actin expression. Burns. 37 (8), 1367-1377 (2011).
- Eitan, E., Zhang, S., Witwer, K. W., Mattson, M. P. Extracellular vesicle-depleted fetal bovine and human sera have reduced capacity to support cell growth. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 26373 (2015).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Kapalczynska, M., et al. 2D and 3D cell cultures – a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
- Lareu, R. R., Arsianti, I., Subramhanya, H. K., Yanxian, P., Raghunath, M. In vitro enhancement of collagen matrix formation and crosslinking for applications in tissue engineering: a preliminary study. Tissue Engineering. 13 (2), 385-391 (2007).
- Kuznetsova, I. M., Turoverov, K. K., Uversky, V. N. What macromolecular crowding can do to a protein. International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 23090-23140 (2014).
- Chen, C., Loe, F., Blocki, A., Peng, Y., Raghunath, M. Applying macromolecular crowding to enhance extracellular matrix deposition and its remodeling in vitro for tissue engineering and cell-based therapies. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 277-290 (2011).
- Zeiger, A. S., Loe, F. C., Li, R., Raghunath, M., Van Vliet, K. J. Macromolecular Crowding Directs Extracellular Matrix Organization and Mesenchymal Stem Cell Behavior. PloS one. 7 (5), 37904 (2012).
- Chen, C. Z., et al. The Scar-in-a-Jar: studying potential antifibrotic compounds from the epigenetic to extracellular level in a single well. British Journal of Pharmacology. 158 (5), 1196-1209 (2009).
- Fan, C., et al. Application of “macromolecular crowding” in vitro to investigate the naphthoquinones shikonin, naphthazarin and related analogues for the treatment of dermal scars. Chemico-Biological Interactions. 310, 108747 (2019).
- Canty, E. G., Kadler, K. E. Procollagen trafficking, processing and fibrillogenesis. Journal of Cell Science. 118, 1341-1353 (2005).
- Minton, A. P. Models for Excluded Volume Interaction between an Unfolded Protein and Rigid Macromolecular Cosolutes: Macromolecular Crowding and Protein Stability Revisited. Biophysical Journal. 88 (2), 971-985 (2005).
- Ernst, O., Zor, T. Linearization of the bradford protein assay. Journal of Visualized Experiments. (38), e1918 (2010).
- Beltrame, C. O., Cortes, M. F., Bandeira, P. T., Figueiredo, A. M. Optimization of the RNeasy Mini Kit to obtain high-quality total RNA from sessile cells of Staphylococcus aureus. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 48 (12), 1071-1076 (2015).
- Xue, M., Jackson, C. J. Extracellular Matrix Reorganization During Wound Healing and Its Impact on Abnormal Scarring. Advances in wound care (New Rochelle). 4 (3), 119-136 (2015).
- Rohani, M. G., Parks, W. C. Matrix remodeling by MMPs during wound repair. Matrix Biology. 44-46, 113-121 (2015).
- Ulrich, D., Ulrich, F., Unglaub, F., Piatkowski, A., Pallua, N. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in patients with different types of scars and keloids. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 63 (6), 1015-1021 (2010).
- Ghazizadeh, M., Tosa, M., Shimizu, H., Hyakusoku, H., Kawanami, O. Functional Implications of the IL-6 Signaling Pathway in Keloid Pathogenesis. Journal of Investigative Dermatology. 127 (1), 98-105 (2007).
- Wilgus, T. A., Ferreira, A. M., Oberyszyn, T. M., Bergdall, V. K., Dipietro, L. A. Regulation of scar formation by vascular endothelial growth factor. Laboratory Investigation. 88 (6), 579-590 (2008).
- Rashid, R., et al. Novel use for polyvinylpyrrolidone as a macromolecular crowder for enhanced extracellular matrix deposition and cell proliferation. Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (12), 994-1002 (2014).
- Lago, J. C., Puzzi, M. B. The effect of aging in primary human dermal fibroblasts. PloS one. 14 (7), 0219165 (2019).
- Cigognini, D., et al. Macromolecular crowding meets oxygen tension in human mesenchymal stem cell culture – A step closer to physiologically relevant in vitro organogenesis. Scientific Reports. 6, 30746 (2016).
- Cuttle, L., et al. A porcine deep dermal partial thickness burn model with hypertrophic scarring. Burns. 32 (7), 806-820 (2006).
- Fan, C., Xie, Y., Dong, Y., Su, Y., Upton, Z. Investigating the potential of Shikonin as a novel hypertrophic scar treatment. Journal of Biomedical Science. 22, 70 (2015).
- Fan, C., et al. Shikonin reduces TGF-beta1-induced collagen production and contraction in hypertrophic scar-derived human skin fibroblasts. International Journal of Molecular Medicine. 36 (4), 985-991 (2015).
- Werner, S., Krieg, T., Smola, H. Keratinocyte-Fibroblast Interactions in Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 127 (5), 998-1008 (2007).
