Summary

Идентификация и характеристика иммуногенных видов РНК в АЛЛЕРГЕНах HDM, которые модулируют воспаление эозинофилических легких

Published: May 30, 2020
doi:

Summary

Экологические аллергены, такие как клещи домашней пыли (HDM) часто содержат микробные вещества, которые активируют врожденные иммунные реакции для регулирования аллергического воспаления. Представленный здесь протокол демонстрирует идентификацию видов дстрНК в аллергенах HDM и характеристику их иммуногенной деятельности при модуляции эозинофильного воспаления легких.

Abstract

Экологические аллергены, такие как клещи домашней пыли (HDM) часто находятся в сложных формах, содержащих как аллергические белки, которые приводят аномальные реакции типа 2 и микробных веществ, которые вызывают врожденные иммунные реакции. Эти аллерген-ассоциированные микробные компоненты играют важную роль в регулировании развития типа 2 воспалительных заболеваний, таких как аллергическая астма. Однако основополагающие механизмы остаются в значительной степени неопределенными. Представленный здесь протокол определяет структурные характеристики и активность аллерген-ассоциированной иммуностимуляторной РНК. В частности, общие аллергены рассматриваются на наличие двухцепочечная РНК (dsRNA) видов, которые могут стимулировать ответы ИФН в легких и сдерживать развитие тяжелой эозинофилии легких в мышиной модели Индуцированной ХДС аллергической астмы. Здесь мы включили следующие три анализа: Dot пятно, чтобы показать структуры DSRNA в общей РНК, изолированные от аллергенов, включая вид HDM, RT-qPCR для измерения деятельности HDM РНК в интерферон стимулирующих генов (ISGs) выражение в легких мыши и анализ FACS для определения влияния HDM РНК на количество эозинофилов в BAL и легких, соответственно.

Introduction

Основываясь на гипотезе гигиены, первоначально предложенной Strachan1, раннее воздействие детей на экологические микробные факторы, такие как эндотоксин может защитить от развития аллергических расстройств2,3. Во время микробных инфекций, например, вирусных инфекций, врожденное иммунное обнаружение иностранных нуклеиновых кислот (РНК/ДНК) вызывает у хозяина защитные реакции4,,5,,6. Однако существование и распространенность иммуногенных нуклеиновых кислот, таких как длинные двуцепоченные РНК (dsRNA) видов в клещах домашней пыли (HDM) или других аллергенов насекомых остаются неизвестными. Этот протокол был разработан, чтобы определить, содержит ли HDM или аллергенов насекомых и неразвимов длинную дстрянк, которые могут активировать защитный иммунный ответ, чтобы противодействовать развитию тяжелого эозинофильного воспаления легких в мышиной модели аллергической астмы. Здесь мы предоставляем три простых и быстрых метода для оценки структурных детерминантов в общей РНК HDM, которые необходимы для регулирования аллергена индуцированного эозинофильного воспаления легких.

Слизистая иммунная система является крупнейшим иммунным органом в организме и служит первой линией защиты хозяина от микробных инфекций и аллергических оскорблений7,,8. Длинная dsRNA, репликация промежуточных многих вирусов, как известно, функционировать как патоген-ассоциированных молекулярной картины (PAMP), чтобы мощно стимулировать врожденные реакции через Toll как рецептор 3 (TLR3), чтобы вызвать выражение интерферона стимулировали гены (ISGs)9,10,11,12,13,14., Недавно мы показали, что HDM общей РНК содержит dsRNA структур, которые upregulated выражение ISGs и снижение тяжелой эозинофильных воспаление легких при введении через интракачельной привиливания в мурин модель аллергической астмы индуцированных HDM экстракты15. Тяжесть воспаления легких определяется путем анализа типов иммунных клеток в бронхоалвой лаваге (BAL) и легочной ткани через цитометрию потока16,,17,,18,19,20.

Этот протокол включает в себя три анализа: 1) быстрое обнаружение структур dsRNA с РНК точка пятно с помощью мыши моноклонального антитела J2, который специально связывается с dsRNA (40bp) в последовательности независимой манере; 2) быстрая оценка in vivo эффектов иммуностимуляторной РНК в легких мыши путем измерения индукции ISGs с помощью РТ-qPCR; 3) точная количественная количественная оценка эозинофилов в BAL и легких в контексте воспаления легких, вызванного HDM, с помощью анализа цитометрии потока.

