Summary
Vi presenterar en metod för att undersöka tidiga artrosförändringar på cellnivå i ledbrosk med hjälp av atomkraftmikroskopi (AFM).
Abstract
Biomekaniska egenskaper hos celler och vävnader inte bara reglera deras form och funktion, men är också avgörande för att upprätthålla deras vitalitet. Förändringar i elasticitet kan propagera eller utlösa uppkomsten av stora sjukdomar som cancer eller artros (OA). Atomkraftmikroskopi (AFM) har vuxit fram som ett starkt verktyg för att kvalitativt och kvantitativt karakterisera biomekaniska egenskaper specifika biologiska målstrukturer på mikroskopisk skala, mäta krafter i ett intervall från så liten som piconewton till mikronewton. Biomekaniska egenskaper är av särskild betydelse i muskuloskeletala vävnader, som utsätts för höga nivåer av stam. OA som en degenerativ sjukdom i brosket resulterar i störningar av pericellular matris (PCM) och den rumsliga omorganisering av kondrocyter inbäddade i deras extracellulära matris (ECM). Störningar i PCM och ECM har associerats med förändringar i de biomekaniska egenskaperna hos brosk. I den aktuella studien använde vi AFM för att kvantifiera dessa förändringar i förhållande till de specifika rumsliga mönsterförändringar av kondrocyterna. Med varje mönster förändring observerades betydande förändringar i elasticitet för både PCM och ECM. Mätning av den lokala elasticiteten gör det möjligt att dra direkta slutsatser om graden av lokal vävnadsdegeneration i OA.
Introduction
Ledbrosk är en avaskulär, aneural vävnad. Glest spridda kondrocyter producerar, organiserar och underhåller en expansiv extracellulär matris (ECM) som de är inbäddade i. Som en distinkt och specialiserad del av ECM, kondrocyter är omgivna av ett tunt lager av specialiserade matris kallas pericellular matris (PCM). PCM fungerar som en mekanosensitive cell-matris gränssnitt1 som skyddar kondrocyterna2 och modulerar deras biosyntetiska svar3. Som tidigare beskrivits4, i friska brosk, kondrocyter är ordnade i specifika, distinkta rumsliga mönster som är specifika för varje vävnad skikt och gemensamma4,,5 och beror på gemensamma specifika mekaniska lastmekanismer6. Dessa mönster ändras från par och strängar i friska brosk till dubbla strängar med uppkomsten av artros (OA). Med ytterligare progression av sjukdomen bildar kondrocyterna små kluster, ökar gradvis i storlek till stora kluster i avancerade OA. En fullständig förlust av någon organisationsstruktur och induktion av apoptos observeras i slutet skede OA. Således kan chondrocyte cellulära arrangemang användas som en bildbaserad biomarkör för OA progression4.
Biomekaniska egenskaper hos celler och vävnader inte bara reglera deras form och funktion, men är också avgörande för att upprätthålla deras vitalitet. Förändringar i elasticitet kan propagera eller utlösa uppkomsten av stora sjukdomar som cancer eller OA. Atomkraftmikroskopi (AFM) har vuxit fram som ett kraftfullt verktyg för att kvalitativt och kvantitativt karakterisera biomekaniska egenskaper specifika biologiska målstrukturer på mikroskopisk skala, mäta ett brett spektrum av kraft, från piconewton till mikronewton. Den viktigaste tillämpningen av AFM är att mäta yt topografi och mekaniska egenskaper av prover vid subnanometer upplösning7. Mätanordningen består av tre huvudkomponenter: 1) En AFM-sond, som är en vass spets monterad på en cantilever och används för direkt interaktion med provets yta. När kraft appliceras på fribärande, sker deformation av den senare enligt den uppmätta vävnadens egenskaper. 2) Ett optiskt system som projicerar en laserstråle på cantilever, som sedan reflekteras till en detektor enhet. 3) En fotodiod detektor som fångar ljuset avledas från cantilever. Den omvandlar den mottagna informationen om laseravböjningen av cantilever till en kraftkurva som kan analyseras.
Huvudprincipen för afm är således detektion av den kraft som verkar mellan AFM-sonden och provets målstruktur. De kraftkurvor som erhålls beskriver målstrukturernas mekaniska egenskaper på provytan som elasticitet, laddningsfördelning, magnetisering, avkastningsstrus och elastisk plastdeformationsdynamik8. En viktig fördel med AFM jämfört med andra bildframställningstekniker är att AFM kan användas för att mäta de mekaniska egenskaperna hos levande celler i medium eller vävnader i ett inbyggt tillstånd utan att skada vävnaden. AFM kan fungera både i flytande eller torra förhållanden. Det finns inget krav på provberedning. AFM ger möjlighet att avbilda ett prov och mäta dess mekaniska egenskaper samtidigt i prover som är nära fysiologiska förhållanden. I denna studie beskriver vi en ny metod för att bedöma OA progression genom att mäta elasticiteten i PCM och ECM i inhemska ledbrosk. Korrelationen mellan rumsliga organisation av kondrocyter med graden av lokal vävnaddegeneration ger ett helt nytt perspektiv för tidig upptäckt av OA. Den funktionella relevansen av dessa mönster har dock inte utvärderats hittills. Eftersom den viktigaste funktionen av ledbrosket är bärande vid låg friktion, måste vävnaden ha elastiska egenskaper. AFM gör det möjligt att mäta inte bara e-elasticiteten i ECM utan också av de rumsliga cellulära mönster inbäddade i deras PCM. Den observerade korrelationen av elasticitet med rumsliga mönster förändring av kondrocyterna är så stark att mäta elasticitet ensam kan tillåta stratifiering av lokala vävnad degeneration.
