P. aeruginosa Co-culture 3D infectée des cellules épithéliales bronchiques et des macrophages à l’interface air-liquide pour l’évaluation préclinique des anti-infectieux

Summary

Nous décrivons un protocole pour un modèle tridimensionnel de co-culture des voies respiratoires infectées, utilisant CFBE41o^– cellules, macrophages THP-1, et Pseudomonas aeruginosa, établi à l’interface air-liquide. Ce modèle fournit une nouvelle plate-forme pour tester simultanément l’efficacité antibiotique, la fonction de barrière épithéliale, et les marqueurs inflammatoires.

Abstract

la recherche sur le traitement des infections pulmonaires progresse vers des modèles in vitro prédictifs de grande complexité. La présence multiforme de bactéries dans les modèles pulmonaires peut ré-adapter l’arrangement épithélial, tandis que les cellules immunitaires coordonnent une réponse inflammatoire contre les bactéries dans le microenvironnement. Bien que les modèles in vivo aient été le choix pour tester de nouveaux anti-infectieux dans le contexte de la mucoviscidose, ils n’imitent toujours pas avec précision les conditions in vivo de ces maladies chez l’homme et les résultats du traitement. Des modèles in vitro complexes des voies respiratoires infectées à base de cellules humaines (épithéliales et macrophages bronchiques) et des agents pathogènes pertinents pourraient combler cet écart et faciliter la traduction de nouveaux anti-infectieux dans la clinique. À cette fin, un modèle de coculture de la lignée épithéliale de la fibrose kystique humaine CFBE41o^– et des macrophages dérivés du monocyte THP-1 a été établi, imitant une infection de la muqueuse bronchique humaine par P. aeruginosa à des conditions d’interface air-liquide (ALI). Ce modèle est mis en place en sept jours, et les paramètres suivants sont simultanément évalués : intégrité de barrière épithéliale, transmigration de macrophage, survie bactérienne, et inflammation. Le présent protocole décrit un système robuste et reproductible pour évaluer l’efficacité des médicaments et les réponses de l’hôte qui pourrait être pertinent pour découvrir de nouveaux anti-infectieux et optimiser leur livraison d’aérosols aux poumons.

Introduction

Pseudomonas aeruginosa est un agent pathogène pertinent dans la mucoviscidose (CF) qui contribue à l’affaiblissement des tissus pulmonaires¹. La production de polysaccharides, tels que l’alginate et d’autres exopolysaccharides mucoïdes, coordonne la progression de la maladie, qui conduit à l’observance bactérienne tenace, limite la livraison d’antibiotiques aux bactéries et protège les bactéries contre le système immunitaire hôte². La transition de P. aeruginosa de l’étape planctonique à la formation de biofilm est un problème critique dans ce contexte, facilitant également l’apparition de la tolérance aux antibiotiques.

Dans le contexte des FC, la souris a été principalement utilisée comme modèle. Les souris, cependant, ne développent pas spontanément cette maladie avec l’introduction des mutations de CF³. La plupart des études sur le biofilm bactérien et la susceptibilité aux médicaments ont été réalisées sur des surfaces abiotiques, comme les boîtes de Pétri. Toutefois, cette approche ne représente pas la complexité in vivo. Par exemple, d’importantes barrières biologiques sont absentes, y compris les cellules immunitaires ainsi que l’épithélium muqueuse. Bien que P. aeruginosa soit très toxique pour les cellules épithéliales, certains groupes ont réussi à co-cultiver un biofilm P. aeruginosa plus tôt avec des cellules bronchiques humaines. Ces cellules provenaient de patients atteints de mucoviscidose présentant une mutation CFTR (CFBE41o^– cellules)⁴ et ont permis d’évaluer l’efficacité des antibiotiques⁵ ou d’évaluer la correction de la protéine CFTR pendant l’infection⁶. Un tel modèle a été montré pour améliorer la prévisibilité de l’efficacité des médicaments, en plus de permettre la caractérisation des problèmes avec les médicaments qui ont échoué dans les phases ultérieures du développement de médicaments⁷.

