P. aeruginosa Co-cultura 3D infetta di cellule epiteliali bronchiali e macrofagi all'interfaccia aria-liquido per la valutazione preclinica degli anti-infettivi

Summary

Descriviamo un protocollo per un modello di co-coltura tridimensionale di vie aeree infette, utilizzando CFBE41o^– cellule, macrofagi THP-1 e Pseudomonas aeruginosa, stabilito presso l’interfaccia aria-liquido. Questo modello fornisce una nuova piattaforma per testare simultaneamente l’efficacia antibiotica, la funzione della barriera epiteliale e i marcatori infiammatori.

Abstract

f La ricerca antidroga per il trattamento delle infezioni polmonari sta progredendo verso modelli in vitro predittivi di elevata complessità. La presenza multiforme di batteri nei modelli polmonari può riapproizionare la disposizione epiteliale, mentre le cellule immunitarie coordinano una risposta infiammatoria contro i batteri nel microambiente. Mentre i modelli in vivo sono stati la scelta per testare nuovi anti-infettivi nel contesto della fibrosi cistica, non imitano ancora con precisione le condizioni in vivo di tali malattie negli esseri umani e gli esiti del trattamento. Modelli complessi in vitro delle vie aeree infette basate su cellule umane (epiteliali bronchiali e macrofagi) e agenti patogeni rilevanti potrebbero colmare questa lacuna e facilitare la traduzione di nuovi anti-infettivi nella clinica. Per tali scopi, è stato stabilito un modello di co-coltura della linea cellulare epiteliale bronchiale della fibrosi umana CFBE41o^{– e} dei macrofagi derivati dai monociti THP-1, che imitano un’infezione della mucosa bronchiale umana da P. aeruginosa in condizioni di interfaccia aria-liquido (ALI). Questo modello è impostato in sette giorni, e i seguenti parametri sono valutati contemporaneamente: integrità barriera epiteliale, trasmigrazione macrofagi, sopravvivenza batterica, e infiammazione. Il presente protocollo descrive un sistema robusto e riproducibile per valutare l’efficacia dei farmaci e le risposte dell’ospite che potrebbe essere rilevante per scoprire nuovi anti-infettivi e ottimizzare la loro consegna di aerosol ai polmoni.

Introduction

Pseudomonas aeruginosa è un agente patogeno rilevante nella fibrosi cistica (CF) che contribuisce al danno del tessuto^{polmonare 1}. La produzione di polisaccharides, come l’alginato e altri esopolidi mucoidi, coordina il progresso della malattia, che porta ad una tenace aderenza batterica, limita la somministrazione di antibiotici ai batteri e protegge i batteri contro il sistema immunitario dell’ospite². La transizione di P. aeruginosa dallo stadio planctonic alla formazione di biofilm è una questione critica in questo contesto, facilitando anche l’insorgenza della tolleranza antibiotica.

Nel contesto di CF, il mouse è stato utilizzato principalmente come modello. I topi, tuttavia, non sviluppano spontaneamente questa malattia con l’introduzione di mutazioni CF³. La maggior parte dello sviluppo di biofilm batterici e studi di suscettibilità ai farmaci sono stati eseguiti su superfici abiotiche, come i piatti Petri. Tuttavia, questo approccio non rappresenta la complessità in vivo. Ad esempio, sono assenti importanti barriere biologiche, comprese le cellule immunitarie e l’epitelio mucoso. Anche se P. aeruginosa è abbastanza tossico per le cellule epiteliali, alcuni gruppi sono riusciti a co-coltivare un precedente biofilm P. aeruginosa con cellule bronchiali umane. Queste cellule hanno avuto origine da pazienti affetti da fibrosi cistica con mutazione CFTR (CFBE41o^– cellule)^{4 e} hanno permesso di valutare l’efficacia antibiotica⁵ o valutare la correzione della proteina CFTR durante l’infezione⁶. Tale modello è stato indicato per migliorare la prevedibilità dell’efficacia dei farmaci, oltre a consentire la caratterizzazione dei problemi con i farmaci che non sono riusciti nelle fasi successive dello sviluppo di farmaci⁷.

