In Vitro Model af Human Kutan hypertrofisk ardannelse ved hjælp af makromolekylære fortrængning
Summary
Denne protokol beskriver brugen af makromolekylær fortrængning til at skabe en in vitro human hypertrofisk arvæv model, der ligner in vivo betingelser. Når de dyrkes i et overfyldt makromolekylært miljø, udviser hudfibroblaster fænotyper, biokemi, fysiologi og funktionelle egenskaber, der ligner arvæv.
Abstract
Det har vist sig, at in vivo væv er meget overfyldt af proteiner, nukleinsyrer, ribonukleoproteiner, polysaccharider, osv. Følgende protokol anvender en makromolekylær fortrængning (MMC) teknik til at efterligne denne fysiologiske fortrængning gennem tilsætning af neutrale polymerer (crowders) til cellekulturer in vitro. Tidligere undersøgelser ved hjælp af Ficoll eller dextran som crowders viser, at udtrykket af kollagen I og fibronectin i WI38 og WS-1 cellelinjer er væsentligt forbedret ved hjælp af MMC teknik. Men, denne teknik er ikke blevet valideret i primære hypertrofiske ar-afledte menneskelige hud fibroblaster (hHSFs). Som hypertrofisk ardannelse opstår fra overdreven aflejring af kollagen, denne protokol har til formål at konstruere en kollagen-rige i vitro hypertrofisk ar model ved at anvende MMC teknik med hHSFs. Denne optimerede MMC model har vist sig at have flere ligheder med in vivo arvæv sammenlignet med traditionelle 2-dimensionelle (2-D) cellekultur systemer. Desuden er det omkostningseffektivt, tidseffektivt og etisk ønskeligt i forhold til dyremodeller. Derfor, den optimerede model rapporteret her tilbyder en avanceret “in vivo-lignende” model for hypertrofisk ar-relaterede undersøgelser.
Introduction
Arvæv repræsenterer slutpunktet for vævreparation. Men, i mange individer, især dem, der lider af forbrændinger eller traumer1, ardannelse kan være overdreven og pålægge uønskede virkninger på morfologi og funktion af helbredt hud. Selv om de nøjagtige mekanismer for patologiske (hypertrofiske ar og keloids) ardannelse ikke er fuldt forstået, overdreven aflejring af kollagen under sårheling har vist sig at være et væsentligt bidrag2.
Det er veletableret, at omdanne vækstfaktor beta 1 (TGF-β1) og alpha glat muskel actin (αSMA) spiller centrale roller i dannelsen af hypertrofiske ar. Tyder på, at forhøjet TGF-β1 direkte stimulerer overdreven aflejring af kollagen via regulering af SMAD signalering vej3. Desuden har αSMA vist sig at bidrage til hypertrofisk ardannelse ved at regulere cellesammentrækning og reepithelialisering i sårhelingsprocessen4. Manglen på egnede in vitro- og in vivo-modeller er en væsentlig hindring for at udvikle og evaluere interventioner og behandlingsformer for aroprydning. Formålet med denne undersøgelse er at udnytte den eksisterende MMC teknik til at konstruere en “in vivo-lignende” hypertrofisk ar model, der er egnet til evaluering af nye og nye ar-relaterede interventioner.
Gengivelse levende væv uden for kroppen har været et mål i årevis i det videnskabelige samfund. Udviklingen af in vitro-teknikker i begyndelsen af det tyvende århundrede nåede til dels dette mål. Nuværende in vitro teknikker har lidt udviklet sig fra Roux oprindelige demonstration af, at embryonale celler kan overleve ex vivo i flere dage i varmt saltvand5. In vitro-metoder er dog for det meste begrænset til enkeltcelletyper, der dyrkes i 2D, og desammenfatter ikke nøjagtigt væv in vivo. Mens nyttige for at undersøge celle biokemi, fysiologi, og genetik, indfødte væv er 3-D og indarbejde flere celletyper. Simple 2D in vitro-systemer udsætter pattedyrceller for meget kunstige miljøer, hvor den oprindelige vævsspecifikke arkitektur går tabt6. Til gengæld påvirker dette intracellulære og ekstracellulære hændelser, hvilket resulterer i unormal cellemorfologi, fysiologi og adfærd7.