Elastisk moduli av PCM och ECM bedömdes i 35 μm tunna sektioner med hjälp av ett AFM-system integrerat i en inverterad fas kontrast mikroskop som tillät samtidig visualisering av brosk provet. Detta protokoll bygger på en studie som redan publicerats från vårt laboratorium9 och specifikt beskriver hur man karakteriserar den rumsliga arrangemang av kondrocyter och hur man mäter elasticiteten i deras associerade PCM och ECM. Med varje mönsterförändring av kondrocyterna kan betydande förändringar i elasticitet också observeras för både PCM och ECM, vilket gör att denna teknik kan användas för att direkt mäta degenerationsstadiet.
Denna validerade metod öppnar ett nytt sätt att utvärdera OA progression och terapeutiska effekter i ett tidigt skede innan makroskopiska vävnad nedbrytning faktiskt börjar visas. Utföra AFM mätningar konsekvent är en mödosam process. I följande protokoll beskriver vi hur man förbereder provet som ska mätas med AFM, hur man utför de faktiska AFM-mätningarna som börjar med beredning av cantilever, hur man kalibrerar AFM och sedan hur mätningarna ska utföras. Steg-för-steg-instruktioner ger en tydlig och koncis metod för att få tillförlitliga data och tillhandahålla grundläggande strategier för bearbetning och tolkning av dem. I diskussionsavsnittet beskrivs också de vanligaste fallgroparna för den här rigorösa metoden och användbara felsökningstips.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den mänskliga brosk prover erhölls från patienter som genomgår totala knä artroplastik i institutionen för ortopedisk kirurgi vid universitetssjukhuset i Tuebingen, Tyskland, och Winghofer-sjukhuset, Rottenburg a.N., Tyskland, för slutet-steg OA av knäet. Fullständig avdelnings-, institutions- och lokal etisk kommittégodkännande erhölls innan studien påbörjades (projektnummer 674/2016BO2). Skriftligt informerat samtycke mottogs från alla patienter före deltagande. Metoderna har utförts i enlighet med de godkända riktlinjerna.
1. Provberedning
- Förbereda brosket för cryotome snittning
- För att utvärdera degenerativa förändringar i knäleden, ta ledbroskprover som erhållits från den bärande zonen i femorala kondyler efter vävnad samband från patienterna.
OBS: Prover som undersöks bör fortfarande innehålla minst ett tunt lager av subkondralben för att möjliggöra tydlig identifiering av vävnadsorienteringen med avseende på den inre och yttre ytan, vilket också möjliggör en standardiserad vävnadsskörd av det översta broskskiktet. Brosket kan användas för AFM mätningar fram till 24 h efter operationen. Vävnaden kan lagras i serumfri Dulbeccos modifierade Eagle's medium (DMEM) med 2% (v/v) penicillin-streptomycin och 1,2% (v/v) amphotericin B före användning. Lagring av proverna för mer än 24 h kan orsaka artefakter i AFM mätningar på grund av vävnad svullnad, dock. - Skär ledbrosket som helhet från det subkondrala benet med hjälp av en skalpell och bädda sedan in broskprovet i vattenlösligt inbäddningsmedium på kryotomeratten som fryser under låg temperatur i kryotomen.
OBS: Det frusna mediet stabiliserar vävnaden den omsluter. Det resulterar också i frysning av broskprovet tillsammans med inbäddningsmediet. När du skär brosket från benet, spåra vävnadens orientering. Vävnaden inbäddade för kryossektionen måste placeras på ett sådant sätt att broskets översta lager (dvs. ledytan) av brosket är vänd mot bladet. Observera att vävnaden måste täckas helt av inbäddningsmediet.
- För att utvärdera degenerativa förändringar i knäleden, ta ledbroskprover som erhållits från den bärande zonen i femorala kondyler efter vävnad samband från patienterna.
- Kryotosektion av brosket
- Med hjälp av en vanlig kryotop, dela vävnaden med en tjocklek av 35 μm från det översta lagret (dvs. ledyta) av ledbrosket som är inbäddat i det frusna vattenlösliga inbäddningsmediet.