Вышеупомянутые анализы могут быть использованы для изучения не только аллергических заболеваний легких, но и респираторных бактериальных и вирусных инфекций. Например, dsRNA специфические антитела J2 также могут быть использованы в других приложениях, таких как хроматография иммуноафизменности, иммуногистохимия, фермент-связанный иммуносорбент анализ (ELISA) и иммуносументирование21,22,23. Кроме того, несколько приложений вниз по течению сбора жидкости BAL могут быть использованы для количественной оценки растворимого содержимого, таких как цитокины и хемокины с использованием ELISA, и транскрипционное профилирование клеток в дыхательных путях (например, альвеолярные макрофаги). Хотя Есть целый ряд протоколов, доступных в литературе для оценки состояния легких, большинство из этих протоколов часто сосредоточены на целевой проверки. Описанные здесь процедуры могут быть применены для выявления компонентов экологических аллергенов, которые важны для регулирования развития аллергических заболеваний.

Protocol

Экспериментальные процедуры, описанные здесь, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию Техасского университета в Сан-Антонио. 1. Точка пятно, чтобы показать наличие структур dsRNA в HDM общей РНК Полная изоляция РНК от аллергенов,…

Representative Results

Присутствие длинных структур dsRNA в HDM, насекомых и не насекомых мелких животных было исследовано точка пятно с использованием DSRNA-специфических мыши моноклонального антитела J2 (40bp). RNase III был использован для переваривания dsRNA в 12-15 bp dsRNA фрагменты, которые были необнаружимы J2(р?…

Discussion

Текущий протокол описывает, как оценить иммуностимуляторные свойства аллерген-ассоциированной микробной РНК и их влияние на развитие эозинофильного воспаления легких в мышиной модели аллергической астмы. Хотя длинные dsRNAs известны как репликации промежуточных многих вирусов, которы…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим г-жу Карлу Горену за техническую помощь в цитометрии потока. L.S. поддерживается Китайским советом стипендий и Провинциальным инновационным фондом провинции Хунань для аспирантов (CX201713068). H.H.A. поддерживается кафедрой клинических лабораторных наук, Колледжем прикладных медицинских наук, Университетом Джуфа, Сакака, Саудовская Аравия. X.D.L. поддерживается UT здравоохранения Сан-Антонио школа медицины стартап-фонд и Макс и Минней Voelcker фонда.

