Fabbricazione di guide d'onda in modalità zero per microscopia ad alta concentrazione a singola molecola

Summary

Qui è descritto un metodo di litografia a nanosfera per la fabbricazione parallela di guide d’onda in modalità zero, che sono array di nanoperture in una microscopia in vetro rivestita di metallo coverlip per l’imaging di singole molecole a concentrazioni nano-micromolari di fluorofori. Il metodo sfrutta l’autoassemicolo del cristallo colloidale per creare un modello di guida d’onda.

Abstract

La fluorescenza a singola molecola, la fluorescenza di fondo da substrati etichettati in soluzione spesso limita la concentrazione di fluoroforo a intervalli pico- a nanomolari, diversi ordini di grandezza inferiori a molte concentrazioni fisiologiche di ligando. Le nanostrutture ottiche chiamate guide d’onda a modalità zero (ZWW), che hanno aperture di diametro di 100−200 nm fabbricate in un sottile metallo conduttore come l’alluminio o l’oro, consentono l’imaging di singole molecole a concentrazioni micromolari di fluorofori limitando l’eccitazione della luce visibile ai volumi efficaci dello zeptoliter. Tuttavia, la necessità di apparecchiature di nanofabbricazione costose e specializzate ha precluso l’uso diffuso di ZWW. Tipicamente, nanostrutture come gli ZMW sono ottenute scrivendo direttamente usando la litografia a fascio di elettroni, che è sequenziale e lenta. Qui, colloidale, o nanosfera, la litografia è usata come strategia alternativa per creare maschere su scala nanometrica per la fabbricazione di guide d’onda. La presente relazione descrive l’approccio in dettaglio, con considerazioni pratiche per ogni fase. Il metodo consente di creare migliaia di ZW in alluminio o oro in parallelo, con diametri e profondità finali della guida d’onda di 100−200 nm. Sono necessarie solo attrezzature da laboratorio comuni e un evaporatore termico per la deposizione di metalli. Rendendo gli ZMW più accessibili alla comunità biochimica, questo metodo può facilitare lo studio dei processi molecolari a concentrazioni e velocità cellulari.

Introduction

Tecniche a singola molecola come il trasferimento di energia di risonanza a fluorescenza a singola molecola (smFRET) o la spettroscopia di correlazione a fluorescenza a singola molecola (FCS) sono potenti strumenti per la biofisica molecolare, consentendo lo studio di movimenti dinamici, conformazioni e interazioni di singole biomolecole in processi come la trascrizione^1,2,3,traduzione^4,5,6e molti altri⁷. Per smFRET, la microscopia tirf (Total Internal Reflection Fluorescence) è un metodo comune perché molte molecole legate possono essere seguite nel tempo e l’onda evanescente generata dal TIR è limitata a una regione di 100−200 nm adiacente al coverslip⁸. Tuttavia, anche con questa limitazione del volume di eccitazione, i fluorofori di interesse devono ancora essere diluiti in intervalli di pM o nM al fine di rilevare segnali di singola molecola al di sopra della fluorecenza di fondo⁹. Poiché le costanti michaelis-menten degli enzimi cellulari sono tipicamente nell’intervallo da μM a mM¹⁰, le reazioni biochimiche negli studi su singole molecole sono di solito molto più lente di quelle nella cellula. Ad esempio, la sintesi proteica avviene a 15−20 aminoacidi al secondo in E. coli¹¹,^12,mentre la maggior parte dei ribosomi procariotici negli esperimenti smFRET si traducono in 0,1−1 aminoacido al secondo¹³. Nella sintesi proteica, le strutture cristalline e lo smFRET sui ribosomi in stallo hanno mostrato che gli RRNA di trasferimento (tRNA) oscillano tra stati “ibridi” e “classici” prima della traslocazione tRNA-mRNA^{fase 14,15}. Tuttavia, quando erano presenti concentrazioni fisiologiche del fattore GTPasi di traslocazione, EF-G, è stata osservata una conformazione diversa, intermedia tra gli stati ibridi e classici, in smFRET⁶. Studiare processi molecolari dinamici a tassi e concentrazioni simili a quelli della cellula è importante, ma rimane una sfida tecnica.