Cependant, dans le poumon, l’épithélium muqueuse est exposé à l’air. En outre, les cellules immunitaires présentes dans les voies respiratoires, comme les macrophages tissulaires, jouent un rôle essentiel contre les agents pathogènes inhalés ou les particules⁸. Les macrophages migrent à travers les différentes couches cellulaires pour atteindre le lumen bronchique et combattre l’infection. En outre, les médicaments inhalés doivent également faire face à la présence de mucus comme un élément non cellulaire supplémentaire de la barrière pulmonaire air-sang⁹. En effet, plusieurs modèles in vitro tridimensionnels complexes (3D) ont été développés, dans le but d’accroître la pertinence in vivo. Les systèmes de coculture augmentent non seulement la complexité des systèmes in vitro pour la découverte de médicaments, mais permettent également d’étudier les interactions cellule-cellule. Une telle complexité a été abordée dans des études sur la migration des macrophages¹⁰, la libération de peptides antimicrobiens par les neutrophiles¹¹, le rôle du mucus dans l’infection⁹, et la réaction épithéliale des cellules aux dommages excessifs¹². Cependant, un modèle in vitro fiable infecté par les FC qui présente la mutation génétique dans la FIBROSE, qui est exposée à l’air (condition physiologique accrue), et intègre les cellules immunitaires fait encore défaut.

Pour combler cet écart, nous décrivons un protocole pour la co-culture humaine stable 3D des voies respiratoires infectées. Le modèle est constitué de cellules et de macrophages épithéliales bronchiques cf humaine, infectées par P. aeruginosa et capables de représenter à la fois une barrière diffusionnelle et immunologique. Dans le but de tester des anti-infectieux à un débit raisonnablement élevé, cette co-culture a été établie sur la membrane filtrante perméable des inserts de plaque de puits, à l’aide de deux lignées cellulaires humaines : CFBE41o^– et macrophages dérivés de monocytes THP-1. En outre, pour étudier éventuellement le dépôt d’anti-infectieux aérosols¹³, le modèle a été établi à l’interface air-liquide (ALI) plutôt que dans des conditions couvertes par le liquide (LCC).

Comme nous le rapportons ici, ce modèle permet d’évaluer non seulement la survie bactérienne sur un traitement antibiotique, mais aussi la cytotoxicité cellulaire, l’intégrité de barrière épithéliale, la transmigration de macrophage, et les réponses inflammatoires, qui sont des paramètres essentiels pour le développement de drogue.

Ce protocole combine deux types de cellules pertinents pour la thérapie par inhalation des voies respiratoires pulmonaires : les macrophages et l’épithélium bronchique de CF. Ces cellules sont ensemencées sur les côtés opposés des inserts de support perméables, ce qui permet l’exposition cellulaire à l’air (appelé l’interface air-liquide (ALI) conditions). Cette co-culture des cellules hôtes est par la suite infectée par P. aeruginosa. Les deux lignées cellulaires hôtes sont d’origine humaine : les cellules épithéliales représentent l’épithélium bronchique de la fibrose kystique, avec une mutation sur le canal CF (CFBE41o^–), et les cellules THP-1¹⁴ sont une lignée cellulaire bien caractérisée comme un macrophages. Une couche épithéliale confluente est d’abord autorisée à se former sur le côté supérieur des inserts de plaque de puits avant que les cellules macrophage-like soient ajoutées au compartiment opposé. Une fois que la co-culture est établie à ALI, le système est inoculé avec P. aeruginosa du côté apical. Ce système de coculture infecté est ensuite utilisé pour évaluer l’efficacité d’un antibiotique, par exemple la tobramycine. Les points d’extrémité suivants sont analysés : intégrité des barrières épithéliales en termes de résistance électrique transépithéliale (TEER), visualisation des interactions cellule-cellule et cellule-bactériose par microscopie à balayage laser confocale (CLSM), survie bactérienne en comptant les unités de formation de colonies (CFU), survie des cellules hôtes (cytotoxicité) et libération de cytokine.

