Изготовление волноводов нулевого режима для одномолекулярной микроскопии высокой концентрации

Summary

Здесь описан метод наносферной литографии для параллельного изготовления волноводов нулевого режима, которые представляют собой массивы наноапертур в покрытой металлом стеклянной микроскопии для визуализации одной молекулы при нано- и микромолярных концентрациях флуорофоров. Метод использует преимущества самосборки коллоидных кристаллов для создания шаблона волноводов.

Abstract

В одномолекулярной флуоресцентной энзимологии фоновая флуоресценция от меченых субстратов в растворе часто ограничивает концентрацию флуорофора пико- на наномолярными диапазонами, что на несколько порядков меньше, чем многие физиологические концентрации лигандов. Оптические наноструктуры, называемые волноводами нулевого режима (ZMW), которые представляют собой отверстия диаметром 100−200 нм, изготовленные из тонкого проводящего металла, такого как алюминий или золото, позволяют визуалировать отдельные молекулы при микромолярных концентрациях флуорофоров, ограничивая возбуждение видимого света эффективными объемами зептолита. Однако потребность в дорогостоящем и специализированном оборудовании для нанопроизводства исключила широкое использование ZMW. Как правило, наноструктуры, такие как ZMW, получают путем прямой записи с использованием электронно-лучевой литографии, которая является последовательной и медленной. Здесь коллоидная, или наносферная, литография используется в качестве альтернативной стратегии создания нанометровых масок для изготовления волноводов. В настоящем докладе подробно описывается этот подход с практическими соображениями для каждого этапа. Метод позволяет параллельно изготавливать тысячи алюминиевых или золотых ЗМВт с конечными диаметрами волноводов и глубиной 100−200 нм. Требуется только обычное лабораторное оборудование и термический испаритель для осаждения металла. Делая ZMW более доступными для биохимического сообщества, этот метод может облегчить изучение молекулярных процессов в клеточных концентрациях и скоростях.

Introduction

Одномолекулярные методы, такие как одномолекулярный флуоресцентный резонансный перенос энергии (smFRET) или одномолекулярная флуоресцентная корреляционная спектроскопия (FCS), являются мощными инструментами для молекулярной биофизики, позволяющими изучать динамические движения, конформации и взаимодействия отдельных биомолекул в таких процессах, как транскрипция^1,2,3,трансляция^4,5,6и многие другие^7. Для smFRET микроскопия полной флуоресценции внутреннего отражения (TIRF) является распространенным методом, поскольку многие привязанные молекулы могут наблюдаться с течением времени, а испаряющаяся волна, генерируемая TIR, ограничена областью 100-200 нм, прилегающей к покровному листу^8. Однако даже при таком ограничении объема возбуждения интересующий флуорофоры все равно необходимо разбавлять до диапазонов pM или nM, чтобы обнаружить сигналы одной молекулы выше фоновой флуоресценции^9. Поскольку константы Михаэлиса-Ментена клеточных ферментов обычно находятся в диапазоне от мкМ до^{мМ 10,}биохимические реакции в исследованиях одной молекулы обычно намного медленнее, чем в клетке. Например, синтез белка происходит со скоростью 15−20 аминокислот в секунду у E. coli^11,12,в то время как большинство прокариотических рибосом в экспериментах smFRET переводят на 0,1−1 аминокислоту в секунду^13. В синтезе белка кристаллические структуры и smFRET на застопорившихся рибосомах показали, что трансферные РНК (тРНК) колеблются между «гибридным» и «классическим» состояниями до этапа транслокации тРНК-мРНК^14,15. Однако при наличии физиологических концентраций транслокационного фактора ГТФазы, EF-G, в smFRET⁶наблюдалась иная конформация, промежуточная между гибридным и классическим состояниями. Изучение динамических молекулярных процессов со скоростью и концентрациями, аналогичными тем, которые происходят в клетке, важно, но остается технической проблемой.

