Klikkkjemibasert fluorometrisk analyse for apolipoprotein N-acyltransferase fra enzymkarakterisering til høy gjennomstrømningsscreening

Summary

Presentert her er en sensitiv fluorescensanalyse for å overvåke apolipoprotein N-acyltransferaseaktivitet ved bruk av diacylglycerylpeptid og alkyn-fosfolipider som substrater med klikkkjemi.

Abstract

Lipoproteiner fra proteobakterier er posttranslasjonelt modifisert av fettsyrer avledet fra membranfosfolipider ved virkningen av tre integrerte membranenzymer, noe som resulterer i triacylerte proteiner. Det første trinnet i lipoproteinmodifiseringsveien innebærer overføring av en diacylglycerylgruppe fra fosfatidylglyserol til prolipoproteinet, noe som resulterer i diacylglyceryl prolipoprotein. I det andre trinnet spaltes signalpeptidet til prolipoprotein, og danner et apolipoprotein, som igjen modifiseres av en tredje fettsyre avledet fra et fosfolipid. Dette siste trinnet katalyseres av apolipoprotein N-acyltransferase (Lnt). Lipoproteinmodifiseringsveien er viktig i de fleste γ-proteobakterier, noe som gjør det til et potensielt mål for utvikling av nye antibakterielle midler. Beskrevet her er en sensitiv analyse for Lnt som er kompatibel med høy gjennomstrømningsscreening av små hemmende molekyler. Enzymet og substratene er membran-innebygde molekyler; Derfor er utviklingen av en in vitro-test ikke enkel. Dette inkluderer rensing av det aktive enzymet i nærvær av vaskemiddel, tilgjengeligheten av alkyn-fosfolipider og diacylglycerylpeptidsubstrater, og reaksjonsbetingelsene i blandede miceller. Videre, for å kunne bruke aktivitetstesten i et oppsett med høy gjennomstrømningsscreening (HTS), foretrekkes direkte avlesning av reaksjonsproduktet fremfor koblede enzymatiske reaksjoner. I denne fluorometriske enzymanalysen blir det alkyntriacylerte peptidproduktet gjort fluorescerende gjennom en klikkkjemireaksjon og detektert i et multiwell plateformat. Denne metoden gjelder for andre acyltransferaser som bruker fettsyreholdige substrater, inkludert fosfolipider og acyl-CoA.

Introduction

Bakterielle lipoproteiner er preget av kovalent bundne fettsyrer ved deres amino-termini gjennom hvilke de er forankret i membraner ^1,2. Den modne delen av proteinet er svært variert i struktur og funksjon, og forklarer dermed lipoproteinets rolle i forskjellige biologiske prosesser i bakteriecellehylsteret.

Lipoproteiner modifiseres av fosfolipidavledede fettsyrer etter innføring i cytoplasmisk membran. Prolipoproteinene inneholder et signaturmotiv, lipoboksen, som inneholder en invariant cysteinrest som blir acylert og den første aminosyren i det modne proteinet. Det første trinnet i denne banen katalyseres av prolipoprotein fosfatidylglycerol: :d iacylglyceryltransferase (Lgt), som overfører diacylglycerylgruppen fra fosfatidylglyserol til prolipoproteinet via en tioeterforbindelse mellom diacylglyceryl og cystein. Signalpeptidase II (Lsp) spalter signalpeptidet fra diacylglyceryl prolipoprotein, noe som resulterer i et apolipoprotein som er forankret i membranen gjennom sin diacylglyceryl-del. Det tredje og siste trinnet katalyseres av apolipoprotein N-acyltransferase (Lnt), som tilfører en fettsyre fra sn-1-posisjonen av fosfolipid til apolipoprotein, noe som resulterer i triacylert modent lipoprotein (figur 1)³. Lnt-reaksjonen er en to-trinns ping-pong-reaksjon hvor et stabilt tioester acylenzym-mellomprodukt dannes. Lysofosfolipidbiproduktet frigjøres før acylering av apolipoproteinsubstratet i det andre trinnet av reaksjonen.

Fosfolipidsubstratets spesifisitet bestemmes i en Llt-analyse basert på mobilitetsskiftet av N-acyl diacylglycerylpeptid på en høy prosentandel Tris-Tricine Urea SDS-SIDE⁴. Fosfolipider med små polare hodegrupper, mettede [sn-1] og ikke-mettede [sn-2], var foretrukne substrater⁴. Gelskiftanalysen er ikke egnet for omfattende kinetiske studier av apolipoprotein N-acyltransferase eller for HTS for å identifisere hemmende molekyler. Klikkkjemi ved bruk av alkynfettsyrer har blitt brukt til å studere lipoproteinmodifisering i bakterier⁵ og fettsyremetabolisme i eukaryoter⁶. Nylig ble det rapportert en in vitro-analyse av Ras palmitoylation for å identifisere inhibitorer⁷.

