P. aeruginosa Infizierte 3D-Co-Kultur von Bronchialepithelzellen und Makrophagen an der Luft-Flüssig-Schnittstelle zur präklinischen Bewertung von Anti-Infektivika

Summary

Wir beschreiben ein Protokoll für ein dreidimensionales Co-Kultur-Modell infizierter Atemwege, mit CFBE41o^– Zellen, THP-1 Makrophagen und Pseudomonas aeruginosa, die an der Luft-Flüssig-Schnittstelle eingerichtet wurden. Dieses Modell bietet eine neue Plattform, um gleichzeitig die Wirksamkeit von Antibiotika, die Epithelbarrierefunktion und entzündungshemmende Marker zu testen.

Abstract

fDie Arzneimittelforschung zur Behandlung von Lungeninfektionen schreitet zu prädiktiven In-vitro-Modellen von hoher Komplexität bei. Die vielfältige Präsenz von Bakterien in Lungenmodellen kann die epitheliale Anordnung wieder anpassen, während Immunzellen eine Entzündungsreaktion gegen die Bakterien in der Mikroumgebung koordinieren. Während In-vivo-Modelle die Wahl waren, um neue Anti-Infektiva im Zusammenhang mit Mukoviszidose zu testen, imitieren sie immer noch nicht genau die In-vivo-Bedingungen solcher Krankheiten beim Menschen und die Behandlungsergebnisse. Komplexe In-vitro-Modelle der infizierten Atemwege auf der Grundlage menschlicher Zellen (Bronchialepithel und Makrophagen) und relevanter Krankheitserreger könnten diese Lücke überbrücken und die Übersetzung neuer Antiinfektiva in die Klinik erleichtern. Zu diesem Zweck wurde ein Kokulturmodell der menschlichen Mukoviszidose-Bronchialzelllinie CFBE41o^– und THP-1-Monozyten-abgeleiteten Makrophagen etabliert, das eine Infektion der menschlichen Bronchialschleimhaut durch P. aeruginosa unter Luft-Flüssig-Schnittstelle (ALI) nachahmt. Dieses Modell wird in sieben Tagen eingerichtet, und die folgenden Parameter werden gleichzeitig bewertet: Epithelbarriereintegrität, Makrophagentransmigration, bakterielles Überleben und Entzündungen. Das vorliegende Protokoll beschreibt ein robustes und reproduzierbares System zur Bewertung der Wirksamkeit von Arzneimitteln und wirtsreaktionen, die für die Entdeckung neuer Antiinfektiva und die Optimierung ihrer Aerosolzufuhr in die Lunge relevant sein könnten.

Introduction

Pseudomonas aeruginosa ist ein relevanter Erreger bei Mukoviszidose (CF), der zur Beeinträchtigung des Lungengewebes beiträgt¹. Die Produktion von Polysacchariden, wie Alginat und anderen Mukoid-Exopolysacchariden, koordiniert den Krankheitsverlauf, der zu einer hartnäckigen bakteriellen Haftung führt, die Abgabe von Antibiotika an Bakterien begrenzt und die Bakterien vor dem Wirtsimmunsystem schützt². Der Übergang von P. aeruginosa vom planktonischen Stadium zur Biofilmbildung ist in diesem Zusammenhang ein kritisches Thema, das auch das Auftreten von Antibiotikatoleranz erleichtert.

Im Kontext von CF wurde die Maus in erster Linie als Modell verwendet. Mäuse entwickeln diese Krankheit jedoch nicht spontan mit der Einführung von CF-Mutationen³. Die meisten bakteriellen Biofilm-Entwicklung und Arzneimittelanfälligkeit Studien wurden auf abiotischen Oberflächen durchgeführt, wie Petri-Gerichte. Dieser Ansatz stellt jedoch nicht die In-vivo-Komplexität dar. So fehlen wichtige biologische Barrieren, darunter Immunzellen sowie das Schleimhautepithel. Obwohl P. aeruginosa ziemlich toxisch für Epithelzellen ist, haben es einige Gruppen geschafft, einen früheren P. aeruginosa Biofilm mit menschlichen Bronchialzellen zu kultivieren. Diese Zellen stammten von Mukoviszidose-Patienten mit^{CFTR-Mutation} (CFBE41o – Zellen)⁴ und erlaubten es, die Wirksamkeit von Antibiotika⁵ zu bewerten oder die Korrektur des CFTR-Proteins während der Infektion⁶zu bewerten. Ein solches Modell wurde gezeigt, um die Vorhersehbarkeit der Wirksamkeit von Arzneimitteln zu verbessern, zusätzlich zur Aktivierung der Charakterisierung von Problemen mit Medikamenten, die in späteren Phasen der Arzneimittelentwicklung versagten⁷.