OBS: Totalt kan upp till 300 μm (vilket motsvarar cirka nio sektioner) delas upp och användas för analyserna. Den föreslagna gränsen på 300 μm motsvarar det visuella penetrationsdjup som vanligtvis kan erhållas med fluorescensmikroskopi i hyalinbrosk såsom ledbrosk. Således är det möjligt att sortera brosk enligt det dominerande lokala rumsliga mönstret och sedan mäta dessa mönster i motsvarande sektioner. - Samla upp sektionerna på en glasskiva och skölj sektionerna 3x med fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) för att avlägsna det vattenlösliga inbäddningsmediet.
- Med hjälp av en vanlig kryotop, dela vävnaden med en tjocklek av 35 μm från det översta lagret (dvs. ledyta) av ledbrosket som är inbäddat i det frusna vattenlösliga inbäddningsmediet.
- Limning av brosksektioner på en AFM-kompatibel petriskål
OBS: Eftersom afm samlar in data genom mekanisk fördjupning på provet måste sektionerna fästas på plats för att möjliggöra exakta mätningar.- Limma försiktigt de 35 μm tjocka sektionerna med biokompatibelt provlim på vävnadsodlingsrätter som är kompatibla med AFM-enheten. För att göra detta, ta 2−3 droppar av limmet och lägg dem på vävnadsodlingsskålen på den plats där kanten på sektionen kommer att hamna. Nu sätta brosk avsnitt på limmet och låt den hålla sig stadigt till ytan av vävnaden kultur skålen.
OBS: De 35 μm tjocka delarna av hyaline ledbrosket är inte särskilt benägna att curling. Men om curling uppstår när du tar bort proverna från buffertmediet, se till att så lite vätska som möjligt fastnar på proverna. Så snart överflödigt vatten har torkat upp, direkt sprida vävnaden på spridda fläckar av lim så att den är fast på ytan av cellkulturskålen. Limmet appliceras i ett tunt lager endast i kanterna på provet och inte på hela sektionen. Mät endast den del av provet som ligger långt från det limmade området för att eliminera risken för att limmet stör mätningarna. - Inkubera sektionerna vid rumstemperatur (RT) i 2 min så att limmet och vävnaden kan bindas ordentligt. Täck sedan sektionerna med Leibovitz L-15 medium utan L-glutamin och utan natriumbikarbonat så att de är helt nedsänkta.
OBS: Plötsliga rörelser av provet under fixering eller otillräcklig limapplicering är vanliga misstag som resulterar i vävnadens avskildhet från odlingsskålen. Dessutom bör applicering av Leibowitz-mediet göras på ett skonsamt sätt, för att inte lossa provet från ytan på grund av "vågor" som skapats av mediet. - Placera petriskålen med de limmade sektionerna i standardcellodlingskuvösen vid 37 °C tills mätningarna har utförts.
OBS: Se till att vävnadssektionerna är stabila och inte lossnar från vävnadsodlingsskålens yta genom att utföra varje steg långsamt.
- Limma försiktigt de 35 μm tjocka sektionerna med biokompatibelt provlim på vävnadsodlingsrätter som är kompatibla med AFM-enheten. För att göra detta, ta 2−3 droppar av limmet och lägg dem på vävnadsodlingsskålen på den plats där kanten på sektionen kommer att hamna. Nu sätta brosk avsnitt på limmet och låt den hålla sig stadigt till ytan av vävnaden kultur skålen.
2. Cantilever beredning (limning mikrosfärerna)
- Förbereda AFM-enheten och späda ut mikrosfärerna
- Placera fribärande på glasblocket som anges för luftmätningar, fixera den med fjädern och montera glasblocket på AFM-huvudet.
- Späd mikrosfärerna i 100% etanol (100 partiklar/10 μL) och ultraljud i 10 s, så att mikrosfärerna separeras och klumpar inte ihop sig.
- Förbereda inställningen för limning
- Rengör en glasskiva med 70 % etanol och montera den på provhållaren på AFM-enheten.
OBS: Rengöringen av bilden förhindrar dammfläckar som kan störa limningsprocessen från att samlas på bildens yta. - Placera 2 μL av microsphere suspensionen i mitten av bilden och 2 μL lim nära microsphere suspension.
OBS: Att placera microsphere fjädringen och limmet nära varandra rekommenderas för att möjliggöra en snabb övergång av cantilever mellan limmet och mikrosfärerna. Om övergången mellan doppning cantilever i limmet och att få kontakt med en microsphere är för lång, limmet kommer så småningom att härda, och därmed förlora sina självhäftande egenskaper. - Låt etanolen i microspherefjädringen lufttorka och lämna mikrosfärerna på plats.
- Rengör en glasskiva med 70 % etanol och montera den på provhållaren på AFM-enheten.
- Limning av mikrosfärerna på cantilever spetsen
- Doppa cantilever manuellt i limmet med hjälp av stegmotorn i 10 μm steg tills spetsen är täckt av lim. Utför detta steg snabbt, eftersom limmet torkar snabbt.
- Dra tillbaka cantilever igen med 100 μm, flytta den mot mikrosfärerna och placera cantilever spetsen direkt ovanför en enda microsphere.