Tuttavia, nel polmone, l’epitelio mucoso è esposto all’aria. Inoltre, le cellule immunitarie presenti nelle vie aeree, come i macrofagi tissed, svolgono un ruolo essenziale contro gli agenti patogeni inalati o le particelle⁸. I macrofagi migrano attraverso i diversi strati cellulari per raggiungere il lume bronchiale e combattere l’infezione. Inoltre, i farmaci inalati devono anche far fronte alla presenza di muco come elemento aggiuntivo non cellulare della barriera polmonare aria-sangue⁹. Infatti, sono stati sviluppati diversi modelli complessi tridimensionali (3D) in vitro, con l’obiettivo di aumentare la rilevanza in vivo. I sistemi di co-coltura non solo aumentano la complessità dei sistemi in vitro per la scoperta di farmaci, ma consentono anche di studiare le interazioni tra cellule cellulari. Tale complessità è stata affrontata negli studi sulla migrazione dei macrofago¹⁰, il rilascio di peptidi antimicrobici da parte dei neutrofili¹¹, il ruolo del muco^{nell’infezione 9}e la reazione cellulare epiteliale a danni^{eccessivi 12}. Tuttavia, un modello in vitro affidabile infettato da CF che presenta la mutazione genetica in CF, che è esposto all’aria (maggiore condizione fisiologica), e integra le cellule immunitarie è ancora carente.

Per colmare questa lacuna, descriviamo un protocollo per la co-coltura 3D umana stabile delle vie aeree infette. Il modello è costituito da cellule epiteliali e macrofagi bronchiali CF umani, infettati da P. aeruginosa e in grado di rappresentare sia una barriera diffusionale che immunologica. Con l’obiettivo di testare gli anti-infettivi a un rendimento ragionevolmente elevato, questa co-coltura è stata stabilita sulla membrana filtro permeabile di inserti a piastre ben, utilizzando due linee cellulari umane: CFBE41o^{– e} macrofagi derivati da monociti THP-1. Inoltre, per studiare alla fine la deposizione di anti-infettivi aerosolizzati¹³, il modello è stato stabilito all’interfaccia aria-liquido (ALI) piuttosto che alle condizioni di trattamento con liquido (LCC).

Come riferiamo qui, questo modello permette di valutare non solo la sopravvivenza batterica su un trattamento antibiotico, ma anche la citotossicità cellulare, l’integrità della barriera epiteliale, la trasmigrazione dei macrophage e le risposte infiammatorie, che sono parametri essenziali per lo sviluppo di farmaci.

Questo protocollo combina due tipi di cellule rilevanti per la terapia dell’inalazione delle vie aeree polmonari: i macrofagi e l’epitelio bronchiale CF. Queste cellule sono semi su lati opposti di inserti di supporto permeabili, permettendo l’esposizione delle cellule all’aria (chiamata condizioni di interfaccia aria-liquido (ALI). Questa co-coltura delle cellule ospitante viene successivamente infettata da P. aeruginosa. Entrambe le linee cellulari ospitali sono di origine umana: le cellule epiteliali rappresentano l’epitelio bronchiale della fibrosi cistica, con una mutazione sul canale CF (CFBE41o^–), e le cellule THP-1¹⁴ sono una linea cellulare macrofamiga ben caratterizzata. Uno strato epiteliale confluente è prima permesso di formarsi sul lato superiore degli inserti di piastra del pozzo prima che le cellule macrofagi vengono aggiunte al vano opposto. Una volta stabilita la co-cultura in ALI, il sistema viene inoculato con P. aeruginosa sul lato apical. Questo sistema di co-coltura infetto viene quindi utilizzato per valutare l’efficacia di un antibiotico, ad esempio tobramicina. Vengono analizzati i seguenti punti finali: integrità della barriera epiteliale in termini di resistenza elettrica transepithelial (TEER), visualizzazione delle interazioni cellula-cellula-cellula-batterio mediante microscopia a scansione laser confocale (CLSM), sopravvivenza batterica mediante conteggio di unità formanti di colonia (CFU), sopravvivenza delle cellule ospite (citotossicità) e rilascio di citochine.