Interessen bag denne protokol ligger i udvikling og klinisk forvaltning af hypertrofiske ar og keloider. Selv om det er veletableret, at dermal fibroblaster er i vid udstrækning ansvarlig for den rigelige produktion af kollagener til stede i arvæv, dyrke dermal fibroblaster ved hjælp af 2-D in vitro-systemer undlader at reproducere omsætningen af kollagen observeret i vivo8. Moderne in vitro metoder stadig hovedsagelig bruge “varm saltvand”, et miljø helt forskellig fra det i levende væv. Væv in vivo er ekstremt overfyldt, med proteiner, nukleinsyrer, ribonukleoproteiner, og polysaccharider, besætter 5%-40% af den samlede volumen. Da der ikke er to molekyler, der kan besætte den samme plads på samme tid, er der ikke meget ledig plads til rådighed og en næsten fuldstændig mangel på frit vand9.
MMC-teknikken pålægger begrænsninger, der påvirker cytosol- og interstitielle væskers termodynamiske egenskaber. Molekylære interaktioner, receptor-ligand signalering komplekser, enzymer, og organeller er begrænset fra at interagere frit9. Interaktioner inden for det pericellulære miljø (dvs. interstitium) er også begrænset. Nylige beviser bekræfter, at høje koncentrationer af inerte makromolekyler i overfyldte opløsninger perturb diffusion, fysisk association, viskositet og hydrodynamiske egenskaber10.
Interessant, flere populære fortrængning agenter (dvs. Ficoll, dextran, polyvinylpyrrolidon [PVP], og natrium 4-styrensulfonat [PSS]) er ikke ækvivalente, når de anvendes på forskellige celletyper og i forskellige indstillinger. I en tidligere undersøgelse blev Ficoll rapporteret at være mindre cytotoksisk for mesenkymale stamceller sammenlignet med PVP. Disse resultater blev fortolket som en følge af denneutrale ladning og den relativt lille hydrodynamiske radius11. I modsætning hertil viste en anden undersøgelse, at dextran er mere effektiv til at stimulere kollagen jeg aflejring er aflejring af menneskerlungefibroblaster i forhold til Ficoll12. Data fra vores egen undersøgelse tyder på, at Ficoll forbedrer kollagen aflejring af hypertrofisk ar-afledte fibroblaster, mens PVP er giftigt for disse celler13.
Det er blevet påvist , at omdannelsen af procollagen til kollagen er hurtigere i et meget overfyldt in vivo-miljø14, mens antallet af biologiske reaktioner er forsinket i et fortyndet 2D-kultursystem15. Vi har optimeret in vitro-protokollen her, der omfatter MMC at vise dyrkning af dermal fibroblaster tjener som en mere “in vivo-lignende” model for dermal fibrose og ar dannelse. I modsætning til den fælles 2-D kultur system, dyrke hHSFs med MMC stimulerer biosyntese og aflejring af kollagen betydeligt13. Især andre karakteristika ved fibrose (dvs. øget ekspression af matrix metalloproteinaser [MMPs] og proinflammatoriske cytokiner) er også tydelige under denne optimerede MMC protokol13. Når det dyrkes ved hjælp af denne metode, er det påvist, at dermale celler opsummerer de fysiologiske, biokemiske og funktionelle parametre målt in vivo.
Den optimerede MMC in vitro protokol er blevet brugt til at evaluere ekspressionen af kollagen og andre ECM proteiner ved dermal fibroblaster isoleret fra hypertrofisk ar dermis og uinvolveret tilstødende dermis. Når det dyrkes i MMC miljøer in vitro, er det blevet observeret, at hHSFs udtrykke visse egenskaber (dvs. mRNA, biokemi, fysiologi, og fænotype) svarende til dermal hypertrofisk arvæv i vivo. Beviserne tyder på, at fysiske og kemiske egenskaber er vigtige overvejelser, når man vælger crowdere og optimereMMC betingelser for dyrkning in vitro.
For proof-of-princip, MMC protokollen anvendes her til kvalitativt og kvantitativt vurdere evne Shikonin og dens analoger til at fremkalde apoptose. Dette gør det muligt at vurdere de potentielle anvendelser af disse naturligt afledte traditionel kinesisk medicin (TCM) forbindelser til forvaltning af dermal ardannelse13. Uanset, at enkelheden, omkostningseffektiviteten og aktualiteten af denne in vitro MMC-protokol også opfylder de seneste regler for at eliminere forsøg med pattedyr i HENHOLD til EU-direktiv 2010/63/EU og DET Amerikanske Miljøbeskyttelsesagentur (EPA).