In der Lunge wird das Schleimhautepithel jedoch der Luft ausgesetzt. Darüber hinaus spielen Immunzellen in den Atemwegen, wie Gewebemakrophagen, eine wesentliche Rolle gegen eingeatmete Krankheitserreger oder Partikel⁸. Makrophagen wandern durch die verschiedenen Zellschichten, um das Bronchiallumen zu erreichen und die Infektion zu bekämpfen. Darüber hinaus müssen inhalierte Medikamente auch mit dem Vorhandensein von Schleim als zusätzliches nichtzelluläres Element der Lungenluft-Blut-Barriere⁹zurechtkommen. Tatsächlich wurden mehrere komplexe dreidimensionale (3D) In-vitro-Modelle entwickelt, die darauf abzielen, die In-vivo-Relevanz zu erhöhen. Co-Kultursysteme erhöhen nicht nur die Komplexität von In-vitro-Systemen für die Arzneimittelentdeckung, sondern ermöglichen auch die Untersuchung von Zell-Zell-Wechselwirkungen. Diese Komplexität wurde in Studien über Makrophagenmigration¹⁰, die Freisetzung von antimikrobiellen Peptiden durch Neutrophile¹¹, die Rolle des Schleims bei^{Infektionen 9}, und die Epithelzellreaktion auf übermäßige Schäden¹²behandelt. Ein zuverlässiges CF-infiziertes In-vitro-Modell, das die genetische Mutation in CF aufweist, der Luft ausgesetzt ist (erhöhter physiologischer Zustand), und Immunzellen integriert, fehlt noch.

Um diese Lücke zu überbrücken, beschreiben wir ein Protokoll für eine stabile menschliche 3D-Kokultur der infizierten Atemwege. Das Modell besteht aus menschlichen CF-Bronchialepithelzellen und Makrophagen, die mit P. aeruginosa infiziert sind und sowohl eine diffusionale als auch eine immunologische Barriere darstellen können. Mit dem Ziel, Anti-Infektiva bei einem relativ hohen Durchsatz zu testen, wurde diese Co-Kultur auf der durchlässigen Filtermembran von Wellplatteneinsätzen unter Verwendung von zwei menschlichen Zelllinien etabliert: CFBE41o^– und THP-1 Monozyten-abgeleitete Makrophagen. Darüber hinaus wurde das Modell zur Untersuchung der Ablagerung von aerosolisierten Antiinfektiva¹³an der luft-flüssigen Schnittstelle (ALI) und nicht an liquiden abgedeckten Bedingungen (LCC) etabliert.

Wie wir hier berichten, ermöglicht dieses Modell nicht nur die Beurteilung des bakteriellen Überlebens bei einer Antibiotikabehandlung, sondern auch die Zellzytotoxizität, die Integrität der Epithelbarriere, die Makrophagentransmigration und die Entzündungsreaktionen, die wesentliche Parameter für die Arzneimittelentwicklung sind.

Dieses Protokoll kombiniert zwei relevante Zelltypen für die Inhalationstherapie der Lungenwege: Makrophagen und CF-Bronchialepithel. Diese Zellen werden auf gegenüberliegenden Seiten von durchlässigen Stützeinsätzen gesät, wodurch die Zellexposition gegenüber Luft (sogenannte Air-Liquid Interface (ALI)-Bedingungen) möglich ist. Diese Kokultur der Wirtszellen wird anschließend mit P. aeruginosainfiziert. Beide Wirtszelllinien sind menschlicher Herkunft: Die Epithelzellen stellen das mukovisenfibrosebronchiale Epithel dar, mit einer Mutation auf dem CF-Kanal (CFBE41o^{– ),}und die THP-1^14-Zellen sind eine gut charakterisierte Makrophage-ähnliche Zelllinie. Eine konfluente Epithelschicht darf sich zunächst auf der Oberseite von Brunnenplatteneinsätzen bilden, bevor die makrophageähnlichen Zellen dem gegenüberliegenden Fach hinzugefügt werden. Sobald die Kokultur bei ALI etabliert ist, wird das System mit P. aeruginosa an der apikalen Seite geimpft. Dieses infizierte Co-Kultursystem wird dann verwendet, um die Wirksamkeit eines Antibiotikums, z. B. Tobramycin, zu bewerten. Folgende Endpunkte werden analysiert: epitheliale Barriereintegrität in Bezug auf transepitheliale elektrische Resistenz (TEER), Visualisierung von Zell-Zell- und Zell-Bakterien-Wechselwirkungen durch konfokale Laserscanmikroskopie (CLSM), bakterielles Überleben durch Zählung koloniebildender Einheiten (CFU), Überleben der Wirtszellen (Zytotoxizität) und Zytokinfreisetzung.