Protocol

1. Crescita e differenziazione delle cellule negli inserti di supporto permeabili Coltivare CFBE41o- in una fiaschetta T75 con 13 mL di mezzo minimo essenziale (MEM) contenente il 10% di siero di vitello fetale (FCS), 1% di amminoacidi non essenziali e glucosio 600 mg/L a 37 gradi centigradi con 5 % di atmosfera di CO2. Aggiungere mezzo fresco alle cellule ogni 2-3 giorni. Staccare le cellule dopo aver raggiunto il 70% di confluenza nel pallone con 3 mL di trypsin- acido etilenedia…

Representative Results

La figura 1A mostra la morfologia della co-coltura risultante delle cellule epiteliali bronchiali umane e dei macrofagi dopo essere cresciuta sia per 24 h sul lato apicale che basolaterale dei supporti permeabili, rispettivamente. L’integrità della barriera epiteliale è dimostrata da TEER più alto (834 Ω-cm2) e CLSM da immunostaining per la proteina di giunzione stretta O-1 (Figura 1B). Gli stessi risultati osservati in termini di integrità barri…

Discussion

Questo documento descrive un protocollo per una co-coltura 3D delle vie aeree infette, costituito dalla linea cellulare epiteliale bronchiale della fibrosi umana CFBE41o- e dalla linea cellulare macrofamizza derivata dal monocito umano THP-1. Il protocollo consente la valutazione dell’integrità della barriera epiteliale, della trasmigrazione dei macrofagio, della sopravvivenza dei batteri e dell’infiammazione, che sono parametri importanti quando si testano l’efficacia dei farmaci e le risposte dell’ospite contemporanea…

Materials

Accutase	Accutase	AT104
Ampicillin	Carl Roth, Germany	HP62.1
CASY TT Cell Counter and Analyzer	OLS Omni Life Sciences	–
CellTrace Far Red	Thermo Fischer	C34564
Centrifuge Universal 320R	Hettich, Germany	1406
CFBE41o– cells	1. Gruenert Cell Line Distribution Program 2. Sigma-Aldrich	1. gift from Dr. Dieter C. Gruenert 2. SCC151
Chopstick Electrode Set for EVOM2, 4mm	World Precision Instruments, Sarasota, USA	STX2
Confocal Laser-Scanning Microscope CLSM	Leica, Mannheim, Germany	TCS SP 8
Cytokines ELISA Ready-SET-Go kits	Affymetrix eBioscience, USA	15541037
Cytokines Panel I and II	LEGENDplex Immunoassay (Biolegend, USA).	740102
Cytotoxicity Detection Kit (LDH)	Roche	11644793001
D-(+) Glucose	Merck	47829
Dako Fluorescence Mounting Medium	DAKO	S3023
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole)	Thermo Fischer	D1306
Epithelial voltohmmeter	World Precision Instruments, Sarasota, USA	EVOM2
Falcon Permeable Support for 12 Well Plate with 3.0μm Transparent PET Membrane, Sterile	Corning, Amsterdam, Netherlands	353181
Fetal calf serum	Lonza, Basel, Switzerland	DE14-801F
Goat anti-mouse (H+L) Cross-adsorbed secondary Antibody, Alexa Fluor 633	Invitrogen	A-21050
L-Lactate Dehydrogenase (LDH), rabbit muscle	Roche, Mannheim, Germany	10127230001
LB broth	Sigma-Aldrich, Germany	L2897-1KG
MEM (Minimum Essential Medium)	Gibco Thermo Fisher Scientific Inc.	11095072
Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Gibco Thermo Fisher Scientific Inc.	11140050
P. aeruginosa strain PAO1	American Type Culture Collection	47085
P. aeruginosa strain PAO1-GFP	American Type Culture Collection	10145GFP
Paraformaldehyde Aqueous Solution -16%	EMS DIASUM	15710-S
Phosphate buffer solution buffer	Thermo Fischer	10010023
Petri dishes	Greiner	664102
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma, Germany	P8139-1MG
Precision Cover Glasses	ThorLabs	CG15KH
Purified Mouse anti-human ZO-1 IgG antibody	BD Transduction Laboratories	610966
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium	Gibco by Lifetechnologies, Paisley, UK	11875093
Soda-lime glass Petri dish, 50 x 200 mm (height x outside diameter)	Normax, Portugal	5058561
Saponin	Sigma-Aldrich, Germany	S4521
T75 culture flasks	Thermo Fischer	156499
THP-1 cells	Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ; Braunschweig, Germany)	No. ACC-16
Tobramycin sulfate salt	Sigma	T1783-500MG
Trypsin-EDTA 0.05%	Thermo Fischer	25300054
Tween80	Sigma-Aldrich, Germany	P1754