Summary
हम परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) का उपयोग करके आर्टिकुलर उपास्थि में सेलुलर स्तर पर प्रारंभिक ऑस्टियोआर्थर्मेटिक परिवर्तनों की जांच करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
कोशिकाओं और ऊतकों के जैव यांत्रिक गुण न केवल उनके आकार और कार्य को विनियमित करते हैं बल्कि उनकी जीवन शक्ति को बनाए रखने के लिए भी महत्वपूर्ण हैं। लोच में परिवर्तन कैंसर या ऑस्टियोआर्थराइटिस (ओए) जैसी प्रमुख बीमारियों की शुरुआत का प्रचार या ट्रिगर कर सकते हैं। परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) गुणात्मक और मात्रात्मक रूप से सूक्ष्म पैमाने पर विशिष्ट जैविक लक्ष्य संरचनाओं के जैव यांत्रिक गुणों की विशेषता के लिए एक मजबूत उपकरण के रूप में उभरा है, जो पिकोन्यूटन से माइक्रोन्यूटन तक छोटी सीमा में बलों को मापने के लिए है। मस्कुलोस्केलेटल ऊतकों में बायोमैकेनिकल गुणों का विशेष महत्व है, जो उच्च स्तर के तनाव के अधीन हैं। उपास्थि की अपक्षयी बीमारी के रूप में ओए के परिणामस्वरूप पेरिकोशियलर मैट्रिक्स (पीसीएम) और उनके बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) में एम्बेडेड कॉन्ड्रोसाइट्स की स्थानिक पुनर्व्यवस्था में व्यवधान होता है। पीसीएम और ईसीएम में व्यवधान उपास्थि के जैव यांत्रिक गुणों में परिवर्तन के साथ जुड़ा हुआ है। वर्तमान अध्ययन में हमने कोन्ड्रोसाइट्स के विशिष्ट स्थानिक पैटर्न परिवर्तनों के संबंध में इन परिवर्तनों की मात्रा निर्धारित करने के लिए एएफएम का उपयोग किया। प्रत्येक पैटर्न परिवर्तन के साथ, पीसीएम और ईसीएम दोनों के लिए लोच में महत्वपूर्ण परिवर्तन देखे गए। स्थानीय लोच को मापने इस प्रकार ओए में स्थानीय ऊतक पतन की डिग्री के बारे में सीधे निष्कर्ष निकालने के लिए अनुमति देता है।
Introduction
आर्टिकुलर उपास्थि एक अवास्कुलर, एन्यूरल टिश्यू है। विरल रूप से बिखरे हुए कॉन्ड्रोसाइट्स एक विशाल बाह्य मेट्रिक्स (ईसीएम) का उत्पादन, व्यवस्थित और बनाए रखते हैं जिसमें वे एम्बेडेड होते हैं। ईसीएम के एक अलग और विशेष भाग के रूप में, कॉन्ड्रोसाइट्स विशेष मैट्रिक्स की एक पतली परत से घिरे हुए हैं जिसे पेरिसेल्युलर मैट्रिक्स (पीसीएम) के रूप में जाना जाता है। पीसीएम एक मेचनोसेंसिटिव सेल-मैट्रिक्स इंटरफेस1 के रूप में कार्य करता है जो कॉन्ड्रोसाइट्स2 की रक्षा करता है और उनके बायोसिंथेटिक रिस्पांस3को मिलाता है। जैसा कि पहले वर्णित4,स्वस्थ उपास्थि में, कॉन्ड्रोसाइट्स विशिष्ट, विशिष्ट स्थानिक पैटर्न में व्यवस्थित किए जाते हैं जो प्रत्येक ऊतक परत और संयुक्त4,,5 के लिए विशिष्ट होते हैं और संयुक्त-विशिष्ट यांत्रिक लोडिंग तंत्र6पर निर्भर करते हैं। ये पैटर्न स्वस्थ उपास्थि में जोड़े और तार से ऑस्टियोआर्थराइटिस (ओए) की शुरुआत के साथ डबल स्ट्रिंग ्स तक बदल जाते हैं। रोग की आगे की प्रगति के साथ कोन्ड्रोसाइट्स छोटे समूह ों का निर्माण करते हैं, जो उन्नत ओए में बड़े समूहों में आकार में धीरे-धीरे बढ़ते हैं। किसी भी संगठनात्मक संरचना का पूर्ण नुकसान और एपोप्टोसिस को शामिल करना अंतिम चरण में देखा जाता है। इस प्रकार, कोन्ड्रोसाइट सेलुलर व्यवस्था का उपयोग ओए प्रगति4के लिए छवि आधारित बायोमार्कर के रूप में किया जा सकता है।
कोशिकाओं और ऊतकों के जैव यांत्रिक गुण न केवल उनके आकार और कार्य को विनियमित करते हैं बल्कि उनकी जीवन शक्ति को बनाए रखने के लिए भी महत्वपूर्ण हैं। लोच में परिवर्तन कैंसर या ओए जैसी प्रमुख बीमारियों की शुरुआत का प्रचार या ट्रिगर कर सकते हैं। परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) गुणात्मक और मात्रात्मक रूप से एक सूक्ष्म पैमाने पर विशिष्ट जैविक लक्ष्य संरचनाओं के जैव यांत्रिक गुणों की विशेषता के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में उभरा है, जो पिकोन्यूटन से माइक्रोन्यूटन तक बल की एक विस्तृत श्रृंखला को मापता है। एएफएम का प्रमुख अनुप्रयोग सबनैनोमीटर रिज़ॉल्यूशन7पर नमूनों की सतह स्थलाकृति और यांत्रिक गुणों को मापना है । माप उपकरण में तीन मुख्य घटक होते हैं: 1) एक एएफएम जांच, जो एक तेज टिप है जो कैंटिलीवर पर चढ़कर है और इसका उपयोग नमूने की सतह के साथ सीधी बातचीत के लिए किया जाता है। जब बल कैंटिलीवर पर लागू होता है, तो मापा ऊतक के गुणों के अनुसार उत्तरार्द्ध का विरूपण होता है। 2) एक ऑप्टिकल सिस्टम जो कैंटिलीवर पर लेजर बीम प्रोजेक्ट करता है, जिसे तब डिटेक्टर यूनिट में परिलक्षित किया जाता है। 3) एक फोटोडायोड डिटेक्टर जो कैंटिलीवर से विक्षेपित प्रकाश को पकड़ता है। यह कैंटिलीवर द्वारा लेजर विक्षेप के बारे में प्राप्त जानकारी को एक बल वक्र में परिवर्तित करता है जिसका विश्लेषण किया जा सकता है।