Стратегия увеличения концентрации флуоресцентной подложки заключается в использовании субзримых апертур на основе металлов, называемых волноводами нулевого режима (ZMW), для создания ограниченных полей возбуждения, которые селективно возбуждают биомолекулы, локализованные в отверстиях¹⁶ (рисунок 1). Отверстия обычно имеют диаметр 100−200 нм и глубину 17 мм^100−150нм. Выше длины волны отсечки, связанной с размером и формой скважин (λ_c ≈ в 2,3 раза больше диаметра для круговых волноводов с водой в качестве диэлектрической среды^18),в волноводе не допускаются режимы распространения, отсюда и термин волноводы нулевого режима. Однако колеблющееся электромагнитное поле, названное испаряющейся волной, экспоненциально распадающейся по интенсивности, все еще туннелирует на небольшом расстоянии в волновод^18,19. Несмотря на сходство с испаряющимися волнами МДП, испаряющиеся волны ZMW имеют более короткую постоянную распада, что приводит к эффективной области возбуждения 10−30 нм в волноводе. При микромолярных концентрациях флуоресцентно меченых лигандов в области возбуждения одновременно присутствует только одна или несколько молекул. Это ограничение объема возбуждения и последующее уменьшение фоновой флуоресценции позволяет флуоресцентно визуализировать отдельные молекулы в биологически значимых концентрациях. Это было применено ко многим системам^20,включая измерения FCS диффузии одного белка^21,измерения одной молекулы FRET низкородных лиганд-белковых²² и белково-белковых взаимодействий²³и спектроэлектрохимические измерения событий одиночного молекулярного оборота^24.

ZMW были получены путем непосредственного рисунка металлического слоя с использованием ионно-лучевого фрезерования^25,26 или электронно-лучевой литографии (EBL) с последующим плазменным травлением^16,27. Эти методы бесмаскировочной литографии создают волноводы последовательно и, как правило, требуют доступа к специализированным установкам нанопроизводства, что препятствует широкому внедрению технологии ZMW. Другой метод, ультрафиолетовая наноимпринтная литография lift-off^28,использует кварцевую скользящую форму для прессования обратного шаблона ZMW на резистивную пленку, такую как штамп. Хотя этот метод более упрощен, он по-прежнему требует EBL для изготовления кварцевой формы. В данной статье представлен протокол для простого и недорогого шаблонного метода изготовления, который не требует EBL или ионно-лучевого фрезерования и основан на тесной упаковке наносфер для формирования литографической маски.

Наносферная или «естественная» литография, которая была впервые предложена в 1982 году Декманом и Дансмуиром^29,30,использует самосборку монодисперсных коллоидных частиц, начиная от десятков нанометров до десятков микрометров^31,для создания шаблонов для моделирования поверхности путем травления и / или осаждения материалов. Двумерные (2D) или трехмерные (3D) расширенные периодические массивы коллоидных частиц, называемые коллоидными кристаллами, характеризуются яркой радужной радужностью от рассеяния и дифракции^32. Хотя эта методология маскировки используется менее широко, чем электронно-лучевая или фотолитография, она проста, недорога и легко масштабируется для создания размеров объектов ниже 100 нм.

Направление самосборки коллоидных частиц определяет успех использования коллоидных кристаллов в качестве масок для поверхностного рисунка. Если размер и форма частиц однородны, коллоидные частицы могут быть легко собраны с помощью гексагональной упаковки, вызванной энтропийным истощением^33. Испарение воды после капельного покрытия является эффективным путем к осаждению коллоидных частиц, хотя другие способы включают погружное покрытие^34,спиновое покрытие^35,электрофоретическое осаждение³⁶и консолидацию на границе^{раздела 37}воздух-вода. Протокол, представленный ниже, основан на методе испарения седиментации, который был самым простым в реализации. Треугольные промежутки между плотно упакованными полистирольными шариками образуют отверстия, в которых можно облицовать жертвенный металл, формируя столбы(рисунок 2 и дополнительный рисунок 1). Краткий отжиг бусин перед этим этапом корректирует форму и диаметр этих стоек. Бусины удаляются, вокруг столбов наносится окончательный металлический слой, а затем столбы удаляются. После двух ступеней осаждения металла на коллоидную наномаску, удаления промежуточных столбов и модификации химического состава поверхности для пассивации и привязки массивы ZMW готовы к использованию для визуализации одной молекулы. Более обширную характеристику оптических свойств ZMW после изготовления можно найти в сопроводительной статье^38. Кроме термического испарителя для осаждения металлов из пара, никаких специализированных инструментов не требуется.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги могут быть выполнены в общем лабораторном пространстве. 1. Очистка стеклянных крышек Для обеспечения чистой поверхности для испарительного осаждения коллоидных частиц поместите 24 x 30 мм оптических боросиликатных стеклянных покровов (толщиной 0…