Protocol

1. Wachstum und Differenzierung von Zellen in durchlässigen Stützeinsätzen CFBE41o kultivieren- in einem T75-Kolben mit 13 ml minimalem essentiellen Medium (MEM) mit 10% fetalem Kalbsserum (FCS), 1% nicht essentiellen Aminosäuren und 600 mg/L Glukose bei 37 °C mit 5 %CO2-Atmosphäre. Fügen Sie den Zellen alle 2–3 Tage frisches Medium hinzu. Lösen Sie die Zellen nach Erreichen von 70% Zusammenfluss im Kolben mit 3 ml Trypsin- Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) bei 37°C f…

Representative Results

Abbildung 1A zeigt die Morphologie der resultierenden Kokultur menschlicher Bronchialepithelzellen und Makrophagen, nachdem sie sowohl für 24 h auf der apikalen bzw. basolateralen Seite durchlässiger Stützen gewachsen sind. Die Epithelbarriereintegrität wird durch höhere TEER (834 x2) und CLSM durch Immunfärbung für das enge Knotenprotein ZO-1 (Abbildung 1B) gezeigt. Die gleichen Ergebnisse, die in Bezug auf die- Barriereintegrität …

Discussion

Dieses Papier beschreibt ein Protokoll für eine 3D-Kokultur der infizierten Atemwege, bestehend aus der menschlichen Mukoviszidose-Bronchialzelllinie CFBE41o- und der menschlichen Monozyten-abgeleiteten Makrophagenzelllinie THP-1. Das Protokoll ermöglicht die Beurteilung der Epithelbarriereintegrität, Makrophagentransmigration, des Überlebens von Bakterien und Entzündungen, die wichtige Parameter bei der gleichzeitigen Prüfung der Wirksamkeit von Arzneimitteln und der Wirtsreaktionen sind. Die Neuheit im Modell lie…

Materials

Accutase	Accutase	AT104
Ampicillin	Carl Roth, Germany	HP62.1
CASY TT Cell Counter and Analyzer	OLS Omni Life Sciences	–
CellTrace Far Red	Thermo Fischer	C34564
Centrifuge Universal 320R	Hettich, Germany	1406
CFBE41o– cells	1. Gruenert Cell Line Distribution Program 2. Sigma-Aldrich	1. gift from Dr. Dieter C. Gruenert 2. SCC151
Chopstick Electrode Set for EVOM2, 4mm	World Precision Instruments, Sarasota, USA	STX2
Confocal Laser-Scanning Microscope CLSM	Leica, Mannheim, Germany	TCS SP 8
Cytokines ELISA Ready-SET-Go kits	Affymetrix eBioscience, USA	15541037
Cytokines Panel I and II	LEGENDplex Immunoassay (Biolegend, USA).	740102
Cytotoxicity Detection Kit (LDH)	Roche	11644793001
D-(+) Glucose	Merck	47829
Dako Fluorescence Mounting Medium	DAKO	S3023
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole)	Thermo Fischer	D1306
Epithelial voltohmmeter	World Precision Instruments, Sarasota, USA	EVOM2
Falcon Permeable Support for 12 Well Plate with 3.0μm Transparent PET Membrane, Sterile	Corning, Amsterdam, Netherlands	353181
Fetal calf serum	Lonza, Basel, Switzerland	DE14-801F
Goat anti-mouse (H+L) Cross-adsorbed secondary Antibody, Alexa Fluor 633	Invitrogen	A-21050
L-Lactate Dehydrogenase (LDH), rabbit muscle	Roche, Mannheim, Germany	10127230001
LB broth	Sigma-Aldrich, Germany	L2897-1KG
MEM (Minimum Essential Medium)	Gibco Thermo Fisher Scientific Inc.	11095072
Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Gibco Thermo Fisher Scientific Inc.	11140050
P. aeruginosa strain PAO1	American Type Culture Collection	47085
P. aeruginosa strain PAO1-GFP	American Type Culture Collection	10145GFP
Paraformaldehyde Aqueous Solution -16%	EMS DIASUM	15710-S
Phosphate buffer solution buffer	Thermo Fischer	10010023
Petri dishes	Greiner	664102
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma, Germany	P8139-1MG
Precision Cover Glasses	ThorLabs	CG15KH
Purified Mouse anti-human ZO-1 IgG antibody	BD Transduction Laboratories	610966
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium	Gibco by Lifetechnologies, Paisley, UK	11875093
Soda-lime glass Petri dish, 50 x 200 mm (height x outside diameter)	Normax, Portugal	5058561
Saponin	Sigma-Aldrich, Germany	S4521
T75 culture flasks	Thermo Fischer	156499
THP-1 cells	Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ; Braunschweig, Germany)	No. ACC-16
Tobramycin sulfate salt	Sigma	T1783-500MG
Trypsin-EDTA 0.05%	Thermo Fischer	25300054
Tween80	Sigma-Aldrich, Germany	P1754