इस प्रकार, एएफएम का मुख्य सिद्धांत एएफएम जांच और नमूने के लक्ष्य संरचना के बीच कार्य करने वाले बल का पता लगाना है। प्राप्त बल घटता लोच, चार्ज वितरण, चुंबकीकरण, उपज तनाव, और लोचदार प्लास्टिक विरूपण गतिशीलता8जैसे नमूना सतह पर लक्ष्य संरचनाओं के यांत्रिक गुणों का वर्णन करते हैं। अन्य इमेजिंग तकनीकों पर एएफएम का एक महत्वपूर्ण लाभ यह है कि एएफएम का उपयोग ऊतक ों को नुकसान पहुंचाए बिना एक देशी राज्य में मध्यम या ऊतकों में लाइव कोशिकाओं के यांत्रिक गुणों को मापने के लिए किया जा सकता है। एएफएम तरल या शुष्क दोनों स्थितियों में काम कर सकता है। सैंपल तैयार करने की कोई जरूरत नहीं है। एएफएम एक नमूने को छवि बनाने और शारीरिक परिस्थितियों के पास मौजूद नमूनों में एक साथ अपने यांत्रिक गुणों को मापने की संभावना प्रदान करता है। वर्तमान अध्ययन में हम देशी आर्टिकुलर उपास्थि में पीसीएम और ईसीएम की लोच को मापने के द्वारा ओए प्रगति का आकलन करने के लिए एक उपन्यास दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं। स्थानीय ऊतक पतन की डिग्री के साथ chondrocytes के स्थानिक संगठन के सहसंबंध OA के जल्दी पता लगाने के लिए एक पूरी तरह से नया परिप्रेक्ष्य प्रदान करता है । इन पैटर्न की कार्यात्मक प्रासंगिकता का मूल्यांकन अब तक नहीं किया गया है, लेकिन । क्योंकि आर्टिकुलर उपास्थि का प्रमुख कार्य कम घर्षण पर लोड असर होता है, ऊतक में लोचदार गुण होने चाहिए। एएफएम न केवल ईसीएम की लोच को मापने की अनुमति देता है बल्कि उनके पीसीएम में एम्बेडेड स्थानिक सेलुलर पैटर्न की भी अनुमति देता है। कॉन्ड्रोसाइट्स के स्थानिक पैटर्न परिवर्तन के साथ लोच का मनाया संबंध इतना मजबूत है कि अकेले लोच को मापने से स्थानीय ऊतक पतन के स्तरीकरण की अनुमति हो सकती है।
पीसीएम और ईसीएम के लोचदार मोडुली का मूल्यांकन 35 माइक्रोन-थिन खंडों में किया गया था, जो एक उल्टे चरण विपरीत माइक्रोस्कोप में एकीकृत एएफएम प्रणाली का उपयोग करके एकीकृत था जिसने उपास्थि नमूने के एक साथ दृश्य की अनुमति दी थी। यह प्रोटोकॉल हमारी प्रयोगशाला9 से पहले से प्रकाशित एक अध्ययन पर आधारित है और विशेष रूप से वर्णन करता है कि कैसे chondrocytes की स्थानिक व्यवस्था की विशेषता है और कैसे उनके जुड़े पीसीएम और ECM की लोच को मापने के लिए । कॉन्ड्रोसाइट्स के प्रत्येक पैटर्न परिवर्तन के साथ, लोच में महत्वपूर्ण परिवर्तन भी पीसीएम और ईसीएम दोनों के लिए देखे जा सकते हैं, जिससे इस तकनीक का उपयोग उपास्थि के पतन के चरण को सीधे मापने के लिए किया जा सकता है।
यह मान्य दृष्टिकोण स्थूल ऊतक क्षरण वास्तव में प्रकट होने से पहले प्रारंभिक चरणों में ओए प्रगति और चिकित्सीय प्रभावों का मूल्यांकन करने का एक नया तरीका खोलता है। लगातार एएफएम माप प्रदर्शन एक दुरूह प्रक्रिया है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल में हम बताते हैं कि एएफएम द्वारा मापा जाने वाला नमूना कैसे तैयार किया जाए, कैंटिलीवर की तैयारी से शुरू होने वाले वास्तविक एएफएम मापन को कैसे करें, एएफएम को कैसे कैलिब्रेट करें, और फिर माप कैसे करें। कदम-दर-कदम निर्देश विश्वसनीय डेटा प्राप्त करने और प्रसंस्करण और व्याख्या के लिए बुनियादी रणनीतियां प्रदान करने के लिए एक स्पष्ट और संक्षिप्त दृष्टिकोण देते हैं। चर्चा अनुभाग भी इस कठोर विधि के सबसे आम नुकसान का वर्णन करता है और उपयोगी समस्या निवारण युक्तियां प्रदान करता है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
मानव उपास्थि नमूने जर्मनी के तुईबिंगेन विश्वविद्यालय अस्पताल के हड्डी रोग सर्जरी विभाग में कुल घुटने आर्थ्रोप्लास्टी से गुजर रहे रोगियों और घुटने के अंतिम चरण के लिए जर्मनी के विंगहोफर-अस्पताल, सड़ेबर्ग ए.एन., जर्मनी से प्राप्त किए गए थे । अध्ययन शुरू होने से पहले पूर्ण विभागीय, संस्थागत और स्थानीय नैतिक समिति की मंजूरी प्राप्त की गई (परियोजना संख्या 674/2016BO2)। भागीदारी से पहले सभी रोगियों से लिखित सूचित सहमति प्राप्त हुई थी । यह तरीके अनुमोदित दिशा-निर्देशों के अनुसार किए गए थे ।
1. नमूना तैयारी
- क्रायोटोम सेक्शनिंग के लिए उपास्थि तैयार करना
- घुटने के जोड़ में अपक्षयी परिवर्तनों का मूल्यांकन करने के लिए, रोगियों से ऊतक रिसेक्शन के बाद भ्रूण के लोड-असर क्षेत्र से प्राप्त आर्टिकुलर उपास्थि नमूने लें।
नोट: जिन नमूनों की जांच की जाती है, उनमें अभी भी कम से कम उपकॉन्ड्टल बोन की पतली परत होनी चाहिए ताकि आंतरिक और बाहरी सतह के संबंध में ऊतक अभिविन्यास की स्पष्ट पहचान की अनुमति दी जा सके, इस प्रकार सर्वोच्च उपास्थि परत की मानकीकृत ऊतक फसल की अनुमति भी दी जा सके। उपास्थि सर्जरी के बाद 24 घंटे तक एएफएम माप के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । ऊतक को उपयोग से पहले 2% (v/v) पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन और 1.2% (v/v) एम्फोटेरिसिन बी के साथ सीरम-मुक्त डुल्बेकको के संशोधित ईगल के माध्यम (डीएमईएम) में संग्रहित किया जा सकता है। 24 घंटे से अधिक के लिए नमूनों का भंडारण ऊतक सूजन के कारण AFM माप में कलाकृतियों का कारण बन सकता है, लेकिन । - एक स्केलपेल की मदद से सबकॉन्ड्टल हड्डी से एक पूरे के रूप में आर्टिकुलर उपास्थि में कटौती और बाद में क्रायोटोम डिवाइस में कम तापमान के तहत जमा देता है कि क्रायोटोम घुंडी पर पानी में घुलनशील एम्बेडिंग माध्यम में उपास्थि नमूना एंबेड ।
नोट: जमे हुए माध्यम ऊतक यह ढंके स्थिर । इसके परिणामस्वरूप एम्बेडिंग माध्यम के साथ-साथ उपास्थि नमूने को भी ठंड में शामिल किया जाता है। हड्डी से उपास्थि काटते समय, ऊतक के अभिविन्यास को ट्रैक करें। क्रायोसेक्शन के लिए एम्बेडेड ऊतक को इस तरह से रखा जाना चाहिए कि उपास्थि की शीर्ष परत (यानी, आर्टिकुलर सतह) ब्लेड का सामना करती है। ध्यान रहे कि टिश्यू को एम्बेडिंग मीडियम से पूरी तरह कवर करना होता है।
- घुटने के जोड़ में अपक्षयी परिवर्तनों का मूल्यांकन करने के लिए, रोगियों से ऊतक रिसेक्शन के बाद भ्रूण के लोड-असर क्षेत्र से प्राप्त आर्टिकुलर उपास्थि नमूने लें।
- उपास्थि की क्रायोटोम सेक्शनिंग
- एक मानक क्रायोटोम का उपयोग करके, ऊतक को 35 माइक्रोन की मोटाई पर क्रमबद्ध करें, जो कि जमे हुए पानी में घुलनशील एम्बेडिंग माध्यम में एम्बेडेड है।