- Kör en kraftspektroskopimätning för att doppa cantileverspetsen på den valda microsfären med de parametrar som visas i tabell 1.
OBS: Genom att utföra detta steg används ett mått på mikrosfärens yta för att etablera kontakt mellan cantilevers spets och microsphere. Den relativt långa kontakttiden som visas i tabell 1 möjliggör riklig bindningstid mellan limmet och mikrosfären. Kraftavståndskurvan som erhålls under detta steg genereras som en biprodukt av limning av mikrosfären på cantileverspetsen och bearbetas inte för vidare analys. - När en mikrosfär är ansluten till fribärande, dra tillbaka glasblocket med cantilever monterad ovanpå och sedan ta bort AFM huvudet från mikroskopet. Slutligen, avmontera glasblocket och cantilever från AFM huvudet.
- Inkubera cantilever vid 65 °C i 2 timmar och låt den torka över natten vid RT innan mätningarna påbörjas.
OBS: Inkubation av fribärande förbättrar limmets självhäftande egenskaper, vilket gör cantilever-microsphere-komplexet mer stabilt.
3. Förbereda AFM-enheten för mätningar
- Justera ett glasblock som är specificerat för mätning i vätskemiljö på AFM-hållaren så att den övre ytan är rak och parallell med AFM-hållaren.
- Med hjälp av pincett, montera försiktigt den valda cantilever på ytan av glasblocket, så att AFM spets med microsphere sticker ut över polerat optiskt plan.
OBS: Cantilever spets måste sticka över det polerade planet för att kunna återspegla AFM laser på photodetector. Var mycket försiktig när du placerar fribärande på AFM för att inte repa den polerade optiska ytan av glasblocket. Att repa glasblocket kan leda till svårigheter att justera laserjusteringen och kan störa de efterföljande mätningarna. - Eftersom cantilever kommer att utsättas för mekaniskt tryck, måste det fastställas på plats. Stabilisera cantilever på glasblocket genom att skjuta den metalliska fjädern i spåret av blocket och klämma toppen av cantilever med fjädern med hjälp av pincett.
- Placera försiktigt glasblocket med fribärande på AFM-huvudet och fäst den med den integrerade låsmekanismen. Se till att fjädern är vänd mot vänster sida så att cantilever placeras i rätt riktning. Montera sedan AFM-huvudet med cantilever på AFM-enheten.
4. Lastning av provet och kalibreringen av cantilever
OBS: Här sker kalibrering av enheten genom att köra en kraftkurva på den rena ytan av petriskålen fylld med Leibovitz medium utan provvävnad. Kalibreringen kan också utföras med hjälp av en separat kontroll-AFM-skål fylld endast med AFM-mediet utan provet.
- Montering av provet på AFM-enheten
- Placera petriskålen som är beredd i steg 1.3.3 på provhållaren för afm.
- Slå på petriskålsvärmaren och ställ in den på 37 °C. Låt vävnadsodlingsskålen nå optimal temperatur (dvs. 20 min).
- Placera en skyddsfolie på basen av cantileverenheten för att undvika kondensering av medium i AFM-huvudet.
- Kalibrering av enheten
- Öppna programvaran (Tabell över material), följt av laserjusteringsfönstret och fönstret som visar inställningarna för inflygningsparametern. Slå sedan på stegmotorn, laserlampan och CCD-kameran.
- Använd CCD-kameran på mikroskopet för att visualisera och identifiera cantilever. Med hjälp av stegmotorfunktionen sänk du cantilevern i 100 μm steg tills cantilever är helt nedsänkt i mediet.
OBS: Nedsänkningen av behållaren i vätskan kan identifieras visuellt via CCD-kameran. När den bryter vattenytan skapar cantilever spetsen lätt märkbara cirkulära reflektioner i vattnet. - Rikta lasern ovanpå cantilever med hjälp av justeringsskruvarna.
OBS: Överblås inte skruvarna, eftersom detta skadar laserjusteringsmekanismen. Den cantilever ses underifrån och laserstrålen kommer ovanifrån. - När lasern är placerad på cantilever, justera laserstrålen med hjälp av skruvar i AFM enheten så att den reflekterade strålen faller på mitten av fotodetektorn. Fortsätt att övervaka laserstrålens position med hjälp av laserjusteringsfunktionen.
OBS: Detektorn fångar upp böjningen av laserstrålen som reflekteras av cantilever och omvandlar den till en elektrisk signal. - Efter justering av laser-cantilever måste sum-signalen vara 1 V eller högre medan de laterala och vertikala avböjningarna måste vara nära 0. Om dessa värden inte erhålls justerar du fotodetektorn.
- Erhålla kalibreringskraftkurvan
- För att nå ytan på AFM-skålen för att Approach starta mätningarna, kör en skannermetod med de inflygningsparametrar som anges i tabell 2. När botten av vävnadsodlingsskålen har nåtts, dra tillbaka cantilever med 100 μm.
