पी एरुगिनोसा एंटी-इन्फेक्टिव्स के प्रीक्लिनिकल मूल्यांकन के लिए एयर-लिक्विड इंटरफेस पर ब्रोंकियल एपिथेलियल कोशिकाओं और मैक्रोफेज की संक्रमित 3डी सह-संस्कृति
Summary
हम एयर-लिक्विड इंटरफेस पर स्थापित CFBE41o -कोशिकाओं,टीएचपी-1 मैक्रोफेज, और स्यूडोमोनास एरुगिनोसाका उपयोग करके संक्रमित एयरवेज के त्रि-आयामी सह-संस्कृति मॉडल के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। यह मॉडल एक साथ एंटीबायोटिक प्रभावकारिता, एपिथेलियल बैरियर फ़ंक्शन और भड़काऊ मार्कर का परीक्षण करने के लिए एक नया मंच प्रदान करता है।
Abstract
फेफड़ों के संक्रमण के उपचार के लिए एफड्रग अनुसंधान उच्च जटिलता के इन विट्रो मॉडल में भविष्य कहनेवाला की दिशा में प्रगति कर रहा है। फेफड़ों के मॉडल में बैक्टीरिया की बहुमुखी उपस्थिति एपिथेलियल व्यवस्था को फिर से अनुकूलित कर सकती है, जबकि प्रतिरक्षा कोशिकाएं माइक्रोएनवायरमेंट में बैक्टीरिया के खिलाफ भड़काऊ प्रतिक्रिया का समन्वय करती हैं। जबकि वीवो मॉडल में सिस्टिक फाइब्रोसिस के संदर्भ में नए एंटी-इन्फेक्टिव्स के परीक्षण के लिए विकल्प रहे हैं, वे अभी भी मनुष्यों में ऐसी बीमारियों की वीवो स्थितियों और उपचार परिणामों की सही नकल नहीं करते हैं। मानव कोशिकाओं (ब्रोंकियल एपिथेलियल और मैक्रोफेज) और प्रासंगिक रोगजनकों के आधार पर संक्रमित वायुमार्ग के जटिल इन विट्रो मॉडल इस अंतर को पाट सकते हैं और क्लिनिक में नए एंटी-इन्फेक्टिव्स के अनुवाद को सुविधाजनक बना सकते हैं। ऐसे उद्देश्यों के लिए, मानव सिस्टिक फाइब्रोसिस ब्रोंकियल एपिथेलियल सेल– लाइन CFBE41o-और THP-1 मोनोसाइट-व्युत्पन्न मैक्रोफेज का एक सह-संस्कृति मॉडल स्थापित किया गया है, जो एयर-लिक्विड इंटरफेस (अली) स्थितियों में पी एरुगिनोसा द्वारा मानव ब्रोंकियल म्यूकोसा के संक्रमण की नकल कर रहा है । यह मॉडल सात दिनों में स्थापित किया गया है, और निम्नलिखित मापदंडों का एक साथ मूल्यांकन किया जाता है: एपिथेलियल बैरियर अखंडता, मैक्रोफेज ट्रांसफ्यूजन, बैक्टीरियल सर्वाइवल और सूजन। वर्तमान प्रोटोकॉल दवा प्रभावकारिता और मेजबान प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन करने के लिए एक मजबूत और प्रजनन प्रणाली का वर्णन करता है जो नए एंटी-इन्फेक्टिव्स की खोज और फेफड़ों में उनके एयरोसोल डिलीवरी को अनुकूलित करने के लिए प्रासंगिक हो सकता है।
Introduction
स्यूडोमोनास एरुगिनोसा सिस्टिक फाइब्रोसिस (सीएफ) में एक प्रासंगिक रोगजनक है जो फेफड़ों के ऊतकों की हानि में योगदान देता है1। पॉलीसैकराइड्स का उत्पादन, जैसे एल्गिनेट और अन्य म्यूकोइड एक्सोपॉलीसैकराइड्स, रोग की प्रगति का समन्वय करता है, जिससे दृढ़ जीवाणु पालन होता है, बैक्टीरिया के लिए एंटीबायोटिक दवाओं के वितरण को सीमित करता है और बैक्टीरिया को मेजबान प्रतिरक्षा प्रणाली के खिलाफ बचाता है2। प्लैंकटोनिक चरण से बायोफिल्म गठन तक पी एरुगिनोसा का संक्रमण इस संदर्भ में एक महत्वपूर्ण मुद्दा है, जो एंटीबायोटिक सहिष्णुता की घटना को भी सुविधाजनक बनाता है।