नोट: कुल मिलाकर, 300 माइक्रोन तक (जो लगभग नौ वर्गों से मेल खाती है) को अनुभागित किया जा सकता है और विश्लेषण के लिए उपयोग किया जा सकता है। 300 माइक्रोन की प्रस्तावित सीमा दृश्य प्रवेश गहराई से मेल खाती है जिसे आमतौर पर आर्टिकुलर उपास्थि जैसे हाइलिन उपास्थि में फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के साथ प्राप्त किया जा सकता है। इस प्रकार, प्रमुख स्थानीय स्थानिक पैटर्न के अनुसार उपास्थि को सॉर्ट करना और फिर संबंधित वर्गों में इन पैटर्न को मापना संभव है। - एक ग्लास स्लाइड पर वर्गों को इकट्ठा करें और पानी में घुलनशील एम्बेडिंग माध्यम को हटाने के लिए फॉस्फेट-बफर्ड लवण (पीबीएस) के साथ धाराओं 3x को कुल्ला करें।
- एक मानक क्रायोटोम का उपयोग करके, ऊतक को 35 माइक्रोन की मोटाई पर क्रमबद्ध करें, जो कि जमे हुए पानी में घुलनशील एम्बेडिंग माध्यम में एम्बेडेड है।
- एक एएफएम संगत पेट्री डिश पर उपास्थि वर्गों की ग्लूिंग
नोट: क्योंकि एएफएम नमूने पर यांत्रिक इंडेंटेशन द्वारा डेटा इकट्ठा करता है, सटीक माप के लिए अनुमति देने के लिए अनुभागों को तय करने की आवश्यकता होती है।- धीरे से ऊतक संस्कृति व्यंजन है कि AFM डिवाइस के साथ संगत कर रहे है पर जैव संगत नमूना गोंद के साथ ३५ μm मोटी वर्गों गोंद । ऐसा करने के लिए, गोंद की 2−3 बूंदें लें और उन्हें उस स्थान पर ऊतक संस्कृति पकवान पर रखें जहां अनुभाग का किनारा खत्म हो जाएगा। अब उपास्थि अनुभाग को गोंद पर रखें और इसे ऊतक संस्कृति पकवान की सतह पर मजबूती से चिपकाने की अनुमति दें।
नोट: hyaline आर्टिकुलर उपास्थि के ३५ μm मोटी वर्गों कर्लिंग के लिए बहुत प्रवण नहीं हैं । हालांकि, यदि बफर माध्यम से नमूनों को हटाने के दौरान कर्लिंग होता है, तो सुनिश्चित करें कि जितना संभव हो उतना तरल पदार्थ नमूनों से चिपक जाए। जैसे ही अतिरिक्त पानी सूख गया है, सीधे गोंद के बिखरे हुए स्थानों पर ऊतक फैल गया ताकि यह सेल संस्कृति पकवान की सतह पर तय हो जाए। गोंद केवल नमूने के किनारों पर एक पतली परत में लागू किया जाता है न कि पूरे खंड पर। माप के साथ हस्तक्षेप गोंद की संभावना को खत्म करने के लिए गोंद क्षेत्र से दूर है कि नमूना के केवल उस हिस्से को मापने। - गोंद और ऊतक को ठीक से बांड करने की अनुमति देने के लिए 2 न्यूनतम के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर वर्गों को इनक्यूबेट करें। फिर एल-ग्लूटामाइन के बिना और सोडियम बाइकार्बोनेट के बिना लीबोविट्ज के एल-15 माध्यम के साथ वर्गों को कवर करें ताकि वे पूरी तरह से जलमग्न हो जाएं।
नोट: निर्धारण या अपर्याप्त गोंद आवेदन के दौरान नमूने की अचानक गतिविधियों आम गलतियां है कि संस्कृति पकवान से ऊतक टुकड़ी में परिणाम कर रहे हैं । इसके अलावा, Leibowitz माध्यम लागू करने के लिए एक कोमल तरीके से किया जाना चाहिए, ताकि "तरंगों" माध्यम द्वारा बनाई गई के कारण सतह से नमूना अलग नहीं है । - माप न होने तक मानक सेल कल्चर इनक्यूबेटर में चिपके हुए वर्गों के साथ पेट्री डिश को 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
नोट: सुनिश्चित करें कि ऊतक वर्ग स्थिर हैं और प्रत्येक चरण को धीरे-धीरे प्रदर्शन करके ऊतक संस्कृति पकवान की सतह से अलग न करें।
- धीरे से ऊतक संस्कृति व्यंजन है कि AFM डिवाइस के साथ संगत कर रहे है पर जैव संगत नमूना गोंद के साथ ३५ μm मोटी वर्गों गोंद । ऐसा करने के लिए, गोंद की 2−3 बूंदें लें और उन्हें उस स्थान पर ऊतक संस्कृति पकवान पर रखें जहां अनुभाग का किनारा खत्म हो जाएगा। अब उपास्थि अनुभाग को गोंद पर रखें और इसे ऊतक संस्कृति पकवान की सतह पर मजबूती से चिपकाने की अनुमति दें।
2. कैंटिलीवर तैयारी (माइक्रोस्फीयर चिपकाना)
- एएफएम डिवाइस तैयार करना और माइक्रोस्फीयर को कमजोर करना
- हवा माप के लिए निर्दिष्ट ग्लास ब्लॉक पर कैंटिलीवर रखें, इसे वसंत के साथ ठीक करें, और एएफएम सिर पर ग्लास ब्लॉक माउंट करें।
- 100% इथेनॉल (100 कण/10 माइक्रोन) में माइक्रोस्फीयर को पतला करें और 10 एस के लिए अल्ट्रासोनीकेट करें, ताकि माइक्रोस्फीयर अलग हो जाएं और एक साथ झुरमुट न करें।
- ग्लूटिंग के लिए सेटअप तैयार करना
- 70% इथेनॉल के साथ एक ग्लास स्लाइड साफ करें और इसे एएफएम डिवाइस पर नमूना धारक पर माउंट करें।
नोट: स्लाइड की सफाई धूल के धब्बे को रोकती है जो स्लाइड की सतह पर जमने से ग्लूइंग प्रक्रिया में हस्तक्षेप कर सकती है। - स्लाइड के बीच में माइक्रोस्फीयर सस्पेंशन के 2 माइक्रोनल रखें और माइक्रोस्फीयर सस्पेंशन के पास गोंद के 2 माइक्रोन।
नोट: माइक्रोस्फीयर निलंबन और गोंद को एक दूसरे के करीब रखने की सिफारिश गोंद और माइक्रोस्फीयर के बीच कैंटिलीवर के त्वरित संक्रमण के लिए अनुमति देने की है। यदि गोंद में कैंटिलीवर सूई और एक माइक्रोस्फीयर के साथ संपर्क बनाने के बीच संक्रमण बहुत लंबा है, गोंद अंततः कठोर हो जाएगा, जिससे अपने चिपकने वाला गुण खोने । - माइक्रोस्फीयर सस्पेंशन एयर-ड्राई में इथेनॉल लिक्विड को जगह दें, जिससे माइक्रोस्फीयर हो जाएं।
- 70% इथेनॉल के साथ एक ग्लास स्लाइड साफ करें और इसे एएफएम डिवाइस पर नमूना धारक पर माउंट करें।
- कैंटिलीवर टिप पर माइक्रोस्फीयर चिपकाना
- टिप गोंद द्वारा कवर किया जाता है जब तक 10 μm चरणों में स्टेपपर मोटर की मदद से गोंद में मैन्युअल रूप से कैंटिलीवर डुबकी। इस कदम को तेजी से करें, क्योंकि गोंद तेजी से सूख जाता है।
- कैंटिलीवर को फिर से 100 माइक्रोमीटर से वापस लें, इसे माइक्रोस्फीयर की ओर ले जाएं, और कैंटिलीवर टिप को सीधे एक माइक्रोस्फीयर से ऊपर रखें।
- टेबल 1में दिखाए गए मापदंडों के साथ चयनित माइक्रोस्फीयर पर कैंटिलीवर टिप को डुबोने के लिए एक बल स्पेक्ट्रोस्कोपी माप चलाएं।