OBS: Vid denna punkt sonden är exakt 100 μm ovan från botten av vävnadsodling skålen. - Ställ in RUN-parametrarna och justera parametrarna som visas i tabell 3. Klicka på RUN-knappen för att starta en mätning och få en kurva för kalibreringskraftavstånd.
OBS: Den kraftkurva som erhålls här visas i figur 1. - På kalibreringskurvan för kraftavstånd väljer du området för en linjär passform för den indragna kurvan i programvaran.
OBS: Den linjära passformen görs för att mäta cantilever känslighet. När den linjära passformen är på plats sparas värdena av programvaran. Fjäderkonstantmätningen eller cantileverns termiska brus beräknas av programvaran efteråt. - Eftersom mätningarna utförs i medelhög vid en temperatur av 37 °C ställer du in temperaturvariabeln vid 37 °C i programvaran så att den efterliknar fysiologiska förhållanden så nära som möjligt.
OBS: I slutet av kalibreringen sparas den vertikala avböjningen och visas i kraftenheten, Newton (N), i stället för volt (V), som är enheten för den ursprungliga registreringen av fotodioddetektorn.
- För att nå ytan på AFM-skålen för att Approach starta mätningarna, kör en skannermetod med de inflygningsparametrar som anges i tabell 2. När botten av vävnadsodlingsskålen har nåtts, dra tillbaka cantilever med 100 μm.
5. Biomekanisk karakterisering av ECM och PCM genom att utföra elasticitetsmätningar via AFM
- Identifiera kondrocytmönstren i brosksektionen
- Observera brosksektionen under ett faskontrastmikroskop integrerat i AFM-systemet och identifiera de specifika cellulära mönstren10 ledbrosk från det osteoartrostiska knäet: enstaka strängar (friska vävnadsområden), dubbla strängar (början vävnadsdegeneration), små och stora kluster (både avancerad vävnadsdegeneration). Se figur 2A–D.
- När det specifika önskade mönstret har identifierats mäter du två platser per valt mönster per matristyp (PCM eller ECM) och utför nio mätrepetitioner på varje mätplats (figur 2E,F). Kontrollera att en provstorlek är tillräckligt stor för att ta hänsyn till eventuella felaktigheter.
OBS: För PCM-mätningarna placerar du cantilevern i närheten av cellerna (vilket visas av de röda cirklarna i figur 2E,F). För att utföra mätningar av ECM väljer du ett område utan celler (visas av det blå området i figur 2E,F) och utför indraget enligt beskrivningen i steg 5.2.
- Indrag för den riktade platsen
- Utför en inflygning följt av en upprullning så att cantilevern placeras 100 μm ovanför vävnaden, vilket kommer att vara utgångsläget för de efterföljande mätningarna.
- Fokusera på PCM eller ECM av mönstret som ska mätas och fixa datormusen vid den tidpunkten.
Musen fungerar som en visuell markör för målplatsen för indrag. När fokus skiftar till cantilever spets, vävnadsstrukturerna kommer att bli omöjlig att skilja eller suddig. - Nu fokusera på sonden och flytta spetsen på sonden till den punkt som tidigare fastställts av datorpilen. Starta sedan mätningarna med RUNmed hjälp av den börsparameter som erhålls genom kalibrering av cantilever.
OBS: En exemplarisk kraftkurva som erhålls genom att mäta PCM för en enda sträng visas i tilläggsfigur 1.
6. Databehandling
OBS: Dataanalysen eller bestämningen av den elastiska modulen utförs med hjälp av en Hertz-modell enligt beskrivningen tidigare11,12. Indenter form var sfärisk på grund av användningen av mikrosfärer på spetsen och Poisson förhållande hölls på 0,5 baserat på tidigare litteratur13,14,15.
- Öppna databehandlingsprogrammet(Register över material)som är kompatibelt med data som erhållits från AFM-enheten.
- Välj Hertz-modellen i programvaran för bearbetning av kraftdistanskurvorna. Ställ in Poisson-förhållandet på 0,5 och välj spetsformen som sfärisk och en spetsradie på 12,5 μm.
- När alla parametrar har justerats monteras resultaten och Youngs modul beräknas och visas av programvaran.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Längs den fysiologiska modellen från strängar till dubbla strängar, till små och slutligen till stora kluster, minskade både ECM (Figur 3A) och PCM (figur 3B) elastisk moduli signifikant mellan varje mönsterförändring. Det enda undantaget var skillnaden i ECM mellan strängar och dubbla strängar (p = 0,072). Resultaten visar att förhållandet mellan ECM och PCM(figur 4B)inte förändrades nämnvärt, medan en markant minskning av de absoluta skillnaderna i elasticitet mellan ECM och PCM observerades (figur 4A). Resultaten visar inte heller någon signifikant association när det gäller ECM/PCM-förhållandet eller tillhörande cellulära rumsliga förändringar (r = -0,099, p = 0,281).
