Identificazione e caratterizzazione delle specie di RNA immunogenico negli allergeni HDM che modulano l'infiammazione polmonare eosinofila
Summary
Gli allergeni ambientali come gli acari della polvere domestica (HDM) spesso contengono sostanze microbiche che attivano risposte immunitarie innate per regolare l’infiammazione allergica. Il protocollo qui presentato dimostra l’identificazione delle specie di dsRNA negli allergeni HDM e la caratterizzazione delle loro attività immunogeniche nella modulazione dell’infiammazione polmonare eosinofila.
Abstract
Gli allergeni ambientali come gli acari della polvere domestica (HDM) sono spesso in forme complesse contenenti sia proteine allergiche che guidano risposte aberranti di tipo 2 che sostanze microbiche che inducono risposte immunitarie innate. Questi componenti microbici associati agli allergeni svolgono un ruolo importante nella regolazione dello sviluppo di condizioni infiammatorie di tipo 2 come l’asma allergica. Tuttavia, i meccanismi sottostanti rimangono in gran parte indefiniti. Il protocollo qui presentato determina le caratteristiche strutturali e l’attività in vivo dell’RNA immunostimulatory associato agli allergeni. In particolare, vengono esaminati gli allergeni comuni per la presenza di specie di RNA a doppio filamento (dsRNA) che possono stimolare le risposte IFN nei polmoni e frenare lo sviluppo di eosinofilia polmonare grave in un modello murino di asma allergica indotta dall’HDM. Qui, abbiamo incluso i seguenti tre saggi: Dot blot per mostrare le strutture di dsRNA in RNA totale isolate dagli allergeni tra cui le specie MH, RT-qPCR per misurare le attività dell’RNA HDM nei geni che stimolano l’interferone (ISG) espressione nei polmoni dei topi e nell’analisi FACS per determinare gli effetti dell’RNA HDM sul numero di eosinofili in BAL e nei polmoni, rispettivamente.
Introduction
Sulla base dell’ipotesi igienica originariamente proposta da Strachan1, l’esposizione della prima infanzia a fattori microbici ambientali come l’endotossina può proteggere contro lo sviluppo di disturbi allergici2,3. Durante le infezioni microbiche, ad esempio le infezioni virali, il rilevamento immunitario innato degli acidi nucleici estranei (RNA/DNA) innesca risposte alla difesa dell’ospite4,5,6. Tuttavia, l’esistenza e la prevalenza di acidi nucleici immunogenici come le specie di RNA a doppio filamento (dsRNA) lunghe in acari della polvere domestica (HDM) o altri allergeni da insetti rimangono sconosciuti. Questo protocollo è stato progettato per determinare se gli allergeni HDM o insetti e non insetti contengono specie di dsRNA lungo che possono attivare una risposta immunitaria protettiva per contrastare lo sviluppo di una grave infiammazione polmonare eosinofila in un modello murino di asma allergica. Qui, forniamo tre metodi semplici e veloci per valutare i determinanti strutturali nell’RNA totale HDM che sono necessari per regolare l’infiammazione del polmone eosinofilo indotta da allergeni.
Il sistema immunitario mucosale è il più grande organo immunitario del corpo e serve come prima linea di difesa dell’ospite contro sia le infezioni microbiche che gli insulti allergici7,8. Il lungo dsRNA, il intermedio di replicazione di molti virus, è noto per funzionare come un modello molecolare patogeno-associato (PAMP) per stimolare potentemente le risposte innate tramite Toll come il recettore 3 (TLR3) per indurre l’espressione di geni stimolati interferone (ISG)9,10,11,12,13,14.11 Recentemente abbiamo dimostrato che l’RNA totale dell’HDM conteneva strutture di dsRNA, che hanno aumentato l’espressione degli ISG e ridotto grave infiammazione polmonare eosinofila quando somministrato tramite l’instillazione intratratracheale in un modello murino di asma allergica indotta dagli estratti HDM15. La gravità delle infiammazioni polmonari è determinata analizzando i tipi di cellule immunitarie nello slavao bronchoalveolar (BAL) e nel tessuto polmonare attraverso la citometria di flusso16,17,18,19,20.
