Klickkemibaserad fluorometrisk analys för apolipoprotein N-acyltransferas från enzymkarakterisering till screening med hög genomströmning
Summary
Här presenteras en känslig fluorescensanalys för att övervaka apolipoprotein N-acyltransferasaktivitet med diacylglycerylpeptid och alkyn-fosfolipider som substrat med klickkemi.
Abstract
Lipoproteiner från proteobakterier modifieras posttranslationellt av fettsyror härledda från membranfosfolipider genom verkan av tre integrerade membranenzymer, vilket resulterar i triacylerade proteiner. Det första steget i lipoproteinmodifieringsvägen involverar överföring av en diacylglycerylgrupp från fosfatidylglycerol till prolipoproteinet, vilket resulterar i diacylglycerylprolipoprotein. I det andra steget klyvs signalpeptiden av prolipoprotein och bildar ett apolipoprotein, vilket i sin tur modifieras av en tredje fettsyra härledd från en fosfolipid. Detta sista steg katalyseras av apolipoprotein N-acyltransferas (Lnt). Lipoproteinmodifieringsvägen är avgörande i de flesta γ-proteobakterier, vilket gör den till ett potentiellt mål för utveckling av nya antibakteriella medel. Här beskrivs en känslig analys för Lnt som är kompatibel med screening med hög genomströmning av små hämmande molekyler. Enzymet och substraten är membraninbäddade molekyler; Därför är det inte helt enkelt att utveckla ett in vitro-test. Detta inkluderar rening av det aktiva enzymet i närvaro av tvättmedel, tillgängligheten av alkyn-fosfolipider och diacylglycerylpeptidsubstrat och reaktionsbetingelserna i blandade miceller . För att kunna använda aktivitetstestet i en HTS-inställning (high-throughput screening) föredras dessutom direkt avläsning av reaktionsprodukten framför kopplade enzymatiska reaktioner. I denna fluorometriska enzymanalys görs den alkyn-triacylerade peptidprodukten fluorescerande genom en klickkemireaktion och detekteras i ett multiwell-plattformat. Denna metod är tillämplig på andra acyltransferaser som använder fettsyrainnehållande substrat, inklusive fosfolipider och acyl-CoA.
Introduction
Bakteriella lipoproteiner kännetecknas av kovalent bundna fettsyror vid deras aminoterminer genom vilka de förankras i membran 1,2. Den mogna delen av proteinet är mycket varierande i struktur och funktion, vilket förklarar lipoproteinernas roll i olika biologiska processer i bakteriecellhöljet.
Lipoproteiner modifieras av fosfolipid-härledda fettsyror efter införande i det cytoplasmatiska membranet. Prolipoproteinerna innehåller ett signaturmotiv, lipoboxen, som innehåller en invariant cysteinrest som acyleras och den första aminosyran i det mogna proteinet. Det första steget i denna väg katalyseras av prolipoproteinfosfatidylglycerol::d iacylglyceryltransferas (Lgt), som överför diacylglycerylgruppen från fosfatidylglycerol till prolipoproteinet via en tioeterlänk mellan diacylglyceryl och cystein. Signalpeptidas II (Lsp) klyver signalpeptiden från diacylglycerylprolipoprotein, vilket resulterar i ett apolipoprotein som förankras i membranet genom dess diacylglyceryldel. Det tredje och sista steget katalyseras av apolipoprotein N-acyltransferas (Lnt), som tillför en fettsyra från sn-1-positionen av fosfolipid till apolipoprotein, vilket resulterar i triacylerat moget lipoprotein (figur 1)3. Lnt-reaktionen är en tvåstegs pingisreaktion där en stabil tioesteracylenzym mellanprodukt bildas. Lysofosfolipidbiprodukten frisätts före acylationen av apolipoproteinsubstratet i reaktionens andra steg.
Fosfolipidsubstratspecificiteten bestäms i en Lnt-analys baserat på rörlighetsförskjutningen av N-acyl diacylglycerylpeptid på en hög procentandel Tris-Tricine Urea SDS-PAGE4. Fosfolipider med små polära huvudgrupper, mättade [sn-1] och omättade [sn-2], var föredragna substrat 4. Gelskiftanalysen är inte lämplig för omfattande kinetiska studier av apolipoprotein N-acyltransferas eller för HTS för att identifiera hämmande molekyler. Klickkemi med alkynfettsyror har framgångsrikt använts för att studera lipoproteinmodifiering i bakterier5 och fettsyrametabolism i eukaryoter6. Nyligen rapporterades en in vitro-analys av Ras palmitoylation för att identifiera hämmare7.
I den metod som beskrivs här inkuberas renat aktivt Lnt i tvättmedel med substrat i blandade miceller för att bilda alkyn-triacylerad peptid som därefter detekteras genom fluorescensspektrometri.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollet för Lnt-analysen som beskrivs här, baserat på fluorescensdetektion av den triacylerade produkten, är känsligt och reproducerbart. Den specifika och effektiva bindningen av biotin till streptavidin är ett nyckelelement i analysen. Alkyne-POPE-substrat kvar efter avslutad Lnt-reaktion är också fluorescerande märkt med FAM men avlägsnas effektivt efter bindning på streptavidinplattorna med flera tvättsteg. Dessutom påverkar tillägg av DMSO inte Lnt-aktiviteten och har ingen inverkan på analysen. B…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Fabrice Agou och Alix Boucharlat från Chemogenomic and Biological Screening Platform, Center for Technological Resources and Research (C2RT) vid Institut Pasteur Paris för användbara förslag på protokollet, alla medlemmar i BGPB-enheten för stöd och vetenskapliga diskussioner och Simon Legood för kritisk läsning av manuskriptet. Arbetet finansierades av globala vårdinitiativ från Institute Carnot Infectious diseases och Institute Carnot Microbes and Health (15 CARN 0017-01 och 16 CARN 0023-01).