सीएफ के संदर्भ में, माउस मुख्य रूप से एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया है। चूहों, हालांकि, सीएफ म्यूटेशन3की शुरुआत के साथ अनायास इस बीमारी का विकास नहीं करते हैं। अधिकांश जीवाणु बायोफिल्म विकास और दवा संवेदनशीलता अध्ययन अजैविक सतहों पर किए गए हैं, जैसे पेट्री व्यंजन। हालांकि, यह दृष्टिकोण वीवो जटिलता में प्रतिनिधित्व नहीं करता है। उदाहरण के लिए, महत्वपूर्ण जैविक बाधाएं अनुपस्थित हैं, जिनमें प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ-साथ म्यूकोसल एपिथेलियम भी शामिल हैं। हालांकि पी एयरोगिनोसा एपिथेलियल कोशिकाओं के लिए काफी विषाक्त है, कुछ समूह मानव ब्रोंकियल कोशिकाओं के साथ पहले पी एरुगिनोसा बायोफिल्म को सह-खेती करने में कामयाब रहे हैं। इन कोशिकाओं की उत्पत्ति सिस्टिक फाइब्रोसिस रोगियों से सीएफटीआर उत्परिवर्तन (CFBE41o-कोशिकाओं)4 से हुई और एंटीबायोटिक प्रभावकारिता 5 का आकलन करने या संक्रमण 6 के– दौरान सीएफटीआर प्रोटीन के सुधार का आकलन करने की अनुमति दी गई ।6 इस तरह के एक मॉडल दवा प्रभावकारिता की पूर्वानुमेयता में सुधार करने के लिए दिखाया गया था, दवा विकास7के बाद के चरणों में विफल दवाओं के साथ मुद्दों के लक्षण वर्णन को सक्षम करने के अलावा ।
हालांकि, फेफड़ों में, म्यूकोसल एपिथेलियम हवा के संपर्क में आता है। इसके अलावा, वायुमार्ग में मौजूद प्रतिरक्षा कोशिकाएं, ऊतक मैक्रोफेज की तरह, सांस रोगजनकों या कणों8के खिलाफ एक आवश्यक भूमिका निभाती हैं। मैक्रोफेज ब्रोंकियल ल्यूमेन तक पहुंचने और संक्रमण से लड़ने के लिए विभिन्न कोशिका परतों के माध्यम से प्रवास करते हैं। इसके अलावा, साँस लेने वाली दवाओं को फेफड़े के वायु-रक्त बाधा 9 के अतिरिक्त गैर-सेलुलर तत्व के रूप में बलगम की उपस्थिति काभी सामनाकरना पड़ता है। दरअसल, विट्रो मॉडल में कई जटिल त्रि-आयामी (3 डी) विकसित किए गए हैं, जिसका लक्ष्य वीवो प्रासंगिकता में वृद्धि करना है। सह-संस्कृति प्रणालियां न केवल दवा की खोज के लिए इन विट्रो प्रणालियों की जटिलता को बढ़ाती हैं बल्कि सेल-सेल इंटरैक्शन का अध्ययन करने में भी सक्षम होती हैं। इस तरह की जटिलता को मैक्रोफेज माइग्रेशन10के बारे में अध्ययनों में दूर किया गया है , न्यूट्रोफिल11द्वारा एंटीमाइक्रोबियल पेप्टाइड्स की रिहाई , संक्रमण9में बलगम की भूमिका और अत्यधिक क्षति के प्रति एपिथेलियल सेल प्रतिक्रिया12. हालांकि, एक विश्वसनीय CF-इन विट्रो मॉडल है कि CF में आनुवंशिक उत्परिवर्तन सुविधाएं, कि हवा (वृद्धि हुई शारीरिक स्थिति) के संपर्क में है, और प्रतिरक्षा कोशिकाओं को एकीकृत अभी भी कमी है ।
इस अंतर को पाटने के लिए, हम संक्रमित वायुमार्ग के स्थिर मानव 3 डी सह-संस्कृति के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। यह मॉडल मानव CF ब्रोंकियल एपिथेलियल कोशिकाओं और मैक्रोफेज का गठन किया गया है, जो पी एरुगिनोसा से संक्रमित है और एक प्रसार और प्रतिरक्षा बाधा दोनों का प्रतिनिधित्व करने में सक्षम है। काफी उच्च थ्रूपुट पर एंटी-इन्फेक्टिव्स का परीक्षण करने के लक्ष्य के साथ, इस सह-संस्कृति को दो मानव सेल लाइनों का उपयोग करके अच्छी तरह से प्लेट आवेषण की पारगम्य फिल्टर झिल्ली पर स्थापित किया गया था: CFBE41o– और टीएचपी-1 मोनोसाइट-व्युत्पन्न मैक्रोफेज। इसके अलावा, अंततः एयरोसोलाइज्ड एंटी-इन्फेक्टिव्स13के बयान का अध्ययन करने के लिए, मॉडल को तरल कवर शर्तों (एलसीसी) के बजाय एयर-लिक्विड इंटरफेस (अली) में स्थापित किया गया था।
