Summary

تحديد وتوصيف أنواع الحمض المناعي للرنا في مسببات الحساسية HDM التي تعدل التهاب الرئة اليوزيوزي

Published: May 30, 2020
doi:

Summary

غالبًا ما تحتوي المواد المسببة للحساسية البيئية مثل عث الغبار في المنزل (HDM) على مواد ميكروبية تنشط الاستجابات المناعية الفطرية لتنظيم التهاب الحساسية. البروتوكول المقدم هنا يوضح تحديد أنواع dsRNA في المواد المسببة للحساسية HDM وتوصيف أنشطتها المناعية في تعديل التهاب الرئة اليوزيني.

Abstract

مسببات الحساسية البيئية مثل عث الغبار المنزل (HDM) وغالبا ما تكون في أشكال معقدة تحتوي على كل من البروتينات الحساسية التي تدفع ردود من النوع 2 الشاذة والمواد الميكروبية التي تحفز الاستجابات المناعية الفطرية. تلعب هذه المكونات الميكروبية المرتبطة بالحساسية دورًا مهمًا في تنظيم تطور الحالات الالتهابية من النوع 2 مثل الربو التحسسي. غير أن الآليات الأساسية لا تزال غير محددة إلى حد كبير. البروتوكول المعروض هنا يحدد الخصائص الهيكلية ونشاط في الجسم الحي من الحمض النووي الريبي المسبب للحساسية المرتبطة بالمناعة. على وجه التحديد، يتم فحص المواد المسببة للحساسية المشتركة لوجود دنا مزدوجة التي تقطعت بها السبل (dsRNA) الأنواع التي يمكن أن تحفز ردود IFN في الرئتين وكبح جماح تطور يهون الرئة الحادة في نموذج الماوس من الربو التحسسي الناجم عن HDM. هنا، قمنا بتضمين ثلاثة فحوصات التالية: نقطة لطخة لإظهار هياكل DSRNA في مجموع الحمض النووي الريبي معزولة من مسببات الحساسية بما في ذلك أنواع HDM، RT-qPCR لقياس أنشطة HDM RNA في الجينات محفزة إنترفيرون (ISGs) التعبير في الرئتين الماوس وتحليل القوات المسلحة الكونغولية لتحديد آثار الحمض النووي HDM على عدد من الحمض النووي في BAL والرئة، على التوالي.

Introduction

استنادا إلى فرضية النظافة المقترحة أصلا من قبل ستراكان1, في مرحلة مبكرة من الطفولة التعرض للعوامل الميكروبية البيئية مثل الانستوكين يمكن أن تحمي ضد تطور الاضطرابات التحسسية2,3. أثناء الالتهابات الميكروبية، على سبيل المثال، العدوى الفيروسية، والكشف المناعي الفطري للأحماض النووية الأجنبية (RNA/DNA) يؤدي إلى استجابات الدفاع المضيف4،5،6. ومع ذلك ، فإن وجود وانتشار الأحماض النووية المناعية مثل أنواع الحمض النووي الريبي (DSRNA) الطويلة التي تقطعت بها السبل في عث الغبار المنزلية (HDM) أو مسببات الحساسية الأخرى للحشرات لا تزال غير معروفة. تم تصميم هذا البروتوكول لتحديد ما إذا كان HDM أو مسببات الحساسية الحشرية وغير الحشرية تحتوي على أنواع طويلة من dsRNA التي يمكن أن تنشط استجابة مناعية وقائية لمواجهة تطور التهاب الرئة اليوسينوفيلي الحاد في نموذج فأر للربو التحسسي. هنا، ونحن نقدم ثلاث طرق بسيطة وسريعة لتقييم المحددات الهيكلية في رنا هد إم مجموع التي هي مطلوبة لتنظيم التهاب الرئة النيوزنوفيلي الناجم عن مسببات الحساسية.