Materials
| Äkta Purifier FPLC system | GE Healthcare | NA | Purity: NA Lnt purification |
| alkyne-POPE | Avanti Polar Lipids | 900414P | Purity: >99% Lnt substrate |
| Azido-FAM | Lumiprobe | A4130 | Purity: 100% (pure) Click reagent |
| BioPhotometer Plus | Eppendorf | N/A | Purity: NA OD 600 nm |
| BioTek ELX 405 Select plate washer | BioTek | N° serie 115800, n° materiel 405 Select | Purity: NA Wash steps |
| biotin-fluorescein | Sigma | 53608 | Purity: ≥90% Fluorescence control |
| Copper(II) sulfate pentahydrate | Sigma | C3036 | Purity: ≥98% Click reagent |
| DDM | Anatrace | D310A | Purity: ≥ 99% β+α; < 15% α Detergent for Lnt purification |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Invitrogen | D12435 | Purity: anhydrous Solbilization Click reagent |
| Electronic pipet Voyager 8 channels 0.5-12.5 uL | INTEGRA | 4721 | Purity: NA Handling reagents |
| French Pressure Cell | N/A | N/A | Purity: NA Cell disruption |
| FSL-1-biotin | EMC microcollections | L7030 | Purity: NA Lnt substrate |
| Greiner Bio-One 384-well standard CELLSTAR polystyrene microplate | Greiner | 781091 | Purity: NA Black with transparent bottom (up or bottom reading) |
| Greiner Bio-One 96-well sterile polystyrene plate, high binding | Greiner | 655097 | Purity: NA Black with transparent bottom (up or bottom reading) |
| Microplate reader Infinite M1000 pro | Tecan | N/A | Purity: NA Fluorescence detection |
| MTSES (sodium (2-sulfonatoethyl)methanethiosulfonate) | Anatrace | S110MT | Purity: ~100% Thiol specific inhibitor |
| Optically Clear Adhesive Seal Sheets | Thermo Scientific | AB-1170 | Purity: NA Foil to seal multi-well plate |
| Sephacryl S400 HR 16/60 gel filtration column | GE Healthcare | GE28-9356-04 | Purity: NA Lnt purification |
| StrepTactin Sepharose 50 % | IBA Biotechnology | 2-1201-010 | Purity: NA Lnt purification |
| streptavidin | Sigma | S4762-1MG | Purity: ≥13 units/mg protein Biotin binding |
| TBTA (tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine | Sigma | 678937 | Purity: 97% Click reagent |
| TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma | 75259 | Purity: ≥98% Click reagent |
| TECAN Infinite F500 | Tecan | N/A | Purity: NA Fluorescence detection |
| TECAN Infinite M1000 pro | Tecan | N/A | Purity: NA Fluorescence detection |
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382000015 | Purity: NA Heated lid |
| Triton X-100 | Sigma | 93443 | Purity: 10% in H2O Lnt reaction buffer |
| Ultra centrifuge | Beckman LC | N/A | Purity: NA Cell fractionation |
References
- Buddelmeijer, N. The molecular mechanism of bacterial lipoprotein modification–how, when and why. FEMS Microbiology Reviews. 39 (2), 246-261 (2015).
- Kovacs-Simon, A., Titball, R. W., Michell, S. L. Lipoproteins of bacterial pathogens. Infections and Immunity. 79 (2), 548-561 (2010).
- Jackowski, S., Rock, C. O. Transfer of fatty acids from the 1-position of phosphatidylethanolamine to the major outer membrane lipoprotein of Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry. 261, 11328-11333 (1986).
- Hillmann, F., Argentini, M., Buddelmeijer, N. Kinetics and phospholipid specificity of apolipoprotein N-acyltransferase. Journal of Biological Chemistry. 286 (32), 27936-27946 (2011).
- Rangan, K. J., Yang, Y. Y., Charron, G., Hang, H. C. Rapid Visualization and Large-Scale Profiling of Bacterial Lipoproteins with Chemical Reporters. Journal of American Chemical Society. 132 (31), 10628-10629 (2010).
- Thiele, C., et al. Tracing fatty acid metabolism by click-chemistry. ACS Chemical Biology. 7 (12), 2004-2011 (2012).
- Ganesan, L., Shieh, P., Bertozzi, C. R., Levental, I. Click-Chemistry Based High Throughput Screening Platform for Modulators of Ras Palmitoylation. Science Reports. 7, 41147 (2017).
- Nozeret, K., Boucharlat, A., Agou, F., Buddelmeijer, N. A sensitive fluorescence-based assay to monitor enzymatic activity of the essential integral membrane protein Apolipoprotein N-acyltransferase (Lnt). Science Reports. 9 (1), 15978 (2019).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecules Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Mao, G., et al. Crystal structure of E. coli lipoprotein diacylglyceryl transferase. Nature Communication. 7, 10198 (2016).
- Vogeley, L., et al. Structural basis of lipoprotein signal peptidase II action and inhibition by the antibiotic globomycin. Science. 351 (6275), 876-880 (2016).
- Wiktor, M., et al. Structural insights into the mechanism of the membrane integral N-acyltransferase step in bacterial lipoprotein synthesis. Nature Communication. 8, 15952 (2017).
- Noland, C. L., et al. Structural insights into lipoprotein N-acylation by Escherichia coli apolipoprotein N-acyltransferase. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (30), 6044-6053 (2017).
- Lu, G., et al. Crystal structure of E. coli apolipoprotein N-acyl transferase. Nature Communication. 8, 15948 (2017).