Bild 1: Schematisk representation av en kraftavståndskurva i kontaktsäkert flyg. När sonden närmar sig ytan är krafterna för små för att ge en mätbar avböjning av spetsen först, vilket lämnar spetsen i sitt ostörda läge (1). Sedan, när fribärande är mycket nära provet, på grund av självhäftande krafter aktiva mellan spetsen och sonden, snäpper cantilever faktiskt snabbt mot provet (2). När sonden närmar sig provet ytterligare, den motbjudande avböjningen sedan mot rörelsen av riktning, med en nästan linjär funktion av höjd och avböjning tills den vertikala avböjningen når det relativa börvärdet (3). Vid indragning (4), förutom de sänkande avböjningskrafterna, är vidhäftningskrafter också närvarande medan cantilevern dras in i Z-axeln från provet. När AFM-sonden dras av kontakten med provet, blir den först "fast" innan den kan lossna från vidhäftningen vid gränssnittet, vilket till och med leder till en kort negativ avböjning av cantilever, innan den återigen når sitt oböjda neutrala läge utan kontakt med sonden (5). Omfattningen av avböjning uttrycks i den kraft som arbetar på cantilever uttryckt i nanonewtons. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Representativ rumslig karakterisering av kondrocyter och AFM-mätningar av den extracellulära matrisen (ECM) och pericellulär matris (PCM). (A-D) Karakterisering av cellmönster: strängar (A), dubbla strängar (B), små kluster (C), och stora kluster (D). Den elastiska moduli av PCM (röda cirklar) och ECM (blå område) (E/F) bedömdes för de olika cellulära mönster i artros brosk. Mätplatser för ECM och PCM valdes ut av försöksören och indikeras grafiskt med svarta kors. Den cantilever spets som används för mätningarna markeras med en vit stjärna. Skalstänger representerar 10 μm(A-D)och 100 μm (E/F). Figuren anpassas och modifieras från Danalache et al.9. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Jämförelse av den kvantifierade Youngs moduli av den extracellulära matrisen (ECM) och den pericellulära matrisen (PCM) som en funktion av rumsliga kondrocytorganisation. Med progressiv patologisk rumslig kondrocyt organisation noterades en gradvis minskning av elasticiteten i boxplots för både ECM (A) och PCM (B) (* p < 0,05, *** p < 0,001). Förkortningar: SS: enstaka strängar, DS: dubbla strängar, SC: små kluster, BC: stora kluster. Siffrorna är hämtade från Danalache et al.9. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Förhållandet mellan young's moduli av den extracellulära matrisen (ECM) och den pericellulära matrisen (PCM) som en funktion av cellulära rumsliga organisation. En alltmer patologisk rumslig kondrocytorganisation var förknippad med en minskning av Youngs moduli för både ECM och PCM (A). Även om dessa rumsliga förändringar ägde rum, förblev förhållandet mellan ECM och PCM-elasticitet konstant, vilket inte visade några betydande förändringar (B). Uppgifterna presenteras som ett linjediagram med medelvärdet ± standardfel (A) och boxplots (B). Förkortningar: SS: enstaka strängar, DS: dubbla strängar, SC: små kluster, BC: stora kluster. Siffrorna är hämtade från Danalache et al.9. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 1: Representativ kraftkurva som erhålls genom indrag av den pericellulära matrisen (PCM) i ett enda strängmönster som visar passningsresultaten (orange pil) samt den återstående rotmedelvärdet (resterande RMS; svart pil). Passformsresultaten inkluderar kontaktpunkten mellan prov och spets, Youngs Modulus och baslinjen. De återstående RMS som visas nedan beskriver skillnaden mellan passnings- och kraftdata, vilket representerar kvaliteten på en kraftkurva. Klicka här för att ladda ner denna siffra.
| Tabell 1. Parametrar för limning av en mikrosfär på AFM-sonden | |
| Parametrar | Värde |
| Setpoint | 5.0 V |
| Justera baslinje | 1 |
| Dra längd | 90,0 μm |
| Z rörelse | Konstant hastighet |
| Utöka hastigheten | 5,0 μm/s |
| Förläng tiden | 18.0 s |
| Kontakttid | 90,0 s |
| Fördröjningsläge | Konstant kraft |
| Samplingsfrekvens | 2000 Hz |
Tabell 1. Parametrar för limning av en mikrosfär på AFM-sonden.
| Tabell 2. Tillvägagångssätt parametrar | |
| Tillvägagångssätt Parametrar | Värde |
| Närma sig IGain | 5,0 Hz |
| Tillvägagångssätt PGain | 0.0002 |
| Målhöjd för inflygning | 10,0 μm |
| Inställningsetpunkt | 5,00 V |
| Metodbaslinje | 0,00 V |
Tabell 2. Tillvägagångssätt parametrar.