जैसा कि हम यहां रिपोर्ट करते हैं, यह मॉडल न केवल एंटीबायोटिक उपचार पर बैक्टीरियल अस्तित्व का आकलन करने की अनुमति देता है बल्कि सेल साइटोटॉक्सिकिटी, एपिथेलियल बैरियर इंटीग्रिटी, मैक्रोफेज ट्रांसफ्यूजन और भड़काऊ प्रतिक्रियाएं भी देता है, जो दवा विकास के लिए आवश्यक पैरामीटर हैं।
यह प्रोटोकॉल पल्मोनरी एयरवेज की साँस लेने की चिकित्सा के लिए दो प्रासंगिक सेल प्रकारों को जोड़ती है: मैक्रोफेज और सीएफ ब्रोंकियल एपिथेलियम। इन कोशिकाओं को पारम करने योग्य समर्थन आवेषण के विपरीत पक्षों पर वरीयता प्राप्त है, जिससे हवा के लिए सेल एक्सपोजर (जिसे एयर-लिक्विड इंटरफेस (अली) की स्थिति कहा जाता है) की अनुमति मिलती है। मेजबान कोशिकाओं की यह सह-संस्कृति बाद में पी एरुगिनोसासे संक्रमित होती है। दोनों मेजबान सेल लाइनें मानव मूल की हैं: एपिथेलियल कोशिकाएं सिस्टिक फाइब्रोसिस ब्रोंकियल एपिथेलियम का प्रतिनिधित्व करती हैं, सीएफ चैनल (CFBE41o- पर उत्परिवर्तनके साथ),और टीएचपी-114 कोशिकाएं एक अच्छी तरह से विशेषता वाली मैक्रोफेज-जैसी सेल लाइन हैं। एक कॉन्फ्ल्यूटी एपिथेलियल परत को पहले मैक्रोफेज जैसी कोशिकाओं को विपरीत डिब्बे में जोड़ने से पहले अच्छी तरह से प्लेट आवेषण के ऊपरी हिस्से पर बनाने की अनुमति है। एक बार सह संस्कृति अली में स्थापित है, प्रणाली apical पक्ष में पी aeruginosa के साथ टीका लगाया है । इस संक्रमित सह-संस्कृति प्रणाली का उपयोग एंटीबायोटिक की प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए किया जाता है, उदाहरण के लिए टोब्रामाइसिन। निम्नलिखित अंत-बिंदुओं का विश्लेषण किया जाता है: ट्रांसपेपिथेलियल इलेक्ट्रिकल रेजिस्टेंस (टीईईआर), सेल-सेल और सेल-बैक्टीरिया इंटरैक्शन का दृश्य, कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (सीएलएसएम) द्वारा, कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीएलएफओ), होस्ट सेल सर्वाइवल (साइटोटोक्लिशिसिटी) और साइटोकिन रिलीज की गिनती करके बैक्टीरियल सर्वाइवल।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह पेपर संक्रमित वायुमार्ग की 3 डी सह-संस्कृति के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है, जो मानव सिस्टिक फाइब्रोसिस ब्रोंकियल एपिथेलियल सेल लाइन CFBE41o-और मानव मोनोसाइट-व्युत्पन्न मैक्रोफेज सेल लाइन टीएचपी-1 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को यूरोपीय संघ के क्षितिज २०२० कार्यक्रम से अनुसंधान, तकनीकी विकास और अनुदान समझौते के तहत प्रदर्शन के लिए धन प्राप्त हुआ ६४२०२८ H2020-MSCA-ITN-२०१४, NABBA-डिजाइन, और उन्नत नैनोमेडिसिनों के विकास के लिए जैविक बाधाओं को दूर करने और गंभीर रोगों के इलाज के लिए । हम डॉ एना कोस्टा और डॉ जेनी Juntke सह संस्कृति के विकास पर महान समर्थन के लिए धन्यवाद, ओल्गा हार्टविग, वैज्ञानिक चित्रण के लिए, Anja Honecker, एलिसा परख के लिए, पेट्रा König, जना Westhues और डॉ चियारा डी Rossi सेल संस्कृति, विश्लेषिकी, और माइक्रोस्कोपी पर समर्थन के लिए । हम अपनी पांडुलिपि को प्रूफरीड करने के लिए चेल्सी थॉर्न को भी धन्यवाद देते हैं ।
Materials
| Accutase | Accutase | AT104 | |
| Ampicillin | Carl Roth, Germany | HP62.1 | |
| CASY TT Cell Counter and Analyzer | OLS Omni Life Sciences | – | |