नोट: इस कदम को निष्पादित करके, माइक्रोस्फीयर की सतह का एक माप कैंटिलीवर की नोक और माइक्रोस्फीयर के बीच संपर्क स्थापित करने के लिए उपयोग किया जाता है। तालिका 1 में दिखाया गया अपेक्षाकृत लंबा संपर्क समय गोंद और माइक्रोस्फीयर के बीच पर्याप्त संबंध समय के लिए अनुमति देता है। इस चरण के दौरान प्राप्त बल-दूरी वक्र कैंटिलीवर टिप पर माइक्रोस्फीयर को चिपकाने के उप-उत्पाद के रूप में उत्पन्न होता है और आगे के विश्लेषण के लिए संसाधित नहीं होता है। - एक बार एक माइक्रोस्फीयर कैंटिलीवर से जुड़ा हुआ है, तो शीर्ष पर चढ़कर कैंटिलीवर के साथ ग्लास ब्लॉक को वापस लेना और फिर माइक्रोस्कोप से एएफएम सिर हटा दें। अंत में, एएफएम हेड से ग्लास ब्लॉक और कैंटिलीवर को अमाउंट।
- 2 घंटे के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर कैंटिलीवर इनक्यूबेट करें और माप शुरू करने से पहले इसे आरटी पर रात भर सूखने दें।
नोट: कैंटिलीवर के इनक्यूबेशन गोंद के चिपकने वाले गुणों को बढ़ाता है, जिससे कैंटिलीवर-माइक्रोस्फीयर-कॉम्प्लेक्स अधिक स्थिर हो जाता है।
3. माप के लिए एएफएम डिवाइस तैयार करना
- एएफएम धारक पर तरल वातावरण में मापने के लिए निर्दिष्ट ग्लास ब्लॉक को समायोजित करें ताकि ऊपरी सतह सीधे और एएफएम धारक के समानांतर हो।
- चिमटी की मदद से, ग्लास ब्लॉक की सतह पर चयनित कैंटिलीवर को ध्यान से माउंट करें, ताकि माइक्रोस्फीयर के साथ एएफएम टिप पॉलिश ऑप्टिकल प्लेन पर फैल जाए।
नोट: है cantilever टिप पॉलिश विमान पर फैलाना करने के लिए फोटोडिटेक्टर पर है AFM लेजर प्रतिबिंबित करने में सक्षम होने की जरूरत है । एएफएम पर कैंटिलीवर रखते समय बहुत सावधान रहें ताकि ग्लास ब्लॉक की पॉलिश ऑप्टिकल सतह को खरोंच न किया जा सके। ग्लास ब्लॉक को खरोंचने से लेजर संरेखण को समायोजित करने में कठिनाइयों हो सकती है और बाद के माप में हस्तक्षेप हो सकता है। - क्योंकि कैंटिलीवर यांत्रिक दबाव के अधीन होगा, इसे जगह में तय करने की आवश्यकता है। ब्लॉक के नाली में धातु के वसंत फिसलने और चिमटी की मदद से वसंत के साथ कैंटिलीवर के शीर्ष क्लैंपिंग द्वारा ग्लास ब्लॉक पर कैंटिलीवर को स्थिर करें।
- ध्यान से एएफएम हेड पर कैंटिलीवर के साथ ग्लास ब्लॉक रखें और इसे एकीकृत लॉकिंग तंत्र के साथ सुरक्षित करें। सुनिश्चित करें कि वसंत बाईं ओर का सामना कर रहा है ताकि कैंटिलीवर को सही अभिविन्यास में रखा जा सके। इसके बाद एएफएम डिवाइस पर कैंटिलीवर के साथ एएफएम हेड को माउंट करें ।
4. कैंटिलीवर का नमूना और अंशांकन लोड करना
नोट: यहां, डिवाइस का अंशांकन बिना किसी नमूना ऊतक के लीबोविट्ज के माध्यम से भरे पेट्री डिश की साफ सतह पर एक बल वक्र चलाकर किया जाता है। अंशांकन भी नमूने के बिना केवल AFM माध्यम के साथ भरा एक अलग नियंत्रण AFM पकवान का उपयोग करके किया जा सकता है ।
- एएफएम डिवाइस पर नमूना बढ़ते
- एएफएम नमूना धारक पर चरण 1.3.3 में तैयार पेट्री डिश रखें।
- पेट्री डिश हीटर चालू करें और इसे 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें। ऊतक संस्कृति पकवान इष्टतम तापमान (यानी, 20 न्यूनतम) तक पहुंचने की अनुमति दें।
- एएफएम हेड में मीडियम के कंडेनेशन से बचने के लिए कैंटिलीवर असेंबली के बेस पर प्रोटेकिंग फॉयल रखें।
- डिवाइस का अंशांकन
- सॉफ्टवेयर(सामग्री की तालिका),लेजर संरेखण खिड़की के बाद खोलें, और दृष्टिकोण पैरामीटर सेटिंग्स का चित्रण करने वाली खिड़की। इसके बाद स्टेपर मोटर, लेजर लाइट और सीसीडी-कैमरा चालू कर दें।
- कैंटिलीवर की कल्पना और पहचान करने के लिए माइक्रोस्कोप पर सीसीडी-कैमरा का उपयोग करें। स्टेपपर मोटर फ़ंक्शन का उपयोग करके, 100 माइक्रोन चरणों में कैंटिलीवर को कम करें जब तक कि कैंटिलीवर माध्यम में पूरी तरह से जलमग्न न हो जाए।
नोट: तरल में कैंटिलीवर का जलमग्न होना सीसीडी-कैमरा के माध्यम से नेत्रहीन पहचानयोग्य है। जब यह पानी की सतह को तोड़ता है, तो कैंटिलीवर टिप पानी में आसानी से ध्यान देने योग्य परिपत्र प्रतिबिंब बनाता है। - समायोजन शिकंजा का उपयोग कर कैंटिलीवर के शीर्ष पर लेजर को निर्देशित करें।
नोट: शिकंजा को ओवरविंड न करें, क्योंकि इससे लेजर अलाइनमेंट तंत्र को नुकसान होगा। कैंटिलीवर को नीचे से देखा जाता है और ऊपर से लेजर बीम आती है। - एक बार लेजर कैंटिलीवर पर तैनात है, एएफएम डिवाइस में शिकंजा की मदद से लेजर बीम समायोजित इतना है कि परिलक्षित बीम फोटोडिटेक्टर के केंद्र पर गिर जाता है । लेजर संरेखण समारोह का उपयोग कर लेजर बीम की स्थिति की निगरानी रखें।
नोट: डिटेक्टर कैंटिलीवर द्वारा परिलक्षित लेजर बीम के विक्षेप को उठाता है और इसे एक विद्युत संकेत में परिवर्तित करता है। - लेजर-कैंटिलीवर एडजस्टमेंट के बाद योग सिग्नल 1 वी या उससे ऊपर होना चाहिए जबकि पार्श्व और वर्टिकल डिफ्लेक्शन 0 के करीब होना चाहिए। यदि इन मूल्यों को प्राप्त नहीं कर रहे हैं, फोटोडिटेक्टर समायोजित करें ।
- अंशांकन बल वक्र प्राप्त करना
- माप शुरू करने के लिए एएफएम डिश पर सतह तक पहुंचने के लिए, तालिका 2में दिए गए दृष्टिकोण मापदंडों के साथ एक स्कैनर दृष्टिकोण चलाएं। एक बार ऊतक संस्कृति पकवान के नीचे तक पहुंच गया है, १०० μm द्वारा कैंटिलीवर वापस लेना ।
नोट: इस बिंदु पर जांच ऊतक संस्कृति पकवान के नीचे से ऊपर ठीक १०० μm है । - रन पैरामीटर सेट करें और तालिका 3में प्रदर्शित मापदंडों को समायोजित करें। एक माप शुरू करने और एक अंशांकन बल-दूरी वक्र प्राप्त करने के लिए रन बटन पर क्लिक करें।