Questo protocollo include tre saggi: 1) rilevamento rapido delle strutture di dsRNA con macchia di punto di RNA utilizzando un anticorpo monoclonale del topo J2 che si lega specificamente al dsRNA (40bp) in modo indipendente dalla sequenza; 2) valutazione rapida degli effetti in vivo dell’RNA immunostimulatoroy nei polmoni murini misurando l’induzione di ISG utilizzando RT-qPCR; 3) quantificazione accurata degli eosinofili in BAL e nel polmone nel contesto dell’infiammazione polmonare indotta dall’HDM mediante l’analisi della citometria del flusso.
I saggi di cui sopra possono essere utilizzati per studiare non solo le malattie polmonari allergiche, ma anche le infezioni batteriche e virali respiratorie. Ad esempio, l’anticorpo J2 specifico del dsRNA può essere utilizzato anche in altre applicazioni come la cromatografia dell’immunoaffinità, l’immunostochimica, il saggio immunosorbente legato agli enzimi (ELISA) e l’immunostaining21,22,23. Inoltre, diverse applicazioni a valle della raccolta di fluidi BAL possono essere utilizzate per quantificare contenuti solubili come citochine e chemiochine utilizzando ELISA e profilazione trascrizionale delle cellule nelle vie respiratorie (ad esempio, macrofagi alveolar). Anche se ci sono una varietà di protocolli disponibili in letteratura per valutare le condizioni polmonari, la maggior parte di questi protocolli spesso si concentrano sulla convalida del bersaglio. Le procedure qui descritte possono essere applicate per identificare i componenti negli allergeni ambientali che sono importanti per regolare lo sviluppo di malattie allergiche.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo attuale descrive come valutare le proprietà immunostimulatoriche dell’RNA microbico associato agli allergeni e il loro impatto sullo sviluppo dell’infiammazione polmonare eosinofila in un modello murino di asma allergica. Anche se lunghi dsRNA sono noti come gli intermedi di replicazione di molti virus che possono potentemente attivare le risposte di interferone nelle cellule dei mammiferi, le loro presenze negli allergeni HDM sono state sconosciute fino al nostro recente lavoro15. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo la signora Karla Gorena per l’assistenza tecnica nella citometria di flusso. L.S. è sostenuta dal China Scholarship Council e dalla Hunan Provincial Innovation Foundation for Postgraduate (CX201713068). H.H.A. è supportato dal Department of Clinical Laboratory Sciences, College of Applied Medical Sciences, Jouf University, Sakaka, Arabia Saudita. X.D.L. è supportato dal FONDO UT Health San Antonio School of Medicine Startup Fund e dal Max and Minnei Voelcker Fund.