Una strategia per aumentare la concentrazione del substrato fluorescente è l’uso di aperture di lunghezza d’onda sub-visibile a base di metallo, chiamate guide d’onda in modalità zero (ZMW), per generare campi di eccitazione confinati che eccitano selettivamente le biomolecole localizzate all’interno delle aperture¹⁶ (Figura 1). Le aperture hanno in genere un diametro di 100−200 nm e una profondità di 100−150 nm¹⁷. Al di sopra di una lunghezza d’onda di taglio correlata alla dimensione e alla forma dei pozzi (λ_c ≈ 2,3 volte il diametro per le guide d’onda circolari con acqua come mezzo dielettrico¹⁸), non sono consentiti modi di propagazione nella guida d’onda, da cui il termine guide d’onda in modalità zero. Tuttavia, un campo elettromagnetico oscillante, direttamente un’onda evanescente, in decomposizione esponenziale in intensità tunnela ancora a breve distanza nella guida d’onda^18,19. Sebbene simili alle onde evanescenti TIR, le onde evanescenti ZMW hanno una costante di decadimento più breve, con conseguente regione di eccitazione effettiva di 10−30 nm all’interno della guida d’onda. A concentrazioni micromolari di ligandi etichettati fluorescentmente, solo una o poche molecole sono simultaneamente presenti all’interno della regione di eccitazione. Questa limitazione del volume di eccitazione e la conseguente riduzione della fluorescenza di fondo consentono l’imaging a fluorescenza di singole molecole a concentrazioni biologicamente rilevanti. Questo è stato applicato a molti sistemi^20,tra cui misurazioni FCS di diffusione di singole proteine^21,misurazioni FRET a singola molecola di interazioni ligando-proteina²² a bassa affinità e proteina-proteina^23,e misurazioni spettro-elettrochimiche di singoli eventi di turnover^{molecolare 24.}

Gli ZWW sono stati prodotti modellando direttamente uno strato metallico utilizzando la fresatura di^{fasci ionici 25,26} o litografia a fascio di elettroni (EBL) seguita dall’incisione al plasma^16,27. Questi metodi di litografia senza maschera creano guide d’onda in serie e in genere richiedono l’accesso a strutture specializzate di nanofabbricazione, impedendo l’adozione diffusa della tecnologia ZMW. Un altro metodo, il lift-off della litografia nanoimprint ultravioletta²⁸, utilizza uno stampo scorrevole al quarzo per premere un modello ZMW inverso su un film di resistenza come un timbro. Sebbene questo metodo sia più snello, richiede ancora EBL per la fabbricazione dello stampo al quarzo. Questo articolo presenta il protocollo per un metodo di fabbricazione basato su modelli semplice ed economico che non richiede la fresatura EBL o fasci di ioni e si basa sull’imballaggio ravvicinato di nanosfere per formare una maschera litografica.

La nanosfera o litografia “naturale”, proposta per la prima volta nel 1982 da Deckman e Dunsmuir^29,30, utilizza l’auto-assemblaggio di particelle colloidali monodisperse, che vanno da decine di nanometri a decine di micrometri^31,per creare modelli per la creazione di superfici attraverso l’incisione e/o la deposizione di materiali. Gli array periodici estesi bidimensionali (2D) o tridimensionali (3D) di particelle colloidali, denominati cristalli colloidali, sono caratterizzati da una luminosa iridescenza dallo scattering e dalla diffrazione³². Sebbene meno ampiamente utilizzata del fascio di elettroni o della fotolitografia, questa metodologia di mascheramento è semplice, a basso costo e facilmente ridimensionabile per creare dimensioni delle funzionalità inferiori a 100 nm.

Dirigere l’auto-assemblaggio delle particelle colloidali determina il successo dell’uso dei cristalli colloidali come maschere per la creazione di superfici. Se le dimensioni e la forma delle particelle sono omogenee, le particelle colloidali possono essere facilmente auto-assemblate con imballaggio esagonale, guidate dall’esaurimento^{entropico 33}. L’evaporazione dell’acqua dopo il rivestimento a goccia è un percorso efficace per sedimentare le particelle colloidali, anche se altri metodi includono il dip-coating^34,il rivestimento di spin^35,la deposizione elettroforetica³⁶e il consolidamento in un’interfaccia aria-acqua^37. Il protocollo presentato di seguito si basa sul metodo di sedimentazione dell’evaporazione, che è stato il più semplice da implementare. Gli interstizi triangolari tra perline di polistirene imballate a distanza ravvicinata formano aperture in cui placcare un metallo sacrificale, formando pali(Figura 2 e Figura supplementare 1). Breve ricottura delle perline prima che questo passaggio adatti la forma e il diametro di questi pali. Le perline vengono rimosse, uno strato metallico finale viene depositato intorno ai pali e quindi i pali vengono rimossi. Dopo che i due passaggi di deposizione metallica sulla nanomaschera colloidale, rimozione dei post intermedi e modifica della chimica delle superfici per la passivazione e il tethering, gli array ZMW sono pronti per l’uso per l’imaging a singola molecola. Una caratterizzazione più estesa delle proprietà ottiche ZMW dopo la fabbricazione può essere trovata in un articolo^{38 di accompagnamento.} Oltre a un evaporatore termico per la deposizione di vapore dei metalli, non sono necessari strumenti specializzati.