नोट: यहां प्राप्त बल वक्र चित्रा 1में दिखाया गया है । - अंशांकन बल-दूरी वक्र पर, सॉफ्टवेयर में मुकर गए वक्र के रैखिक फिट के लिए क्षेत्र का चयन करें।
नोट: रैखिक फिट कैंटिलीवर की संवेदनशीलता को मापने के लिए किया जाता है। एक बार रैखिक फिट जगह में है, मूल्यों सॉफ्टवेयर द्वारा बचाया जाएगा । वसंत निरंतर माप या कैंटिलीवर के थर्मल शोर की गणना बाद में सॉफ्टवेयर द्वारा की जाती है। - चूंकि माप 37 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर मध्यम रूप से किए जाते हैं, इसलिए शारीरिक स्थितियों की यथासंभव बारीकी से नकल करने के लिए सॉफ्टवेयर में तापमान परिवर्तनीय 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
नोट: अंशांकन के अंत तक, ऊर्ध्वाधर विक्षेप को वोल्ट (वी) के बजाय बल, न्यूटन (एन) की इकाई में सहेजा और प्रदर्शित किया जाता है, जो फोटोडायोड डिटेक्टर द्वारा मूल पंजीकरण की इकाई है।
- माप शुरू करने के लिए एएफएम डिश पर सतह तक पहुंचने के लिए, तालिका 2में दिए गए दृष्टिकोण मापदंडों के साथ एक स्कैनर दृष्टिकोण चलाएं। एक बार ऊतक संस्कृति पकवान के नीचे तक पहुंच गया है, १०० μm द्वारा कैंटिलीवर वापस लेना ।
5. एएफएम के माध्यम से लोच माप प्रदर्शन करके ईसीएम और पीसीएम का बायोमैकेनिकल लक्षण वर्णन
- उपास्थि अनुभाग में कोन्ड्रोसाइट पैटर्न की पहचान करना
- एएफएम सिस्टम में एकीकृत चरण विपरीत माइक्रोस्कोप के तहत उपास्थि अनुभाग का निरीक्षण करें और ऑस्टियोआर्थरिक घुटने से आर्टिकुलर उपास्थि के विशिष्ट सेलुलर पैटर्न10 की पहचान करें: एकल तार (स्वस्थ ऊतक क्षेत्र), डबल तार (शुरुआत ऊतक पतन), छोटे और बड़े समूह (दोनों उन्नत ऊतक पतन)। देखें चित्र 2ए-डी।
- एक बार विशिष्ट वांछित पैटर्न की पहचान हो जाने के बाद, प्रति मैट्रिक्स प्रकार (पीसीएम या ईसीएम) प्रति चुने गए पैटर्न में दो साइटों को मापें और प्रत्येक माप साइट(चित्रा 2ई, एफ)पर नौ माप पुनरावृत्ति करें। संभावित अशुद्धियों के लिए खाते में पर्याप्त एक नमूना आकार सुनिश्चित करें।
नोट: पीसीएम मापन के लिए, कोशिकाओं के करीब निकटता में कैंटिलीवर रखें (जैसा कि चित्रा 2ई, एफमें लाल घेरे द्वारा दिखाया गया है)। ईसीएम के मापों का संचालन करने के लिए, किसी भी कोशिकाओं के बिना एक क्षेत्र का चयन करें (चित्रा 2ई, एफमें नीले क्षेत्र द्वारा दिखाया गया है) और चरण 5.2 में वर्णित इंडेंटेशन का प्रदर्शन करें।
- लक्षित स्थल का इंडेंटेशन
- एक पीछे हटने के बाद एक दृष्टिकोण करें ताकि कैंटिलीवर ऊतक के ऊपर 100 माइक्रोन तैनात हो, जो बाद के मापों के लिए शुरुआती स्थिति होगी।
- पैटर्न के पीसीएम या ईसीएम पर ध्यान केंद्रित करने के लिए मापा और उस बिंदु पर कंप्यूटर माउस को ठीक किया जाएगा ।
नोट: माउस इंडेंटेशन के लक्ष्य स्थल के लिए एक दृश्य मार्कर के रूप में काम करेगा। एक बार जब फोकस कैंटिलीवर टिप में बदल जाता है, तो ऊतक संरचनाएं अविवेच्य या धुंधली हो जाएंगी। - अब जांच पर ध्यान केंद्रित करें और जांच की नोक को पहले कंप्यूटर तीर द्वारा तय बिंदु पर ले जाएं। इसके बाद, कैंटिलीवरके अंशांकन द्वारा प्राप्त सेट पॉइंट पैरामीटर का उपयोग करके रन के साथ माप शुरू करें।
नोट: एक ही स्ट्रिंग के पीसीएम को मापने से प्राप्त एक अनुकरणीय बल वक्र पूरक चित्रा 1में दिखाया गया है ।
6. डेटा प्रोसेसिंग
नोट: लोचदार मॉड्यूलस का डेटा विश्लेषण या निर्धारण हर्ट्ज मॉडल का उपयोग करके किया जाता है जैसा कि पहले11,12वर्णित था । टिप पर माइक्रोस्फीयर के उपयोग के कारण इंडेटर का आकार गोलाकार था और पॉइसन का अनुपात पिछले साहित्य13,,14,,15के आधार पर 0.5 पर रखा गया था।
- एएफएम डिवाइस से प्राप्त डेटा के साथ संगत डेटा प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर(सामग्री की तालिका)खोलें।
- बल-दूरी घटता प्रसंस्करण के लिए सॉफ्टवेयर में हर्ट्ज मॉडल का चयन करें। पॉइसन अनुपात को 0.5 पर सेट करें और टिप आकार को गोलाकार और 12.5 माइक्रोन के टिप त्रिज्या के रूप में चुनें।
- एक बार जब सभी पैरामीटर समायोजित हो जाते हैं, तो परिणाम फिट हो जाते हैं, और युवा के मॉड्यूलस की गणना और सॉफ्टवेयर द्वारा प्रदर्शित किया जाता है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
तार से डबल स्ट्रिंग तक फिजियोथेरेपोलॉजिकल मॉडल के साथ, छोटे और अंत में बड़े समूहों के लिए, दोनों ईसीएम(चित्रा 3A)और पीसीएम(चित्रा 3B)लोचदार मोडली प्रत्येक पैटर्न परिवर्तन के बीच काफी कम हो गए। एकमात्र अपवाद तार और डबल स्ट्रिंग (पी = 0.072) के बीच ईसीएम में अंतर था। परिणाम बताते हैं कि ईसीएम/पीसीएम अनुपात(चित्रा 4 बी)में काफी परिवर्तन नहीं हुआ, जबकि ईसीएम और पीसीएम के बीच लोच में पूर्ण अंतर में उल्लेखनीय कमी देखी गई(चित्रा 4A)। इसके अलावा, परिणाम ईसीएम/पीसीएम अनुपात या संबद्ध सेलुलर स्थानिक परिवर्तन (आर = -0.099, पी = 0.281) से संबंधित कोई महत्वपूर्ण संघ नहीं दिखाते हैं।