Materials

0.40 µm Falcon Cell Strainer Thermo Fisher Scientific 08-771-1
1 mL syringes Henke Sass Wolf 5010.200V0
15 mL Tube TH.Geyer 7696702
50 mL Tube TH.Geyer 7696705
70% ethanol Decon Labs 2701
Absolute Counting Beads Life Technologies Europe B.V. C36950
ACK-RBC lysing buffer Lonza 10-548E
Amersham Hybond-N+ Membrane GE Healthcare RPN203B
Ant San Antonio Note: Locally collected
Antibody dilution buffer (see Table 5 for recipe)
Anti-Mouse CD11b V450 Rat (clone M1/70) BD Bioscience 560456 1 to 200 dilution
Anti-Mouse CD11c PE-Cy7 (clone N418) BioLegend 117317 1 to 200 dilution
Anti-Mouse CD19 Alexa Flour 647 (clone 1D3) eBioscience 15-0193-81 1 to 200 dilution
Anti-Mouse CD3e APC (clone 145-2C11) Invitrogen 15-0031-81 1 to 200 dilution
Anti-Mouse CD45 APC-Cy7 (clone: 30-F11) BioLegend 103130 1 to 200 dilution
Anti-Mouse Fixable Viabillity Dye eFluor 506 Invitrogen 65-0866-14 1 to 200 dilution
Anti-Mouse IgG (H+L), AP Conjugate Promega S3721
Anti-Mouse Ly-6G FITC (clone RB6-8C5) Invitrogen 11-5931-82 1 to 200 dilution
Anti-Mouse MHC II APC-eFluor 780 (clone M5/114.15.2) eBioscience 47-5321-80 1 to 200 dilution
Anti-Mouse Siglec-F PE (clone E50-2440) BD Pharmingen 552126 1 to 200 dilution
BCIP/NBT substrate Thermo Fisher Scientific PI34042
Blocking Buffer (see Table 5 for recipe)
Cannual, 20G X 1.5” CADENCE SCIENCE 9920
Centrifuge Thermo Fisher Scientific 75004030
CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System Bio-Rad Laboratories 1855485
Chloroform Thermo Fisher Scientific C298-500
Cockroach Greer Laboratories B26
Counting beads Thermo Fisher Scientific 01-1234-42
D. farinae Greer Laboratories B81
D. pteronyssinus Greer Laboratories B82
Denville Cell Culture Plates with lid, 96 well cell culture plate Thomas Scientific 1156F03
Digital Dry Bath – Four Blocks Universal Medical, Inc. BSH1004
Earthworm San Antonio Note: Locally collected
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E6511
FACS buffer (see recipe in Table 5)
Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes, 5 mL STEMCELLTM TECHNOLOGIES 38056
Flow cytometer (BD FACS Celesta) BD Biosciences
Fly Greer Laboratories B8
Forceps Roboz Surgical Instrument RS-5135
Hemocytometer Hausser Scientific 3110
HT-DNA Sigma D6898
In Vivo MAb anti-mouse CD16/CD32 (clone: 2.4G2) Bio X Cell BE0307
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad Laboratories 1708891
Isoflurane Abbott Labs sc-363629Rx
Isopropanol Thermo Fisher Scientific BP2618500
J2 anti-dsRNA monoclonal antibody SCICONS 10010200
Lung digestion solution (see recipe in Table 5)
Lysing Matrix D MP Biomedicals 116913050-CF
Lysing Matrix D, 2 mL tube MP Biomedicals SKU:116913100
Mice (female, 8-12 weeks old, C57BL/6J) Jackson Laboratory #000664
Microcentrifuge tube 1.5 mL Sigma-Aldrich 30120.094
Microscope Olympus CK30
Mini-BeadBeater Homogenizers SKU:BS:607
Mini-Beadbeater-16 Biospec 607
Mosquito Greer Laboratories B55
NanoDrop 2000C Thermo Scientific Spectophotometer Medex Supply TSCND2000C
Needle, 21 G x 1 1/2 in BD Biosciences 305167
Non-fat milk Bio-Rad Laboratories 1706404
Nylon string Dynarex 3243
Phosphate-buffered Saline (PBS) Lonza BE17-516F
RNase III Thermo Fisher Scientific AM2290
RNase T1 Thermo Fisher Scientific AM2283
Scissors Roboz Surgical Instrument RS-6802
Shaker or Small laboratory mixer Boekel Scientific 201100
SPHERO AccuCount Fluorescent Spherotech ACFP-70-5 1 to 10 dilution
Spider San Antonio Note: Locally collected
TBS (see recipe in Table 5)
TBS-T (see recipe in Table 5)
Total cell medium (see recipe in Table 5)
TRIzol Reagent Thermo Fisher Scientific 15596018
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416
UV Stratalinker 2400 UV LabX 20447
Wasp San Antonio Note: Locally collected