I metoden beskrevet her inkuberes renset aktiv Lnt i vaskemiddel med substrater i blandede miceller for å danne alkyntriacylert peptid som senere detekteres ved fluorescensspektrometri.

Protocol

1. Enzym- og substratpreparasjon Rensing av enzym Produser og rens Lnt-enzymet fra vaskemiddelløselige membraner som beskrevet tidligere 4,8. Kort sagt, indusere ekspresjon av lnt-strep genet, koding Lnt med en C-terminal Strep tag, ved OD 600 av 0,6 med vannfri tetracyklin (200 ng / ml) ved 37 ° C for 16 timer. Høst celler ved sentrifugering ved 4000 x g i 10 minutter og kast supernat…

Representative Results

I Lnt-reaksjonen overføres sn-1-fettsyren fra fosfolipider til et diacylglycerylpeptid, noe som resulterer i modent triacylert peptid8. In vitro Lnt-analysen beskrevet her er designet for å bruke fosfolipider som inneholder en alkynfettsyre (alkyn-POPE) og FSL-1-biotin som substrater, noe som resulterer i dannelsen av alkyn-FSL-1-biotin. Ved en klikkkjemireaksjon med azido-FAM skal dette produktet bli fluorescerende merket og detektert ved fluorescensspektrometri (f…

Discussion

Protokollen for Lnt-analysen beskrevet her, basert på fluorescensdeteksjon av det triacylerte produktet, er følsom og reproduserbar. Den spesifikke og effektive bindingen av biotin til streptavidin er et sentralt element i analysen. Alkyne-POPE-substrat igjen etter fullføring av Lnt-reaksjonen er også fluorescerende merket med FAM, men fjernes effektivt etter binding på streptavidinplatene ved flere vasketrinn. Videre påvirker tillegg av DMSO ikke LNT-aktiviteten og har ingen innvirkning på analysen. Både substra…

Materials

Äkta Purifier FPLC system	GE Healthcare	NA	Purity: NA Lnt purification
alkyne-POPE	Avanti Polar Lipids	900414P	Purity: >99% Lnt substrate
Azido-FAM	Lumiprobe	A4130	Purity: 100% (pure) Click reagent
BioPhotometer Plus	Eppendorf	N/A	Purity: NA OD 600 nm
BioTek ELX 405 Select plate washer	BioTek	N° serie 115800, n° materiel 405 Select	Purity: NA Wash steps
biotin-fluorescein	Sigma	53608	Purity: ≥90% Fluorescence control
Copper(II) sulfate pentahydrate	Sigma	C3036	Purity: ≥98% Click reagent
DDM	Anatrace	D310A	Purity: ≥ 99% β+α; < 15% α Detergent for Lnt purification
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Invitrogen	D12435	Purity: anhydrous Solbilization Click reagent
Electronic pipet Voyager 8 channels 0.5-12.5 uL	INTEGRA	4721	Purity: NA Handling reagents
French Pressure Cell	N/A	N/A	Purity: NA Cell disruption
FSL-1-biotin	EMC microcollections	L7030	Purity: NA Lnt substrate
Greiner Bio-One 384-well standard CELLSTAR polystyrene microplate	Greiner	781091	Purity: NA Black with transparent bottom (up or bottom reading)
Greiner Bio-One 96-well sterile polystyrene plate, high binding	Greiner	655097	Purity: NA Black with transparent bottom (up or bottom reading)
Microplate reader Infinite M1000 pro	Tecan	N/A	Purity: NA Fluorescence detection
MTSES (sodium (2-sulfonatoethyl)methanethiosulfonate)	Anatrace	S110MT	Purity: ~100% Thiol specific inhibitor
Optically Clear Adhesive Seal Sheets	Thermo Scientific	AB-1170	Purity: NA Foil to seal multi-well plate
Sephacryl S400 HR 16/60 gel filtration column	GE Healthcare	GE28-9356-04	Purity: NA Lnt purification
StrepTactin Sepharose 50 %	IBA Biotechnology	2-1201-010	Purity: NA Lnt purification
streptavidin	Sigma	S4762-1MG	Purity: ≥13 units/mg protein Biotin binding
TBTA (tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine	Sigma	678937	Purity: 97% Click reagent
TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride	Sigma	75259	Purity: ≥98% Click reagent
TECAN Infinite F500	Tecan	N/A	Purity: NA Fluorescence detection
TECAN Infinite M1000 pro	Tecan	N/A	Purity: NA Fluorescence detection
Thermomixer C	Eppendorf	5382000015	Purity: NA Heated lid
Triton X-100	Sigma	93443	Purity: 10% in H2O Lnt reaction buffer
Ultra centrifuge	Beckman LC	N/A	Purity: NA Cell fractionation