为高浓度单分子显微镜制造零模式波导

Summary

这里描述的是一种纳米球平板成像方法，用于平行制造零模式波导，这是金属包玻璃显微镜覆盖带中的纳米阵列，用于在纳米到微摩尔浓度的荧光素下进行单分子成像。该方法利用胶体晶体自组装创建波导模板。

Abstract

在单分子荧光酶学中，溶液中标记基材的背景荧光通常将荧光浓度限制在皮科至纳米摩尔范围内，其数量级小于许多生理配体浓度。称为零模式波导 （ZMWs） 的光学纳米结构，直径为 100 至 200 nm，由铝或金等薄导金属制造，通过将可见光激发限制在沸点有效体积中，从而允许在氟叶微摩尔浓度下对单个分子进行成像。然而，对昂贵和专门的纳米制造设备的需求已经排除了ZMW的广泛使用。 通常，ZMW等纳米结构是通过直接书写获得的，电子束光刻是连续的和缓慢的。在这里，胶体或纳米球，光刻学被用作替代策略，以创建纳米级的面罩，用于波导制造。本报告详细描述了该方法，并考虑到每个阶段的实际情况。该方法允许数千个铝或金ZMW并行制造，最终波导直径和深度为100-200纳米。只需要普通的实验室设备和用于金属沉积的热蒸发器。通过使ZMW更容易进入生化社区，这种方法可以促进细胞浓度和速率分子过程的研究。

Introduction

单分子荧光共振能量转移（smFRET）或单分子荧光相关光谱（FCS）等单分子技术是分子生物物理学的有力工具，能够研究单个生物分子在转录^1、2、3、翻译^4、5、6等^过程中的动态运动、构象和相互作用。对于 smFRET 来说，总内部反射荧光 （TIRF） 显微镜是一种常见方法，因为随着时间的推移，许多系绳分子可能会被跟踪，而 TIR 产生的消散波仅限于与盖唇⁸相邻的 100 至 200 nm 区域。然而，即使这种对激发体积的限制，感兴趣的荧光仍然需要稀释到pM或nM范围，以检测单分子信号以上的背景荧光^9。由于细胞酶的Mi michaelis-Menten常数通常在μM到mM范围¹⁰之间，单分子研究中的生化反应通常比细胞中的生化反应慢得多。例如，蛋白质合成发生在大肠杆菌11，12中每秒^15-20氨基酸，而大多数蛋白核糖体在smFRET实验中翻译为每秒0.1+1氨基酸^每秒13。在蛋白质合成中，停滞核糖体上的晶体结构和smFRET显示，在tRNA-mRNA转移步骤^14、15之前^，转移RNA（tRNA）在”混合”和”经典”状态之间波动。然而，当迁移GTPase因子（EF-G）的生理浓度存在时，在smFRET⁶中观察到了混合状态和经典状态之间的不同构象。以与细胞中相似的速度和浓度研究动态分子过程很重要，但仍然是一项技术挑战。

提高荧光基板浓度的策略是使用金属基亚可见波长光圈（称为零模式波引（ZMWs））来生成密闭激发场，选择性地激发孔径^内局部化的生物分子（图1）。光圈的直径一般为100~200纳米^，深度为100~150纳米。在与井的大小和形状相关的截止波长以上_（≈以水为介电介质¹⁸的圆形波导直径为 2.3 倍），波导不允许传播模式，因此称为”零模式波导”。然而，一个振荡的电磁场，称为消逝波，呈指数级衰减的强度仍然隧道短距离进入波导^18，19。虽然与 TIR 消逝波类似，但 ZMW 消逝波的衰变常数较短，导致波导内的有效激发区域为 10~30 nm。在荧光标记配体的微摩尔浓度下，激发区域内同时存在一个或几个分子。这种对激发体积的限制以及随之而来的背景荧光减少，使单分子在生物学上相关的浓度下能够进行荧光成像。这已应用于许多系统^20，包括FCS测量单一蛋白质扩散^21，单分子FRET测量低亲和力配体蛋白²²和蛋白质-蛋白质相互作用^23，光谱电化学测量单分子周转事件^24。

ZMW是使用离子束铣削^25、26或电子束光刻（EBL）直接对金属层进行图案化而生产的，然后是等离子体蚀刻16、27。这些无面具光刻方法可创建系列波导，通常需要访问专门的纳米制造设施，从而阻止 ZMW 技术的广泛采用。另一种方法，紫外线纳米印花平版印刷升空^28，使用石英滑动模具按反ZMW模板到电阻膜像邮票。虽然这种方法更精简，它仍然需要EBL来制造石英模具。本文介绍了一种简单且廉价的模板制造方法的协议，该方法不需要 EBL 或离子束铣削，并且基于纳米球的紧密包装，以形成平版面罩。

纳米球或”自然”光刻学于1982年由德克曼和邓斯缪尔^29，30首次提出，使用单分散胶体粒子的自组装，从几十纳米到几十微米^31，通过蚀刻和/或材料沉积创建表面图案的模板。二维（2D）或三维（3D）胶体粒子的扩展周期阵列，称为胶体晶体，其特点是散射和衍射³²的明亮虹彩。虽然比电子束或光刻技术应用较少，但这种遮盖方法简单、成本低，而且很容易缩小，以创建低于 100 nm 的功能大小。