References

  1. Strachan, D. P. Hay fever, hygiene, and household size. BMJ. 299, 1259-1260 (1989).
  2. Schuijs, M. J., et al. Farm dust and endotoxin protect against allergy through A20 induction in lung epithelial cells. Science. 349, 1106-1110 (2015).
  3. Stein, M. M., et al. Innate Immunity and Asthma Risk in Amish and Hutterite Farm Children. New England Journal of Medicine. 375, 411-421 (2016).
  4. Roers, A., Hiller, B., Hornung, V. Recognition of Endogenous Nucleic Acids by the Innate Immune System. Immunity. 44, 739-754 (2016).
  5. Schlee, M., Hartmann, G. Discriminating self from non-self in nucleic acid sensing. Nature Reviews Immunology. 16, 566-580 (2016).
  6. Wu, J., Chen, Z. J. Innate immune sensing and signaling of cytosolic nucleic acids. Annual Reviews Immunology. 32, 461-488 (2014).
  7. O’Hara, A. M., Shanahan, F. The gut flora as a forgotten organ. EMBO Reports. 7 (7), 688-693 (2006).
  8. . Focused Meeting 2018: Microbes and Mucosal Surfaces Available from: https://microbiologysociety.org/event/society-events-and-meetings/focused-meeting-2018-microbes-and-mucosal-surfaces.html (2018)
  9. Weber, F., et al. Double-stranded RNA is produced by positive-strand RNA viruses and DNA viruses but not in detectable amounts by negative-strand RNA viruses. Journal of Virology. 80, 5059-5064 (2006).
  10. Barral, P. M., et al. Functions of the cytoplasmic RNA sensors RIG-I and MDA-5: Key regulators of innate immunity. Pharmacology and Therapeutics. 124, 219-234 (2009).
  11. Netea, M. G., et al. From the Th1/Th2 paradigm towards a Toll-like receptor/T-helper bias. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49, 3991-3996 (2005).
  12. McNally, B., et al. Intranasal administration of dsRNA analog poly(I:C) induces interferon-alpha receptor-dependent accumulation of antigen experienced T cells in the airways. PLoS One. 7, 51351 (2012).
  13. Seya, T., Takeda, Y., Matsumoto, M. Tumor vaccines with dsRNA adjuvant ARNAX induces antigen-specific tumor shrinkage without cytokinemia. Oncoimmunology. 5, 1043506 (2016).
  14. Toussi, D. N., Massari, P. Immune Adjuvant Effect of molecularly defined Toll-Like Receptor Ligands. Vaccines (Basel). 2, 323-353 (2014).
  15. She, L., et al. Immune Sensing of Aeroallergen-Associated Double-Stranded RNA Triggers an IFN Response and Modulates Type 2 Lung Inflammation. Journal of Immunology. 203, 2520-2531 (2019).
  16. Fujimoto, Y., et al. Pulmonary inflammation and cytokine dynamics of bronchoalveolar lavage fluid from a mouse model of bronchial asthma during A(H1N1)pdm09 influenza infection. Science Reports. 7, 9128 (2017).
  17. Yao, Y., et al. Induction of Autonomous Memory Alveolar Macrophages Requires T Cell Help and Is Critical to Trained Immunity. Cell. 175, 1634-1650 (2018).
  18. Dua, K., Shukla, S. D., Hansbro, P. M. Aspiration techniques for bronchoalveolar lavage in translational respiratory research: Paving the way to develop novel therapeutic moieties. Journal of Biological Methods. 4, 73 (2017).
  19. Van Hoecke, L., et al. Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration. Journal of Visualized Experiments. (123), e55398 (2017).
  20. Salahuddin, S., et al. Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment. Journal of Visualized Experiments. (148), e59427 (2019).
  21. Son, K. N., Liang, Z., Lipton, H. L. Double-Stranded RNA Is Detected by Immunofluorescence Analysis in RNA and DNA Virus Infections, Including Those by Negative-Stranded RNA Viruses. Journal of Virology. 89, 9383-9392 (2015).
  22. Monsion, B., et al. Efficient Detection of Long dsRNA in Vitro and in Vivo Using the dsRNA Binding Domain from FHV B2 Protein. Front Plant Sci. 9, 70 (2018).
  23. Redente, E. F., et al. Age and sex dimorphisms contribute to the severity of bleomycin-induced lung injury and fibrosis. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 301, 510-518 (2011).
  24. Card, J. W., et al. Gender differences in murine airway responsiveness and lipopolysaccharide-induced inflammation. Journal of Immunology. 177, 621-630 (2006).
  25. Gueders, M. M., et al. Mouse models of asthma: a comparison between C57BL/6 and BALB/c strains regarding bronchial responsiveness, inflammation, and cytokine production. Inflammation Research. 58, 845-854 (2009).

Play Video

Cite This Article
Alanazi, H. H., She, L., Li, X. Identification and Characterization of Immunogenic RNA Species in HDM Allergens that Modulate Eosinophilic Lung Inflammation. J. Vis. Exp. (159), e61183, doi:10.3791/61183 (2020).

View Video