चित्रा 1: एएफएम संपर्क मोड में एक बल-दूरी वक्र का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। के रूप में जांच सतह दृष्टिकोण, बलों को भी पहली बार में टिप का एक औसत दर्जे का विक्षेप देने के लिए छोटे हैं, इस प्रकार अपनी अशान्त स्थिति (1) में टिप जा रहा है । फिर, जब कैंटिलीवर नमूने के बहुत करीब होता है, टिप और जांच के बीच सक्रिय चिपकने वाली ताकतों के कारण, कैंटिलीवर वास्तव में जल्दी से नमूने (2) की ओर तस्वीरें करता है। जांच के साथ और नमूना आ रहा है, प्रतिकारक विक्षेप तो दिशा के आंदोलन के खिलाफ चेहरे, ऊंचाई और विक्षेप के एक लगभग रैखिक समारोह के साथ जब तक ऊर्ध्वाधर विक्षेप रिश्तेदार सेट बिंदु मूल्य (3) तक पहुंचता है । जब मुकर (4), कम विक्षेपित बलों के अलावा, आसंजन बलों भी मौजूद हैं, जबकि कैंटिलीवर नमूने से जेड-धुरी में मुकर जाता है । के रूप में AFM जांच से नमूना के साथ संपर्क खींच लिया है, यह पहली बार हो जाता है "अटक" इससे पहले कि यह इंटरफेस पर आसंजन से ढीला करने में सक्षम है, यहां तक कि cantilever के एक छोटे नकारात्मक विक्षेप के लिए अग्रणी, फिर से जांच (5) के साथ संपर्क के बिना अपनी अनसुनी तटस्थ स्थिति तक पहुंचने से पहले । नैनोन्यूटन में व्यक्त कैंटिलीवर पर काम करने वाले बल में विक्षेप की सीमा व्यक्त की जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: कॉन्ड्रोसाइट्स के प्रतिनिधि स्थानिक लक्षण वर्णन और एक्स्सेल्युलर मैट्रिक्स (ईसीएम) और पेरिसेलुलर मैट्रिक्स (पीसीएम) के एएफएम माप। (ए-डी) सेलुलर पैटर्न का लक्षण वर्णन: तार(ए),डबल स्ट्रिंग्स(बी),छोटे समूह(सी),और बड़े समूह(डी)। ऑस्टियोआर्थरिक कार्टिलेज में विभिन्न सेलुलर पैटर्न के लिए पीसीएम (लाल घेरे) और ईसीएम (ब्लू एरिया)(ई/एफ)के लोचदार मोडली का आकलन किया गया ।F ईसीएम और पीसीएम के लिए माप साइटों को प्रयोगकर्ता द्वारा चुना गया था और उन्हें काले क्रॉस द्वारा दर्शाया गया है। माप के लिए उपयोग की जाने वाली कैंटिलीवर टिप को सफेद तारे द्वारा चिह्नित किया जाता है। स्केल बार 10 माइक्रोन(ए-डी),और 100Fमाइक्रोन(ई/ यह आंकड़ा दानालेशे एट अल9से अनुकूलित और संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3: स्थानिक कॉन्ट्रोसाइट संगठन के एक समारोह के रूप में बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) और पेरिसेलुलर मैट्रिक्स (पीसीएम) के मात्रात्मक युवा की मोडली की तुलना। प्रगतिशील पैथोलॉजिकल स्थानिक कॉन्ड्रोसाइट संगठन के साथ, ईसीएम(ए)और पीसीएम(बी)(* पी एंड एलटी; 0.05, ***p < 0.001) दोनों के लिए बॉक्सप्लॉट्स में लोच की क्रमिक कमी नोट की गई थी। संक्षिप्त: एसएस: एकल तार, डीएस: डबल स्ट्रिंग्स, अनुसूचित जाति: छोटे समूह, बीसी: बड़े समूह। आंकड़े दानालाशे एट अल9से लिए जाते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4: एक्सिसेलुलर मैट्रिक्स (ईसीएम) के युवा मोडुली और सेलुलर स्थानिक संगठन के एक समारोह के रूप में पेरिसेलुलर मैट्रिक्स (पीसीएम) का संबंध। एक तेजी से पैथोलॉजिकल स्थानिक कॉन्ड्रोसाइट संगठन ईसीएम और पीसीएम(ए)दोनों के लिए युवा के मोडुली की कमी से जुड़ा हुआ था। हालांकि ये स्थानिक परिवर्तन हुए, ईसीएम और पीसीएम लोच का अनुपात स्थिर रहा, जिसमें कोई महत्वपूर्ण परिवर्तननहींदिखा । डेटा मतलब ± मानक त्रुटि(ए)और boxplots(बी)के साथ एक लाइन आरेख के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं । संक्षिप्त: एसएस: एकल तार, डीएस: डबल स्ट्रिंग्स, अनुसूचित जाति: छोटे समूह, बीसी: बड़े समूह। आंकड़े दानालाशे एट अल9से लिए जाते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
पूरक चित्रा 1: एक स्ट्रिंग पैटर्न के पेरिसेलुलर मैट्रिक्स (पीसीएम) के इंडेंटेशन द्वारा प्राप्त प्रतिनिधि बल वक्र फिट परिणाम (नारंगी तीर) के साथ-साथ अवशिष्ट रूट मतलब वर्ग (अवशिष्ट आरएमएस; काला तीर) दिखाता है। फिट परिणामों में नमूना और टिप, युवा के मॉड्यूलस और बेसलाइन के बीच संपर्क बिंदु शामिल है। नीचे प्रदर्शित अवशिष्ट आरएमएस फिट और बल डेटा के बीच अंतर का वर्णन करता है, जिससे एक बल वक्र फिट की गुणवत्ता का प्रतिनिधित्व करता है। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
| तालिका 1. एएफएम-जांच पर माइक्रोस्फीयर चिपकाने के लिए पैरामीटर | |
| पैरामीटर | मान |
| सेटपॉइंट | 5.0 V |
| बेसलाइन को समायोजित करें | 1 |
| लंबाई खींचना | 90.0 माइक्रोन |
| जेड आंदोलन | लगातार गति |
| स्पीड बढ़ाएं | 5.0 μm/s |
| समय बढ़ाएं | 18.0 एस |
| संपर्क समय | 90.0 एस |
| विलंब मोड | लगातार बल |
| नमूना दर | 2000 हर्ट्ज |
तालिका 1. एएफएम-जांच पर माइक्रोस्फीयर चिपकाने के लिए पैरामीटर।
| तालिका 2। दृष्टिकोण मापदंडों | |
| दृष्टिकोण मापदंड | मान |
| एप्रोच आईगेन | 5.0 हर्ट्ज |
| एप्रोच पीगेन | 0.0002 |
| दृष्टिकोण लक्ष्य ऊंचाई | 10.0 माइक्रोन |
| एप्रोच सेटपॉइंट | 5.00 V |
| एप्रोच बेसलाइन | 0.00 V |
तालिका 2। मापदंडों का रुख करें।
| तालिका 3। पैरामीटर चलाएं | |
| पैरामीटर | मान |
| सेटपॉइंट | 1.0 V |
| बेसलाइन को समायोजित करें | 1 |
| लंबाई खींचना | 90.0 माइक्रोन |
| जेड आंदोलन | लगातार गति |
| स्पीड बढ़ाएं | 5.0 μm/s |
| समय बढ़ाएं | 18.0 एस |
| संपर्क समय | 0.0 एस |
| विलंब मोड | लगातार बल |
| नमूना दर | 2000 हर्ट्ज |
तालिका 3। पैरामीटर चलाएं।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