Materials
| 0.40 µm Falcon Cell Strainer | Thermo Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| 1 mL syringes | Henke Sass Wolf | 5010.200V0 | |
| 15 mL Tube | TH.Geyer | 7696702 | |
| 50 mL Tube | TH.Geyer | 7696705 | |
| 70% ethanol | Decon Labs | 2701 | |
| Absolute Counting Beads | Life Technologies Europe B.V. | C36950 | |
| ACK-RBC lysing buffer | Lonza | 10-548E | |
| Amersham Hybond-N+ Membrane | GE Healthcare | RPN203B | |
| Ant | San Antonio | Note: Locally collected | |
| Antibody dilution buffer | (see Table 5 for recipe) | ||
| Anti-Mouse CD11b V450 Rat (clone M1/70) | BD Bioscience | 560456 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD11c PE-Cy7 (clone N418) | BioLegend | 117317 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD19 Alexa Flour 647 (clone 1D3) | eBioscience | 15-0193-81 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD3e APC (clone 145-2C11) | Invitrogen | 15-0031-81 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD45 APC-Cy7 (clone: 30-F11) | BioLegend | 103130 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse Fixable Viabillity Dye eFluor 506 | Invitrogen | 65-0866-14 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse IgG (H+L), AP Conjugate | Promega | S3721 | |
| Anti-Mouse Ly-6G FITC (clone RB6-8C5) | Invitrogen | 11-5931-82 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse MHC II APC-eFluor 780 (clone M5/114.15.2) | eBioscience | 47-5321-80 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse Siglec-F PE (clone E50-2440) | BD Pharmingen | 552126 | 1 to 200 dilution |
| BCIP/NBT substrate | Thermo Fisher Scientific | PI34042 | |
| Blocking Buffer | (see Table 5 for recipe) | ||
| Cannual, 20G X 1.5” | CADENCE SCIENCE | 9920 | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004030 | |
| CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad Laboratories | 1855485 | |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | C298-500 | |
| Cockroach | Greer Laboratories | B26 | |
| Counting beads | Thermo Fisher Scientific | 01-1234-42 | |
| D. farinae | Greer Laboratories | B81 | |
| D. pteronyssinus | Greer Laboratories | B82 | |
| Denville Cell Culture Plates with lid, 96 well cell culture plate | Thomas Scientific | 1156F03 | |
| Digital Dry Bath – Four Blocks | Universal Medical, Inc. | BSH1004 | |
| Earthworm | San Antonio | Note: Locally collected | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6511 | |
| FACS buffer | (see recipe in Table 5) | ||
| Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes, 5 mL | STEMCELLTM TECHNOLOGIES | 38056 | |
| Flow cytometer (BD FACS Celesta) | BD Biosciences | ||
| Fly | Greer Laboratories | B8 | |
| Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5135 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3110 | |
| HT-DNA | Sigma | D6898 | |
| In Vivo MAb anti-mouse CD16/CD32 (clone: 2.4G2) | Bio X Cell | BE0307 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad Laboratories | 1708891 | |
| Isoflurane | Abbott Labs | sc-363629Rx | |
| Isopropanol | Thermo Fisher Scientific | BP2618500 | |
| J2 anti-dsRNA monoclonal antibody | SCICONS | 10010200 | |
| Lung digestion solution | (see recipe in Table 5) | ||
| Lysing Matrix D | MP Biomedicals | 116913050-CF | |
| Lysing Matrix D, 2 mL tube | MP Biomedicals | SKU:116913100 | |
| Mice (female, 8-12 weeks old, C57BL/6J) | Jackson Laboratory | #000664 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | Sigma-Aldrich | 30120.094 | |
| Microscope | Olympus | CK30 | |
| Mini-BeadBeater | Homogenizers | SKU:BS:607 | |
| Mini-Beadbeater-16 | Biospec | 607 | |
| Mosquito | Greer Laboratories | B55 | |
| NanoDrop 2000C | Thermo Scientific Spectophotometer Medex Supply | TSCND2000C | |
| Needle, 21 G x 1 1/2 in | BD Biosciences | 305167 | |
| Non-fat milk | Bio-Rad Laboratories | 1706404 | |
| Nylon string | Dynarex | 3243 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Lonza | BE17-516F | |
| RNase III | Thermo Fisher Scientific | AM2290 | |
| RNase T1 | Thermo Fisher Scientific | AM2283 | |
| Scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-6802 | |
| Shaker or Small laboratory mixer | Boekel Scientific | 201100 | |
| SPHERO AccuCount Fluorescent | Spherotech | ACFP-70-5 | 1 to 10 dilution |
| Spider | San Antonio | Note: Locally collected | |
| TBS | (see recipe in Table 5) | ||
| TBS-T | (see recipe in Table 5) | ||
| Total cell medium | (see recipe in Table 5) | ||
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| UV Stratalinker 2400 UV | LabX | 20447 | |
| Wasp | San Antonio | Note: Locally collected |
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