指导胶体粒子的自组装决定了使用胶体晶体作为表面图案的面具的成功。如果粒子的大小和形状是同质的，胶体粒子可以很容易地用六边形包装自行组装，由热带耗竭³³驱动。滴涂后水蒸发是沉积胶体颗粒的有效途径，但其他方法包括浸涂^34、旋转涂层^35、电泳沉积³⁶和空气-水界面³⁷的巩固。下面提出的协议基于蒸发沉积方法，这是最简单的实现方法。紧密包装的聚苯乙烯珠之间的三角形间歇形成开口，在开口中镀一个牺牲金属，形成柱子（图2 和 补充图1）。在此步骤调整这些柱子的形状和直径之前，珠子的简短退火。删除珠子，在柱子周围沉积最后一层金属层，然后移除柱子。在两个金属沉积步骤进入胶体纳米瘤、移除中间柱子以及用于钝化和系绳的表面化学修改后，ZMW 阵列已准备好用于单分子成像。在制造后对ZMW光学特性的更广泛描述可以在附下的第³⁸条中找到。除了用于金属蒸汽沉积的热蒸发器外，不需要专门的工具。

Protocol

注：所有步骤都可以在一般实验室空间中完成。 1. 玻璃盖唇清洁 为了提供胶体颗粒蒸发沉积的清洁表面，将 24 x 30 mm 光学玻色硅酸盐玻璃盖片（0.16×0.19 毫米厚度）放置在 coplin 玻璃染色罐的凹槽插入件内进行清洁。注意：确保盖唇直立且分离良好，以便在清洁过程中所有表面都清晰暴露。 将足够的丙酮倒入染色罐中，以覆盖盖片、盖上盖子，并在 40 °C 下…

Representative Results

通过蒸发沉积（步骤 2.1+2.13）自组装聚苯乙烯胶体颗粒可以产生一系列结果，因为它需要控制溶剂蒸发率。但是，由于沉积速度很快（每轮 10-15 分钟），因此可以针对不同的环境实验室条件快速优化该过程。 图3A 显示沉积和蒸发后形成良好的胶体模板。从宏观上讲，珠子区域是圆形的，边界由不透明的多层珠环定义。图像中的半透明区域，但不是白色区域是所需的单层区?…

Discussion

对于胶体自组装（协议第2节），使用乙醇而不是水作为悬浮溶剂加速蒸发过程，使模板在沉积后2~3分钟准备好，而不是像以前的方法^48，49那样在^1~2小时。这里提出的蒸发沉降协议也比以前的沉降协议简单，需要控制悬浮^{层49、50、51}以上的表面倾斜^、温度和空气体积。本协议中使用?…

Materials

1. Glass Coverslip Cleaning
Acetone	Sigma	32201	1 L
Coplin glass staining jar	Fisher Scientific	08-817	Staining jar with 8 grooves and molded glass cover
Coverslips	VWR	48404-467	24 mm x 30 mm (No.1½, Rectangular)
Ethanol	Sigma	E7023	1 L
KOH	Sigma	30603	Potassium hydroxide
Petri dishes	Fisher Scientific	R80115TS	100 mm diameter, 15 mm deep
Sonicator	Branson	Z245143	Tabletop ultrasonic cleaner, 5510
2. Evaporative Deposition of Polystyrene Beads
Clear storage container	Fisher Scientific	50-110-8222	26 x 18 x 15 in.
Desk fan	O2Cool	FD05001A	Any small desk (~5 in.) fan will work
Glass beaker	Fisher Scientific	02-555-25B	250 mL
Humidity meter	Fisher Scientific	11-661-19
Microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	21-402-903	1.5 mL
Polystyrene microspheres	Polysciences	18602-15	1.00 µm diameter, non-functionalized
Triton X-100 deturgent	Sigma	X100	100 mL
3. Bead Annealing for Reducing Pore Size in the Colloidal Crystal Template
Aluminum plate	Fisher Scientific	AA11062RY	Customized in-house to 14 cm x 14 cm
Ceramic hotplate	Fisher Scientific	HP88857100	13 x 8.2 x 3.8 in.
Temperature controller	McMaster-Carr	38615K71	Read temperature with thermocouple probe
Thermocouple probe	McMaster-Carr	9251T93	Type K, surface probe
4/5. Nanofabrication of Zero Mode Waveguides Using the Colloidal Crystal Template
Aluminum etchant	Transene	Type A
Aluminum pellets	Kurt J. Lesker	EVMAL40QXHB	For electron beam evaporation
Chloroform	Sigma	288306	1 L
Copper etchant	Transene	49-1
Copper pellets	Kurt J. Lesker	EVMCU40QXQA	For electron beam evaporation
Gold pellets	Kurt J. Lesker	EVMAUXX40G	For electron beam evaporation
Lens paper	Thorlabs	MC-5
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G
Scotch tape	Staples	MMM119
Thin film deposition system	Kurt J. Lesker	PVD-75	Tabletop thermal evaporation system will also work
Titanium pellets	Kurt J. Lesker	EVMTI45QXQA	For electron beam evaporation
Toluene	Sigma	244511	1 L
Representative Results
COMSOL Multiphysics Modeling Software	COMSOL, Inc.
Dual View spectral splitter	Photometrics, Inc.