नैनोस्केल स्तर पर जैविक सामग्रियों के जैव यांत्रिक गुणों को मापने के लिए एक उपन्यास और शक्तिशाली तकनीक के रूप में एएफएम का उपयोग करते हुए, हमने मानव ऑस्टियोआर्थरिक आर्टिकुलर उपास्थि में ईसीएम और पीसीएम के लोचदार गुणों को मापा। उपास्थि नमूनों को स्थानीय ऊतक पतन के लिए एक छवि आधारित बायोमार्कर के रूप में कॉन्ड्रोसाइट संगठन के प्रमुख स्थानिक पैटर्न के अनुसार चुना गया था। जैसा कि उम्मीद थी, स्थानिक कॉन्ड्रोसाइट पुनर्गठन के साथ ईसीएम और पीसीएम दोनों की लोच के मूल्यों में मजबूत गिरावट देखी गई। इन टिप्पणियों से स्पष्ट रूप से प्रकाश डाला गया है कि कॉन्ड्रोसाइट्स की स्थानिक व्यवस्था में विचलन न केवल सेलुलर माइक्रोएनवायरमेंट (पीसीएम) के लोचदार गुणों में परिवर्तन से जुड़ा हुआ था, बल्कि पूरे उपास्थि (ईसीएम) में भी जुड़ा हुआ था। इसके अलावा, ओए के दौरान पीसीएम और ईसीएम के लोचदार मोडली में मजबूत बदलाव के बावजूद ईसीएम/पीसीएम अनुपात में कोई महत्वपूर्ण बदलाव नहीं दिखा । इन निष्कर्षों से संकेत मिलता है कि ईसीएम और पीसीएम के यांत्रिक गुणों में परिवर्तन एक दिशात्मक रूप से और एक ही समय में हुआ, जिसका अर्थ यह हो सकता है कि प्रगतिशील विनाश की प्रकृति पीसीएम और ईसीएम दोनों के लिए समान है। OA दीक्षा और प्रगति इस प्रकार महत्वपूर्ण पीसीएम और ईसीएम क्षरण और अंततः विनाश से चलाता है । दोनों नुकसान वर्तमान अध्ययन में दिखाए गए आर्टिकुलर उपास्थि जैसे आर्टिकुलर उपास्थि के जैव यांत्रिक गुणों के महत्वपूर्ण नुकसान से जुड़े थे। यह बायोमैकेनिकल गुणों के लिए एक मार्कर के रूप में कॉन्ड्रोसाइट्स के स्थानिक संगठन की कार्यात्मक प्रासंगिकता पर जोर देता है। इसके विपरीत, यह हमें स्थानीय रूप से प्रमुख स्थानिक पैटर्न और इस प्रकार उपास्थि के स्थानीय ऊतक पतन के बारे में निष्कर्ष निकालने के लिए स्थानीय लोच माप का उपयोग करने की अनुमति देता है।
परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (AFM) एक गैर विनाशकारी तरीके से ऊतकों का अध्ययन करने के लिए एक उच्च संकल्प उपकरण के रूप में उभरा है । यह शारीरिक रूप से एक नाजुक और लचीला cantilever कि एक फोटोडायोड पर एक लेजर को दर्शाता है के साथ नमूनों की जांच से संचालित है । इस प्रतिबिंब में कोई भी परिवर्तन पंजीकृत है और एक विद्युत संकेत में परिवर्तित कर रहे हैं। जबकि एएफएम नैनोस्केल मापन का संचालन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है, यह अपनी सीमाओं और नुकसान के बिना नहीं आता है। विशेष रूप से महत्वपूर्ण माइक्रोस्फीयर को चिपकाकर कैंटिलीवर तैयारी है। इस विधि के संदर्भ में, माप के दौरान इंडेंटेशन गहराई और स्थानीय दबाव को संशोधित करने के लिए माइक्रोस्फीयर का उपयोग किया जाता है। जांच की नोक से जुड़े छोटे माइक्रोस्फीयर का उपयोग अकेले टिप का उपयोग करते समय एकल फाइबर की लोच के बजाय फाइबर नेटवर्क के बायोमैकेनिकल गुणों की माप की अनुमति देता है। यह माप प्रक्रिया के दौरान ऊतक क्षति को भी रोकता है। कैंटिलीवर सेंसर की नाजुक प्रकृति के कारण, लगातार और सटीक माप प्राप्त करने के लिए तैयारी की एक चौकस और सावधान मोड स्थापित करने की आवश्यकता है। सेंसर की नोक से माइक्रोस्फीयर को अलग होने से रोकने के लिए, हम एक सप्ताह से पुराने ताजा मिश्रित गोंद की सलाह देते हैं। इसके अलावा, सेंसर की कार्यक्षमता के लिए महत्वपूर्ण है कि वह टिप के केंद्र में माइक्रोस्फीयर को जगह दे क्योंकि माइक्रोस्फीयर अटैचमेंट में पार्श्व विचलन आसानी से असंगत माप में परिणाम देता है।
ग्लास ब्लॉक पर कैंटिलीवर रखना और फिटिंग स्प्रिंग के साथ इसे ठीक करना एक नाजुक और त्रुटि-प्रवण प्रक्रिया है जिसे सावधानीपूर्वक ध्यान और स्थिर हाथों की आवश्यकता होती है। क्योंकि cantilevers बहुत अप्रशिक्षित ऑपरेटरों द्वारा नष्ट होने की संभावना है, हम कई परीक्षण रन और अभ्यास के संचालन के लिए आराम से AFM आसानी से तोड़ने योग्य घटकों को संभालने की सलाह देते हैं ।
डिवाइस को ठीक से कैलिब्रेट करने और विश्वसनीय माप प्राप्त करने के लिए एक साफ ग्लास ब्लॉक अनिवार्य है। ब्लॉक की ऑप्टिकल सतह पर गंदगी या धूल फोटोडिटेक्टर पर उचित लेजर संरेखण को रोक सकती है। इसलिए, यदि लेजर संरेखण के दौरान समस्याओं का सामना करना पड़ता है, तो दूसरी बार इथेनॉल के साथ ग्लास ब्लॉक को धोना आवश्यक हो सकता है।
लोचदार मॉड्यूलस का डेटा विश्लेषण या निर्धारण हर्ट्ज मॉडल का उपयोग करके किया जा सकता है जैसा कि पहले11,12वर्णित है । संक्षेप में, इंडेंटेशन द्वारा उत्पन्न डेटा कैंटिलीवर टिप के आंदोलन पर बल के भूखंड हैं। माप के दौरान, कैंटिलीवर नमूने की दिशा में स्थानांतरित हो जाता है। यह नमूने के साथ संपर्क बनाने वाले कैंटिलीवर की ओर जाता है और बाद में एक के विपरीत दिशा में झुकने के लिए होता है जिसमें यह मूल रूप से चला गया था। इसके साथ ही, एक निश्चित राशि से नमूने का एक इंडेंटेशन होता है। हर्ट्ज-फिट मॉडल का उपयोग करने के लिए, नमूने के इंडेंटेशन की गणना की जानी चाहिए और कैंटिलीवर झुकने पैरामीटर को अलग करने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए। नमूना का वर्णन पैरामीटर Poisson अनुपात है, जो जांच सामग्री पर निर्भर करता है । नरम जैविक नमूनों के लिए, Poisson अनुपात अक्सर ०.५१५के लिए सेट है । जैसा कि ऊपर बताया गया है, उपयोग किए गए इंडर्टर का आकार युवा के मॉड्यूलस की गणना के लिए प्रासंगिक है, क्योंकि यह मूल हर्ट्ज समीकरण के लिए किए जाने वाले एक्सटेंशन को तय करता है। वर्णित प्रयोग के मामले में, माइक्रोस्फीयर के उपयोग के कारण एक गोलाकार प्रवेश आकार ग्रहण किया जाता है।
जबकि एएफएम डेटा एकत्र करने की नई और दिलचस्प संभावनाओं की पेशकश कर सकता है, मिले डेटा की निरंतरता और विश्वसनीयता संबंधित ऑपरेटर के अनुभव पर दृढ़ता से निर्भर करती है। ऊपर उल्लिखित कई चरण मानवीय त्रुटि से ग्रस्त हैं और उन्हें ठीक से निष्पादित करने के लिए धैर्य और सावधानी की आवश्यकता होती है।
कई संवेदनशील चर है कि माप परिणामों को प्रभावित कर सकते है के कारण, इस अध्ययन में रिपोर्ट निरपेक्ष बल मूल्यों को सामान्यीकृत नहीं किया जा सकता है, बल्कि हमारे प्रयोगात्मक सेटअप के लिए विशिष्ट हैं । उपास्थि के ऊतक पतन का मूल्यांकन करने के लिए इस तकनीक का उपयोग करते समय, विभिन्न स्थानिक पैटर्न पर कुछ सामान्यमापन को पहले मौजूद विशिष्ट प्रयोगात्मक माप सेटिंग्स के परिणामों को स्केल करने के लिए किया जाना चाहिए। हालांकि, अलग लोच मोडली और स्थानिक पैटर्न के संबंध प्रभावित नहीं होंगे।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