| Tabell 3. Kör parametrar | |
| Parametrar | Värde |
| Setpoint | 1.0 V |
| Justera baslinje | 1 |
| Dra längd | 90,0 μm |
| Z rörelse | Konstant hastighet |
| Utöka hastigheten | 5,0 μm/s |
| Förläng tiden | 18.0 s |
| Kontakttid | 0,0 s |
| Fördröjningsläge | Konstant kraft |
| Samplingsfrekvens | 2000 Hz |
Tabell 3. Kör parametrar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med AFM som en ny och kraftfull teknik för att mäta biomekaniska egenskaper biologiska material på nanoskala nivå, mätte vi de elastiska egenskaperna hos ECM och PCM i mänskliga osteoartros ledbrosk. Brosk prover valdes enligt deras dominerande rumsliga mönster av kondrocyte organisation som en bild-baserade biomarkör för lokala vävnad degeneration. Som väntat observerades en stark nedgång i värdena för elasticitet hos både ECM och PCM längs rumsliga kondrocyt omorganisation. Dessa observationer belyser tydligt att avvikelserna i rumsliga arrangemang av kondrocyter inte bara var förknippade med förändringar i de elastiska egenskaperna hos den cellulära mikromiljön (PCM), utan även i hela brosk (ECM). Ecm/PCM-förhållandet visade inte heller några betydande förändringar trots de kraftiga förändringarna i pcm:s och ECM:s elastiska moduli under OA. Dessa resultat tyder på att förändringarna i ECM:s mekaniska egenskaper och PCM inträffade enkelriktat och samtidigt, vilket kan innebära att den progressiva förstörelsens karaktär är likartad för både PCM och ECM. OA initiering och progression utlöser således betydande PCM och ECM nedbrytning och slutligen förstörelse. Båda förlusterna var associerade med en betydande förlust av biomekaniska egenskaper artikulära brosk såsom dess elasticitet, som visas i den aktuella studien. Detta betonar den funktionella relevansen av den rumsliga organisationen av kondrocyter som en markör för biomekaniska egenskaper. Omvänt tillåter det oss att använda lokala elasticitetsmätningar för att dra slutsatser om de lokalt övervägande rumsliga mönstren och därmed broskets lokala vävnadsdegeneration.
Atomkraftmikroskopi (AFM) har vuxit fram som ett högupplöst verktyg för att studera vävnader på ett icke-förstörande sätt. Det fungerar genom att fysiskt sondera prover med en känslig och smidig cantilever som reflekterar en laser på en fotodiod. Alla förändringar i denna reflektion registreras och omvandlas till en elektrisk signal. Afm är ett kraftfullt verktyg för att genomföra mätningar av nanoskala, men det kommer inte utan dess begränsningar och fallgropar. Särskilt kritisk är cantilever beredningen genom limning av mikrosfärerna. Inom ramen för denna metod används mikrosfärer för att ändra indragsdjupet och det lokala trycket under mätningarna. Med hjälp av små mikrosfärer knutna till spetsen av sonden gör mätning av biomekaniska egenskaper hos ett fibernät snarare än elasticiteten hos enda fiber när du använder spetsen ensam. Det förhindrar också vävnadsskador under mätprocessen. På grund av cantileversensorernas känsliga natur måste ett uppmärksamt och noggrant förberedelsesätt fastställas för att uppnå konsekventa och noggranna mätningar. För att förhindra att mikrosfärerna lossnar från sensorns spets rekommenderar vi nyblandat lim som inte är äldre än en vecka. Dessutom är det viktigt för sensorns funktionalitet att placera microsphere i spetsens centrum som laterala avvikelse i microsphere fastsättning lätt resulterar i inkonsekventa mätningar.
Placera fribärande på glasblocket och fästa den med en passande fjäder är en känslig och felbenägen process som behöver noggrann uppmärksamhet och stadiga händer. Eftersom cantilevers är mycket sannolikt att förstöras av otränade operatörer, rekommenderar vi att genomföra flera provkörningar och praxis för att bekvämt hantera AFM: s lätt brytbara komponenter.
Ett rent glasblock är absolut nödvändigt att korrekt kalibrera enheten och få tillförlitliga mätningar. Smuts eller damm på blockets optiska yta kan förhindra korrekt laserjustering på fotodetektorn. Därför, om problem under laserjusteringen påträffas, kan det vara nödvändigt att tvätta av glasblocket med etanol en andra gång.
Dataanalys eller bestämning av den elastiska modulen kan utföras med Hertz-modellen enligt beskrivningen tidigare11,12. Kort sagt, de data som genereras av indrag är styrkeområden över rörelse av cantilever spets. Under mätningarna flyttas cantilever i provets riktning. Detta leder till cantileveren som gör kontakt med ta prov och därefter till dess böja i riktningmotsatsen till den som den ursprungligen rörde i. Samtidigt sker en indrag av provet med en viss mängd. För att använda Hertz-fit-modellen måste provets indrag beräknas och justeras för att isolera parametern cantilever bending. Parametern som beskriver provet är Poissons förhållande, vilket beror på det undersökta materialet. För mjuka biologiska prover är Poissons förhållande ofta inställt på 0,515. Som nämnts ovan är formen på den använda indentern relevant för beräkningen av Youngs modul, eftersom den dikterar de förlängningar som måste göras till den ursprungliga Hertz-ekvationen. Vid det beskrivna experimentet antas en sfärisk indenterform på grund av användningen av mikrosfärer.