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol har til formål at optimere og godkende en forbedret : ar-i-en-krukke “in vitro model for menneskelige kutanarvæv. Tidligere undersøgelser har rapporteret anvendelsen af MMC teknik til mennesker lunge fibroblaster12, menneskelige knoglemarv mesenkymale stamceller23, og menneskelige dermal fibroblaster23 ved hjælp af dextran12, Ficoll12, og PVP23 som crowders. I …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af midler fra Singapores Agentur for Videnskab, Teknologi og Forskning “SPF 2013/004: Skin Biology Basic Research” og “Wound Care Innovation for tropics” IAF-PP/2017 (HBMS) H17/01/a0/009. Forfatterne taknemmeligt anerkende råd og bistand fra Dr. Paula Benny og Dr. Michael Raghunath.
Materials
| 0.2 μm filter | Sartorius | 16534 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | P36962 | |
| Alexa Fluor 680 | Thermo Fisher Scientific | A-21076 | |
| Alexa Fluor 800 | Thermo Fisher Scientific | A-11371 | |
| alpha smooth muscle actin (αSMA) primary antibody | Abcam | ab5694 | |
| Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (thermal cycler ) | Thermo Fisher Scientific | 4351106 | |
| Ascorbic acid | Wako | #013-12061 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | #A2153 | |
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 500-0006 | |
| Collagen I primary antibody (for immunostaining) | Abcam | 6308 | |
| Collagen I primary antibody (for western blot) | Abcam | ab21286 | |
| Collagen III primary antibody | Abcam | ab7778 | |
| Collagen IV primary antibody | Abcam | ab6586 | |
| Direct Red 80 | Sigma-Aldrich | 2610108 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Life Technologies | 11996-065 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Life Technologies | 6000-044 | |
| Ficoll 400 | GE HealthCare | #17-0300-10 | |
| Ficoll 70 | GE HealthCare | #17-0310-10 | |
| GAPDH primary antibody | Sigma-Aldrich | G8795 | |
| Goat Anti-Rabbit secondary antibody | Abcam | ab97050 | |
| Human hypertrophic scar/normal fibroblasts (hHSF/hNSF) | Cell Research Corporation | 106, 107, 108 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | #1708890 | |
| MMP-1 primary antibody | Abcam | ab38929 | |
| MMP-13 primary antibody | Abcam | ab39012 | |
| MMP-2 primary antibody | Abcam | ab37150 | |
| MMP-9 primary antibody | Abcam | ab38898 | |
| NanoDrop Microvolume Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 10484060 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | NP0321BOX | |
| Odyssey blocking buffer | LI-COR Biosciences | 927–40000 | |
| Odyssey Fc Imaging System | LI-COR Biosciences | N/A | |
| Olympus IX-81 HCS microscope (for immunostaining) | Olympus | N/A | |
| Penicillin/streptomycin solution (P/S) | Life Technologies | 15140-122 | |
| PrimePCR Assays | Bio-Rad | Customized primers pre-coated in 96-well plates based on requirement | |
| Protease inhibitor cocktail (PIC) | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
| PVP 360 | Sigma | #PVP360 | |
| PVP 40 | Sigma | #PVP40 | |
| RIPA buffer | Merck | R0278 | |
| RNeasy Plus Mini Kit | QIAGEN | #74134 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 450022 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 450243 | |
| SpectraMax M5 Multi-Mode microplate reader | Molecular Devices | N/A | |
| SsoAdvanced universal SYBR green supermix | Bio-Rad | #172-5270 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 |
References
- vander Veer, W. M., et al. Potential cellular and molecular causes of hypertrophic scar formation. Burns. 35 (1), 15-29 (2009).
- Linge, C., et al. Hypertrophic Scar Cells Fail to Undergo a Form of Apoptosis Specific to Contractile Collagen[mdash]The Role of Tissue Transglutaminase. Journal of Investigative Dermatology. 125 (1), 72-82 (2005).
- Penn, J. W., Grobbelaar, A. O., Rolfe, K. J. The role of the TGF-beta family in wound healing, burns and scarring: a review. International Journal of Burns and Trauma. 2 (1), 18-28 (2012).
- Wang, X. Q., Kravchuk, O., Winterford, C., Kimble, R. M. The correlation of in vivo burn scar contraction with the level of alpha-smooth muscle actin expression. Burns. 37 (8), 1367-1377 (2011).
- Eitan, E., Zhang, S., Witwer, K. W., Mattson, M. P. Extracellular vesicle-depleted fetal bovine and human sera have reduced capacity to support cell growth. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 26373 (2015).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Kapalczynska, M., et al. 2D and 3D cell cultures – a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
- Lareu, R. R., Arsianti, I., Subramhanya, H. K., Yanxian, P., Raghunath, M. In vitro enhancement of collagen matrix formation and crosslinking for applications in tissue engineering: a preliminary study. Tissue Engineering. 13 (2), 385-391 (2007).