हम उनकी मदद और समर्थन के लिए मूल प्रकाशन से हमारे सह लेखकों का शुक्रिया अदा करते हैं ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Merck | A2942 | |
| Atomic Force Microscope (AFM) | CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany | JPK00518 | |
| AFM head | (CellHesion 200) JPK | JPK00518 | |
| Biocompatible sample glue | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | H000033 | |
| Cantilever | tip C, k ¼ 7.4 N/m, All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria | AIO-TL-10 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany | 41966052 | |
| Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM) | AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany | L201306_03 | |
| Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine | (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) | F1315 | |
| Microspheres | Polysciences | 07313-5 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Petri dish heater associated with AFM | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | T-05-0117 | |
| Scalpel | Feather | 2023-01 | |
| Tissue culture dishes | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland | TPP93040 | |
| Tissue-tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | SA6255012 |
References
- Guilak, F., et al. The pericellular matrix as a transducer of biomechanical and biochemical signals in articular cartilage. Annals of the New York Academy of Sciences. 1068, 498-512 (2006).
- Peters, H. C., et al. The protective role of the pericellular matrix in chondrocyte apoptosis. Tissue Engineering Part A. 17 (15-16), 2017-2024 (2011).
- Larson, C. M., Kelley, S. S., Blackwood, A. D., Banes, A. J., Lee, G. M. Retention of the native chondrocyte pericellular matrix results in significantly improved matrix production. Matrix Biology. 21 (4), 349-359 (2002).
- Rolauffs, B., Williams, J. M., Grodzinsky, A. J., Kuettner, K. E., Cole, A. A. Distinct horizontal patterns in the spatial organization of superficial zone chondrocytes of human joints. Journal of Structural Biology. 162 (2), 335-344 (2008).
- Schumacher, B. L., Su, J. L., Lindley, K. M., Kuettner, K. E., Cole, A. A. Horizontally oriented clusters of multiple chondrons in the superficial zone of ankle, but not knee articular cartilage. The Anatomical Record. 266 (4), 241-248 (2002).
- Rolauffs, B., et al. Onset of preclinical osteoarthritis: the angular spatial organization permits early diagnosis. Arthritis Rheumatology. 63 (6), 1637-1647 (2011).
- Maver, U., Velnar, T., Gaberšček, M., Planinšek, O., Finšgar, M. Recent progressive use of atomic force microscopy in biomedical applications. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 80, 96-111 (2016).
- Polini, A., Yang, F. Physicochemical characterization of nanofiber composites. Nanofiber Composites for Biomedical Applications. Ramalingam, M., Ramakrishna, S. , Woodhead Publishing. Cambridge, UK. 97-115 (2017).
- Danalache, M., Jacobi, L. F., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Assessment of biomechanical properties of the extracellular and pericellular matrix and their interconnection throughout the course of osteoarthritis. Journal of Biomechanics. 97, 109409 (2019).
- Danalache, M., et al. Changes in stiffness and biochemical composition of the pericellular matrix as a function of spatial chondrocyte organisation in osteoarthritic cartilage. Osteoarthritis Cartilage. 27 (5), 823-832 (2019).
- Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. Robust strategies for automated AFM force curve analysis--I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials. Journal of Biomechanical Engineering. 129 (3), 430-440 (2007).
- Darling, E. M., Topel, M., Zauscher, S., Vail, T. P., Guilak, F. Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells and primary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes. Journal of Biomechanics. 41 (2), 454-464 (2008).
- Thambyah, A., Nather, A., Goh, J. Mechanical properties of articular cartilage covered by the meniscus. Osteoarthritis Cartilage. 14 (6), 580-588 (2006).
- Choi, A. P., Zheng, Y. P. Estimation of Young's modulus and Poisson's ratio of soft tissue from indentation using two different-sized indentors: finite element analysis of the finite deformation effect. Medical Biological Engineering Computing. 43 (2), 258-264 (2005).
- Jin, H., Lewis, J. L. Determination of Poisson's ratio of articular cartilage by indentation using different-sized indenters. Journal of Biomechanical Engineering. 126 (2), 138-145 (2004).