Protocol

1. Croissance et différenciation des cellules dans les inserts de support perméables Cultiver CFBE41o- dans une fiole T75 avec 13 ml de milieu essentiel minimum (MEM) contenant 10% de sérum fœtal de veau (FCS), 1% d’acides aminés non essentiels et 600 mg/L de glucose à 37 °C avec 5 % d’atmosphère CO2. Ajouter un milieu frais aux cellules tous les 2 à 3 jours. Détachez les cellules après avoir atteint 70% de confluence dans la fiole avec 3 ml d’acide trypsine- éthy…

Representative Results

La figure 1A montre la morphologie de la coculture par rapport aux cellules épithéliales bronchiques humaines et aux macrophages après avoir augmenté à la fois pendant 24 h sur le côté atical et basolateral des supports perméables, respectivement. L’intégrité de la barrière épithéliale est démontrée par teer plus élevé (834 Ω×cm2) et CLSM par immunostaining pour la protéine de jonction serrée ZO-1 (Figure 1B). Les mêmes résult…

Discussion

Cet article décrit un protocole pour une co-culture 3D des voies respiratoires infectées, constitué par la ligne de cellules épithéliales bronchiques de fibrose kystique humaine CFBE41o- et la ligne de cellules macrophages humaines dérivées de monocytes THP-1. Le protocole permet l’évaluation de l’intégrité des barrières épithéliales, de la transmigration des macrophages, de la survie des bactéries et de l’inflammation, qui sont des paramètres importants lors de l’essai simultané de l’efficacit?…

Materials

Accutase	Accutase	AT104
Ampicillin	Carl Roth, Germany	HP62.1
CASY TT Cell Counter and Analyzer	OLS Omni Life Sciences	–
CellTrace Far Red	Thermo Fischer	C34564
Centrifuge Universal 320R	Hettich, Germany	1406
CFBE41o– cells	1. Gruenert Cell Line Distribution Program 2. Sigma-Aldrich	1. gift from Dr. Dieter C. Gruenert 2. SCC151
Chopstick Electrode Set for EVOM2, 4mm	World Precision Instruments, Sarasota, USA	STX2
Confocal Laser-Scanning Microscope CLSM	Leica, Mannheim, Germany	TCS SP 8
Cytokines ELISA Ready-SET-Go kits	Affymetrix eBioscience, USA	15541037
Cytokines Panel I and II	LEGENDplex Immunoassay (Biolegend, USA).	740102
Cytotoxicity Detection Kit (LDH)	Roche	11644793001
D-(+) Glucose	Merck	47829
Dako Fluorescence Mounting Medium	DAKO	S3023
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole)	Thermo Fischer	D1306
Epithelial voltohmmeter	World Precision Instruments, Sarasota, USA	EVOM2
Falcon Permeable Support for 12 Well Plate with 3.0μm Transparent PET Membrane, Sterile	Corning, Amsterdam, Netherlands	353181
Fetal calf serum	Lonza, Basel, Switzerland	DE14-801F
Goat anti-mouse (H+L) Cross-adsorbed secondary Antibody, Alexa Fluor 633	Invitrogen	A-21050
L-Lactate Dehydrogenase (LDH), rabbit muscle	Roche, Mannheim, Germany	10127230001
LB broth	Sigma-Aldrich, Germany	L2897-1KG
MEM (Minimum Essential Medium)	Gibco Thermo Fisher Scientific Inc.	11095072
Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Gibco Thermo Fisher Scientific Inc.	11140050
P. aeruginosa strain PAO1	American Type Culture Collection	47085
P. aeruginosa strain PAO1-GFP	American Type Culture Collection	10145GFP
Paraformaldehyde Aqueous Solution -16%	EMS DIASUM	15710-S
Phosphate buffer solution buffer	Thermo Fischer	10010023
Petri dishes	Greiner	664102
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma, Germany	P8139-1MG
Precision Cover Glasses	ThorLabs	CG15KH
Purified Mouse anti-human ZO-1 IgG antibody	BD Transduction Laboratories	610966
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium	Gibco by Lifetechnologies, Paisley, UK	11875093
Soda-lime glass Petri dish, 50 x 200 mm (height x outside diameter)	Normax, Portugal	5058561
Saponin	Sigma-Aldrich, Germany	S4521
T75 culture flasks	Thermo Fischer	156499
THP-1 cells	Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ; Braunschweig, Germany)	No. ACC-16
Tobramycin sulfate salt	Sigma	T1783-500MG
Trypsin-EDTA 0.05%	Thermo Fischer	25300054
Tween80	Sigma-Aldrich, Germany	P1754