| CellTrace Far Red | Thermo Fischer | C34564 | |
| Centrifuge Universal 320R | Hettich, Germany | 1406 | |
| CFBE41o– cells | 1. Gruenert Cell Line Distribution Program 2. Sigma-Aldrich |
1. gift from Dr. Dieter C. Gruenert 2. SCC151 |
|
| Chopstick Electrode Set for EVOM2, 4mm | World Precision Instruments, Sarasota, USA | STX2 | |
| Confocal Laser-Scanning Microscope CLSM | Leica, Mannheim, Germany | TCS SP 8 | |
| Cytokines ELISA Ready-SET-Go kits | Affymetrix eBioscience, USA | 15541037 | |
| Cytokines Panel I and II | LEGENDplex Immunoassay (Biolegend, USA). | 740102 | |
| Cytotoxicity Detection Kit (LDH) | Roche | 11644793001 | |
| D-(+) Glucose | Merck | 47829 | |
| Dako Fluorescence Mounting Medium | DAKO | S3023 | |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fischer | D1306 | |
| Epithelial voltohmmeter | World Precision Instruments, Sarasota, USA | EVOM2 | |
| Falcon Permeable Support for 12 Well Plate with 3.0μm Transparent PET Membrane, Sterile | Corning, Amsterdam, Netherlands | 353181 | |
| Fetal calf serum | Lonza, Basel, Switzerland | DE14-801F | |
| Goat anti-mouse (H+L) Cross-adsorbed secondary Antibody, Alexa Fluor 633 | Invitrogen | A-21050 | |
| L-Lactate Dehydrogenase (LDH), rabbit muscle | Roche, Mannheim, Germany | 10127230001 | |
| LB broth | Sigma-Aldrich, Germany | L2897-1KG | |
| MEM (Minimum Essential Medium) | Gibco Thermo Fisher Scientific Inc. | 11095072 | |
| Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco Thermo Fisher Scientific Inc. | 11140050 | |
| P. aeruginosa strain PAO1 | American Type Culture Collection | 47085 | |
| P. aeruginosa strain PAO1-GFP | American Type Culture Collection | 10145GFP | |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution -16% | EMS DIASUM | 15710-S | |
| Phosphate buffer solution buffer | Thermo Fischer | 10010023 | |
| Petri dishes | Greiner | 664102 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, Germany | P8139-1MG | |
| Precision Cover Glasses | ThorLabs | CG15KH | |
| Purified Mouse anti-human ZO-1 IgG antibody | BD Transduction Laboratories | 610966 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco by Lifetechnologies, Paisley, UK | 11875093 | |
| Soda-lime glass Petri dish, 50 x 200 mm (height x outside diameter) | Normax, Portugal | 5058561 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich, Germany | S4521 | |
| T75 culture flasks | Thermo Fischer | 156499 | |
| THP-1 cells | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ; Braunschweig, Germany) | No. ACC-16 | |
| Tobramycin sulfate salt | Sigma | T1783-500MG | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Thermo Fischer | 25300054 | |
| Tween80 | Sigma-Aldrich, Germany | P1754 |
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