Afm kan erbjuda nya och intressanta möjligheter att samla in data, men konsekvensen och tillförlitligheten hos de data som lämnas in beror starkt på respektive operatörs erfarenhet. Flera av de steg som beskrivs ovan är benägna att mänskliga misstag och kräver tålamod och noggrannhet för att utföra dem ordentligt.
På grund av de många känsliga variabler som kan påverka mätresultaten kan de absolutkraftvärden som rapporteras i denna studie inte generaliseras utan är ganska specifika för vår experimentella inställning. När du använder denna teknik för att utvärdera vävnadsdegeneration av brosk, vissa normaliserande mätningar på olika rumsliga mönster först måste utföras för att skala resultaten till de specifika experimentella mätinställningar närvarande. Förhållandet mellan de olika elasticitetsmoduli och rumsliga mönster kommer dock inte att påverkas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar våra medförfattare från den ursprungliga publikationen för deras hjälp och stöd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Merck | A2942 | |
| Atomic Force Microscope (AFM) | CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany | JPK00518 | |
| AFM head | (CellHesion 200) JPK | JPK00518 | |
| Biocompatible sample glue | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | H000033 | |
| Cantilever | tip C, k ¼ 7.4 N/m, All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria | AIO-TL-10 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany | 41966052 | |
| Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM) | AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany | L201306_03 | |
| Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine | (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) | F1315 | |
| Microspheres | Polysciences | 07313-5 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Petri dish heater associated with AFM | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | T-05-0117 | |
| Scalpel | Feather | 2023-01 | |
| Tissue culture dishes | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland | TPP93040 | |
| Tissue-tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | SA6255012 |
References
- Guilak, F., et al. The pericellular matrix as a transducer of biomechanical and biochemical signals in articular cartilage. Annals of the New York Academy of Sciences. 1068, 498-512 (2006).
- Peters, H. C., et al. The protective role of the pericellular matrix in chondrocyte apoptosis. Tissue Engineering Part A. 17 (15-16), 2017-2024 (2011).
- Larson, C. M., Kelley, S. S., Blackwood, A. D., Banes, A. J., Lee, G. M. Retention of the native chondrocyte pericellular matrix results in significantly improved matrix production. Matrix Biology. 21 (4), 349-359 (2002).
- Rolauffs, B., Williams, J. M., Grodzinsky, A. J., Kuettner, K. E., Cole, A. A. Distinct horizontal patterns in the spatial organization of superficial zone chondrocytes of human joints. Journal of Structural Biology. 162 (2), 335-344 (2008).
- Schumacher, B. L., Su, J. L., Lindley, K. M., Kuettner, K. E., Cole, A. A. Horizontally oriented clusters of multiple chondrons in the superficial zone of ankle, but not knee articular cartilage. The Anatomical Record. 266 (4), 241-248 (2002).
- Rolauffs, B., et al. Onset of preclinical osteoarthritis: the angular spatial organization permits early diagnosis. Arthritis Rheumatology. 63 (6), 1637-1647 (2011).
- Maver, U., Velnar, T., Gaberšček, M., Planinšek, O., Finšgar, M. Recent progressive use of atomic force microscopy in biomedical applications. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 80, 96-111 (2016).
- Polini, A., Yang, F. Physicochemical characterization of nanofiber composites. Nanofiber Composites for Biomedical Applications. Ramalingam, M., Ramakrishna, S. , Woodhead Publishing. Cambridge, UK. 97-115 (2017).
- Danalache, M., Jacobi, L. F., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Assessment of biomechanical properties of the extracellular and pericellular matrix and their interconnection throughout the course of osteoarthritis. Journal of Biomechanics. 97, 109409 (2019).
- Danalache, M., et al. Changes in stiffness and biochemical composition of the pericellular matrix as a function of spatial chondrocyte organisation in osteoarthritic cartilage. Osteoarthritis Cartilage. 27 (5), 823-832 (2019).
- Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. Robust strategies for automated AFM force curve analysis--I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials. Journal of Biomechanical Engineering. 129 (3), 430-440 (2007).
- Darling, E. M., Topel, M., Zauscher, S., Vail, T. P., Guilak, F. Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells and primary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes. Journal of Biomechanics. 41 (2), 454-464 (2008).
- Thambyah, A., Nather, A., Goh, J. Mechanical properties of articular cartilage covered by the meniscus. Osteoarthritis Cartilage. 14 (6), 580-588 (2006).
- Choi, A. P., Zheng, Y. P. Estimation of Young's modulus and Poisson's ratio of soft tissue from indentation using two different-sized indentors: finite element analysis of the finite deformation effect. Medical Biological Engineering Computing. 43 (2), 258-264 (2005).
- Jin, H., Lewis, J. L. Determination of Poisson's ratio of articular cartilage by indentation using different-sized indenters. Journal of Biomechanical Engineering. 126 (2), 138-145 (2004).