- Kuznetsova, I. M., Turoverov, K. K., Uversky, V. N. What macromolecular crowding can do to a protein. International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 23090-23140 (2014).
- Chen, C., Loe, F., Blocki, A., Peng, Y., Raghunath, M. Applying macromolecular crowding to enhance extracellular matrix deposition and its remodeling in vitro for tissue engineering and cell-based therapies. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 277-290 (2011).
- Zeiger, A. S., Loe, F. C., Li, R., Raghunath, M., Van Vliet, K. J. Macromolecular Crowding Directs Extracellular Matrix Organization and Mesenchymal Stem Cell Behavior. PloS one. 7 (5), 37904 (2012).
- Chen, C. Z., et al. The Scar-in-a-Jar: studying potential antifibrotic compounds from the epigenetic to extracellular level in a single well. British Journal of Pharmacology. 158 (5), 1196-1209 (2009).
- Fan, C., et al. Application of “macromolecular crowding” in vitro to investigate the naphthoquinones shikonin, naphthazarin and related analogues for the treatment of dermal scars. Chemico-Biological Interactions. 310, 108747 (2019).
- Canty, E. G., Kadler, K. E. Procollagen trafficking, processing and fibrillogenesis. Journal of Cell Science. 118, 1341-1353 (2005).
- Minton, A. P. Models for Excluded Volume Interaction between an Unfolded Protein and Rigid Macromolecular Cosolutes: Macromolecular Crowding and Protein Stability Revisited. Biophysical Journal. 88 (2), 971-985 (2005).
- Ernst, O., Zor, T. Linearization of the bradford protein assay. Journal of Visualized Experiments. (38), e1918 (2010).
- Beltrame, C. O., Cortes, M. F., Bandeira, P. T., Figueiredo, A. M. Optimization of the RNeasy Mini Kit to obtain high-quality total RNA from sessile cells of Staphylococcus aureus. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 48 (12), 1071-1076 (2015).
- Xue, M., Jackson, C. J. Extracellular Matrix Reorganization During Wound Healing and Its Impact on Abnormal Scarring. Advances in wound care (New Rochelle). 4 (3), 119-136 (2015).
- Rohani, M. G., Parks, W. C. Matrix remodeling by MMPs during wound repair. Matrix Biology. 44-46, 113-121 (2015).
- Ulrich, D., Ulrich, F., Unglaub, F., Piatkowski, A., Pallua, N. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in patients with different types of scars and keloids. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 63 (6), 1015-1021 (2010).
- Ghazizadeh, M., Tosa, M., Shimizu, H., Hyakusoku, H., Kawanami, O. Functional Implications of the IL-6 Signaling Pathway in Keloid Pathogenesis. Journal of Investigative Dermatology. 127 (1), 98-105 (2007).
- Wilgus, T. A., Ferreira, A. M., Oberyszyn, T. M., Bergdall, V. K., Dipietro, L. A. Regulation of scar formation by vascular endothelial growth factor. Laboratory Investigation. 88 (6), 579-590 (2008).
- Rashid, R., et al. Novel use for polyvinylpyrrolidone as a macromolecular crowder for enhanced extracellular matrix deposition and cell proliferation. Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (12), 994-1002 (2014).
- Lago, J. C., Puzzi, M. B. The effect of aging in primary human dermal fibroblasts. PloS one. 14 (7), 0219165 (2019).
- Cigognini, D., et al. Macromolecular crowding meets oxygen tension in human mesenchymal stem cell culture – A step closer to physiologically relevant in vitro organogenesis. Scientific Reports. 6, 30746 (2016).
- Cuttle, L., et al. A porcine deep dermal partial thickness burn model with hypertrophic scarring. Burns. 32 (7), 806-820 (2006).
- Fan, C., Xie, Y., Dong, Y., Su, Y., Upton, Z. Investigating the potential of Shikonin as a novel hypertrophic scar treatment. Journal of Biomedical Science. 22, 70 (2015).
- Fan, C., et al. Shikonin reduces TGF-beta1-induced collagen production and contraction in hypertrophic scar-derived human skin fibroblasts. International Journal of Molecular Medicine. 36 (4), 985-991 (2015).
- Werner, S., Krieg, T., Smola, H. Keratinocyte-Fibroblast Interactions in Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 127 (5), 998-1008 (2007).