الجهاز المناعي المخاطي هو أكبر جهاز مناعي في الجسم ويعمل كخط أول للدفاع المضيف ضد كل من الالتهابات الميكروبية والشتائم التحسسية7,8. وdsRNA طويلة، ووسيط تكرار العديد من الفيروسات، ومن المعروف أن تعمل كنمط الجزيئية المرتبطة بعوامل الأمراض (PAMP) لتحفيز الاستجابات الفطرية بقوة عبر حصيلة مثل مستقبلات 3 (TLR3) للحث على التعبير عن الجينات محفزة إنترفيرون (ISGs)9،10،11،12،13،14. لقد أظهرنا مؤخرا أن RNA هد ام الكلي يحتوي على هياكل dsRNA، والتي upregulated التعبير عن ISGs والحد من التهاب الرئة يهونوسوسي شديد عندما تدار عن طريق تقطير داخلtracheal في نموذج مورين من الربو التحسسي الناجمة عن مقتطفات HDM15. يتم تحديد شدة التهابات الرئة عن طريق تحليل أنواع الخلايا المناعية في bronchoalveolar lavage (BAL) والأنسجة الرئوية عن طريق تدفق16،17،18،19،20.

ويتضمن هذا البروتوكول ثلاثة مقايسات: 1) الكشف السريع عن هياكل DSRNA مع لطخة نقطة RNA باستخدام جسم مضاد أحادي النسيلة الماوس J2 الذي يربط على وجه التحديد إلى dsRNA (≥40bp) بطريقة مستقلة عن تسلسل؛ 2) تقييم سريع لمؤثرات vivo من الحمض المناعي الريبي في الرئتين الماوس عن طريق قياس تحريض ISGs باستخدام RT-qPCR؛ 3) القياس الكمي الدقيق للويوزنوفيليات في BAL والرئة في سياق التهاب الرئة الناجم عن HDM باستخدام تحليل تدفق قياس الخلايا.

يمكن استخدام التشايسات أعلاه لدراسة ليس فقط أمراض الرئة التحسسية ، ولكن أيضًا الالتهابات البكتيرية والفيروسية التنفسية. على سبيل المثال، يمكن أيضا أن تستخدم الأجسام المضادة J2 DSRNA محددة في تطبيقات أخرى مثل الكروماتوغرافيا المناعية، وhistochemistry المناعية، والمناعة المرتبطة الانزيم المقايسة (ELISA) والمناعة21،22،23. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام العديد من التطبيقات المصب من جمع السوائل BAL لتحديد كمي المحتويات القابلة للذوبان مثل السيتوكينات و chemokines باستخدام ELISA، والتنسخ التنميط للخلايا في الشعب الهوائية (على سبيل المثال، الضامة السنخية). على الرغم من وجود مجموعة متنوعة من البروتوكولات المتاحة في المؤلفات لتقييم حالات الرئة، فإن معظم هذه البروتوكولات غالباً ما تركز على التحقق من الصحة المستهدفة. يمكن تطبيق الإجراءات الموضحة هنا لتحديد المكونات في المواد المسببة للحساسية البيئية المهمة لتنظيم تطور أمراض الحساسية.

Protocol

تمت الموافقة على الإجراءات التجريبية الموصوفة هنا من قبل لجنة الرعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية في جامعة تكساس للصحة سان أنطونيو. 1. نقطة لطخة لإظهار وجود هياكل DSRNA في الجيش الملكي النيبالي هد أم مجموع عزل الحمض النووي الريبي الكلي عن مسببات الحساسية والحشرات وغير ا…

Representative Results

تم فحص وجود هياكل طويلة من DSRNA في HDM والحشرات والحيوانات الصغيرة غير الحشرية بواسطة لطخة نقطة باستخدام جسم مضاد أحادي النسيلة للماوس خاص بـ dsRNA J2 (≥ 40bp). وقد استخدم RNase الثالث لهضم dsRNA في 12-15 شظايا BP dsRNA، والتي كانت غير قابلة للكشف من قبل J2(الشكل 1). تم تحليل قدرة RNA…

Discussion

يصف البروتوكول الحالي كيفية تقييم خصائص التحفيز المناعي للحمض النووي الميكروبي المرتبط بالحساسية وتأثيراتها على تطور التهاب الرئة اليوزيني في نموذج الماوس للربو التحسسي. على الرغم من أن dsRNAs طويلة معروفة وسيطة النسخ المتماثل من العديد من الفيروسات التي يمكن أن تنشط بقوة استجابات الإنتر?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ونشكر السيدة كارلا غورينا على المساعدة التقنية في عملية استئصال الانسياب. يدعم L.S. مجلس المنح الدراسية الصيني ومؤسسة الابتكار في مقاطعة هونان للدراسات العليا (CX201713068). ويدعم سموه قسم علوم المختبرات السريرية، كلية العلوم الطبية التطبيقية، جامعة الجوف، ساكاكا، المملكة العربية السعودية. ويدعم X.D.L. من قبل UT الصحة سان انطونيو الصحة كلية الطب بدء تشغيل صندوق وماكس وميني فويلكر الصندوق.