Representative Results

Самосборка коллоидных частиц полистирола путем испарительного осаждения (этапы 2.1−2.13) может дать ряд результатов, поскольку требует контроля скорости испарения растворителя. Однако, поскольку осаждение является быстрым (10−15 мин на раунд), процедура может быть быстро оптимизирована д…

Discussion

Для коллоидной самосборки (раздел протокола 2) использование этанола, а не воды в качестве суспензионного растворителя ускоряет процесс испарения таким образом, что шаблоны готовы через 2−3 мин после осаждения, а не через 1−2 ч, как в предыдущих способах^{48,49.</su…}

Materials

1. Glass Coverslip Cleaning
Acetone	Sigma	32201	1 L
Coplin glass staining jar	Fisher Scientific	08-817	Staining jar with 8 grooves and molded glass cover
Coverslips	VWR	48404-467	24 mm x 30 mm (No.1½, Rectangular)
Ethanol	Sigma	E7023	1 L
KOH	Sigma	30603	Potassium hydroxide
Petri dishes	Fisher Scientific	R80115TS	100 mm diameter, 15 mm deep
Sonicator	Branson	Z245143	Tabletop ultrasonic cleaner, 5510
2. Evaporative Deposition of Polystyrene Beads
Clear storage container	Fisher Scientific	50-110-8222	26 x 18 x 15 in.
Desk fan	O2Cool	FD05001A	Any small desk (~5 in.) fan will work
Glass beaker	Fisher Scientific	02-555-25B	250 mL
Humidity meter	Fisher Scientific	11-661-19
Microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	21-402-903	1.5 mL
Polystyrene microspheres	Polysciences	18602-15	1.00 µm diameter, non-functionalized
Triton X-100 deturgent	Sigma	X100	100 mL
3. Bead Annealing for Reducing Pore Size in the Colloidal Crystal Template
Aluminum plate	Fisher Scientific	AA11062RY	Customized in-house to 14 cm x 14 cm
Ceramic hotplate	Fisher Scientific	HP88857100	13 x 8.2 x 3.8 in.
Temperature controller	McMaster-Carr	38615K71	Read temperature with thermocouple probe
Thermocouple probe	McMaster-Carr	9251T93	Type K, surface probe
4/5. Nanofabrication of Zero Mode Waveguides Using the Colloidal Crystal Template
Aluminum etchant	Transene	Type A
Aluminum pellets	Kurt J. Lesker	EVMAL40QXHB	For electron beam evaporation
Chloroform	Sigma	288306	1 L
Copper etchant	Transene	49-1
Copper pellets	Kurt J. Lesker	EVMCU40QXQA	For electron beam evaporation
Gold pellets	Kurt J. Lesker	EVMAUXX40G	For electron beam evaporation
Lens paper	Thorlabs	MC-5
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G
Scotch tape	Staples	MMM119
Thin film deposition system	Kurt J. Lesker	PVD-75	Tabletop thermal evaporation system will also work
Titanium pellets	Kurt J. Lesker	EVMTI45QXQA	For electron beam evaporation
Toluene	Sigma	244511	1 L
Representative Results
COMSOL Multiphysics Modeling Software	COMSOL, Inc.
Dual View spectral splitter	Photometrics, Inc.