Protocol

NOTA: tutti i passaggi possono essere completati nello spazio generale del laboratorio. 1. Pulizia delle labbra con coperture in vetro Per fornire una superficie pulita per la deposizione evaporativa di particelle colloidali, posizionare 24 x 30 mm di rivestimenti in vetro borosilicato ottico (spessore 0,16−0,19 mm) all’interno degli inserti scanalati di un barattolo di colorazione in vetro coplin per la pulizia.NOTA: Assicurarsi che i copriparsi siano in posizione verticale e …

Representative Results

L’auto-assemblaggio delle particelle colloidali di polistirolo attraverso la sedimentazione evaporativa (fasi 2.1−2.13) può produrre una serie di risultati poiché richiede il controllo del tasso di evaporazione del solvente. Tuttavia, poiché le deposizioni sono veloci (10−15 minuti per round), la procedura può essere rapidamente ottimizzata per diverse condizioni di laboratorio ambientale. La figura 3A mostra un modello colloidale ben formato dopo la deposizione e l’evaporazione. Mac…

Discussion

Per l’auto-assemblaggio colloidale (sezione del protocollo 2), l’uso di etanolo piuttosto che di acqua come solvente di sospensione accelera il processo di evaporazione in modo che i modelli siano pronti in 2−3 minuti dopo la deposizione piuttosto che 1−2 h come nei metodi^{precedenti 48,49}. Il protocollo di sedimentazione evaporativa qui presentato è anche più semplice dei precedenti protocolli di sedimentazione che richiedono il controllo dell’inclinazione …

Materials

1. Glass Coverslip Cleaning
Acetone	Sigma	32201	1 L
Coplin glass staining jar	Fisher Scientific	08-817	Staining jar with 8 grooves and molded glass cover
Coverslips	VWR	48404-467	24 mm x 30 mm (No.1½, Rectangular)
Ethanol	Sigma	E7023	1 L
KOH	Sigma	30603	Potassium hydroxide
Petri dishes	Fisher Scientific	R80115TS	100 mm diameter, 15 mm deep
Sonicator	Branson	Z245143	Tabletop ultrasonic cleaner, 5510
2. Evaporative Deposition of Polystyrene Beads
Clear storage container	Fisher Scientific	50-110-8222	26 x 18 x 15 in.
Desk fan	O2Cool	FD05001A	Any small desk (~5 in.) fan will work
Glass beaker	Fisher Scientific	02-555-25B	250 mL
Humidity meter	Fisher Scientific	11-661-19
Microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	21-402-903	1.5 mL
Polystyrene microspheres	Polysciences	18602-15	1.00 µm diameter, non-functionalized
Triton X-100 deturgent	Sigma	X100	100 mL
3. Bead Annealing for Reducing Pore Size in the Colloidal Crystal Template
Aluminum plate	Fisher Scientific	AA11062RY	Customized in-house to 14 cm x 14 cm
Ceramic hotplate	Fisher Scientific	HP88857100	13 x 8.2 x 3.8 in.
Temperature controller	McMaster-Carr	38615K71	Read temperature with thermocouple probe
Thermocouple probe	McMaster-Carr	9251T93	Type K, surface probe
4/5. Nanofabrication of Zero Mode Waveguides Using the Colloidal Crystal Template
Aluminum etchant	Transene	Type A
Aluminum pellets	Kurt J. Lesker	EVMAL40QXHB	For electron beam evaporation
Chloroform	Sigma	288306	1 L
Copper etchant	Transene	49-1
Copper pellets	Kurt J. Lesker	EVMCU40QXQA	For electron beam evaporation
Gold pellets	Kurt J. Lesker	EVMAUXX40G	For electron beam evaporation
Lens paper	Thorlabs	MC-5
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G
Scotch tape	Staples	MMM119
Thin film deposition system	Kurt J. Lesker	PVD-75	Tabletop thermal evaporation system will also work
Titanium pellets	Kurt J. Lesker	EVMTI45QXQA	For electron beam evaporation
Toluene	Sigma	244511	1 L
Representative Results
COMSOL Multiphysics Modeling Software	COMSOL, Inc.
Dual View spectral splitter	Photometrics, Inc.