Materials

0.40 µm Falcon Cell Strainer Thermo Fisher Scientific 08-771-1
1 mL syringes Henke Sass Wolf 5010.200V0
15 mL Tube TH.Geyer 7696702
50 mL Tube TH.Geyer 7696705
70% ethanol Decon Labs 2701
Absolute Counting Beads Life Technologies Europe B.V. C36950
ACK-RBC lysing buffer Lonza 10-548E
Amersham Hybond-N+ Membrane GE Healthcare RPN203B
Ant San Antonio Note: Locally collected
Antibody dilution buffer (see Table 5 for recipe)
Anti-Mouse CD11b V450 Rat (clone M1/70) BD Bioscience 560456 1 to 200 dilution
Anti-Mouse CD11c PE-Cy7 (clone N418) BioLegend 117317 1 to 200 dilution
Anti-Mouse CD19 Alexa Flour 647 (clone 1D3) eBioscience 15-0193-81 1 to 200 dilution
Anti-Mouse CD3e APC (clone 145-2C11) Invitrogen 15-0031-81 1 to 200 dilution
Anti-Mouse CD45 APC-Cy7 (clone: 30-F11) BioLegend 103130 1 to 200 dilution
Anti-Mouse Fixable Viabillity Dye eFluor 506 Invitrogen 65-0866-14 1 to 200 dilution
Anti-Mouse IgG (H+L), AP Conjugate Promega S3721
Anti-Mouse Ly-6G FITC (clone RB6-8C5) Invitrogen 11-5931-82 1 to 200 dilution
Anti-Mouse MHC II APC-eFluor 780 (clone M5/114.15.2) eBioscience 47-5321-80 1 to 200 dilution
Anti-Mouse Siglec-F PE (clone E50-2440) BD Pharmingen 552126 1 to 200 dilution
BCIP/NBT substrate Thermo Fisher Scientific PI34042
Blocking Buffer (see Table 5 for recipe)
Cannual, 20G X 1.5” CADENCE SCIENCE 9920
Centrifuge Thermo Fisher Scientific 75004030
CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System Bio-Rad Laboratories 1855485
Chloroform Thermo Fisher Scientific C298-500
Cockroach Greer Laboratories B26
Counting beads Thermo Fisher Scientific 01-1234-42
D. farinae Greer Laboratories B81
D. pteronyssinus Greer Laboratories B82
Denville Cell Culture Plates with lid, 96 well cell culture plate Thomas Scientific 1156F03
Digital Dry Bath – Four Blocks Universal Medical, Inc. BSH1004
Earthworm San Antonio Note: Locally collected
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E6511
FACS buffer (see recipe in Table 5)
Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes, 5 mL STEMCELLTM TECHNOLOGIES 38056
Flow cytometer (BD FACS Celesta) BD Biosciences
Fly Greer Laboratories B8
Forceps Roboz Surgical Instrument RS-5135
Hemocytometer Hausser Scientific 3110
HT-DNA Sigma D6898
In Vivo MAb anti-mouse CD16/CD32 (clone: 2.4G2) Bio X Cell BE0307
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad Laboratories 1708891
Isoflurane Abbott Labs sc-363629Rx
Isopropanol Thermo Fisher Scientific BP2618500
J2 anti-dsRNA monoclonal antibody SCICONS 10010200
Lung digestion solution (see recipe in Table 5)
Lysing Matrix D MP Biomedicals 116913050-CF
Lysing Matrix D, 2 mL tube MP Biomedicals SKU:116913100
Mice (female, 8-12 weeks old, C57BL/6J) Jackson Laboratory #000664
Microcentrifuge tube 1.5 mL Sigma-Aldrich 30120.094
Microscope Olympus CK30
Mini-BeadBeater Homogenizers SKU:BS:607
Mini-Beadbeater-16 Biospec 607
Mosquito Greer Laboratories B55
NanoDrop 2000C Thermo Scientific Spectophotometer Medex Supply TSCND2000C
Needle, 21 G x 1 1/2 in BD Biosciences 305167
Non-fat milk Bio-Rad Laboratories 1706404
Nylon string Dynarex 3243
Phosphate-buffered Saline (PBS) Lonza BE17-516F
RNase III Thermo Fisher Scientific AM2290
RNase T1 Thermo Fisher Scientific AM2283
Scissors Roboz Surgical Instrument RS-6802
Shaker or Small laboratory mixer Boekel Scientific 201100
SPHERO AccuCount Fluorescent Spherotech ACFP-70-5 1 to 10 dilution
Spider San Antonio Note: Locally collected
TBS (see recipe in Table 5)
TBS-T (see recipe in Table 5)
Total cell medium (see recipe in Table 5)
TRIzol Reagent Thermo Fisher Scientific 15596018
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416
UV Stratalinker 2400 UV LabX 20447
Wasp San Antonio Note: Locally collected

References

  1. Strachan, D. P. Hay fever, hygiene, and household size. BMJ. 299, 1259-1260 (1989).
  2. Schuijs, M. J., et al. Farm dust and endotoxin protect against allergy through A20 induction in lung epithelial cells. Science. 349, 1106-1110 (2015).
  3. Stein, M. M., et al. Innate Immunity and Asthma Risk in Amish and Hutterite Farm Children. New England Journal of Medicine. 375, 411-421 (2016).
  4. Roers, A., Hiller, B., Hornung, V. Recognition of Endogenous Nucleic Acids by the Innate Immune System. Immunity. 44, 739-754 (2016).
  5. Schlee, M., Hartmann, G. Discriminating self from non-self in nucleic acid sensing. Nature Reviews Immunology. 16, 566-580 (2016).
  6. Wu, J., Chen, Z. J. Innate immune sensing and signaling of cytosolic nucleic acids. Annual Reviews Immunology. 32, 461-488 (2014).
  7. O’Hara, A. M., Shanahan, F. The gut flora as a forgotten organ. EMBO Reports. 7 (7), 688-693 (2006).
  8. . Focused Meeting 2018: Microbes and Mucosal Surfaces Available from: https://microbiologysociety.org/event/society-events-and-meetings/focused-meeting-2018-microbes-and-mucosal-surfaces.html (2018)
  9. Weber, F., et al. Double-stranded RNA is produced by positive-strand RNA viruses and DNA viruses but not in detectable amounts by negative-strand RNA viruses. Journal of Virology. 80, 5059-5064 (2006).
  10. Barral, P. M., et al. Functions of the cytoplasmic RNA sensors RIG-I and MDA-5: Key regulators of innate immunity. Pharmacology and Therapeutics. 124, 219-234 (2009).
  11. Netea, M. G., et al. From the Th1/Th2 paradigm towards a Toll-like receptor/T-helper bias. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49, 3991-3996 (2005).
  12. McNally, B., et al. Intranasal administration of dsRNA analog poly(I:C) induces interferon-alpha receptor-dependent accumulation of antigen experienced T cells in the airways. PLoS One. 7, 51351 (2012).
  13. Seya, T., Takeda, Y., Matsumoto, M. Tumor vaccines with dsRNA adjuvant ARNAX induces antigen-specific tumor shrinkage without cytokinemia. Oncoimmunology. 5, 1043506 (2016).
  14. Toussi, D. N., Massari, P. Immune Adjuvant Effect of molecularly defined Toll-Like Receptor Ligands. Vaccines (Basel). 2, 323-353 (2014).
  15. She, L., et al. Immune Sensing of Aeroallergen-Associated Double-Stranded RNA Triggers an IFN Response and Modulates Type 2 Lung Inflammation. Journal of Immunology. 203, 2520-2531 (2019).
  16. Fujimoto, Y., et al. Pulmonary inflammation and cytokine dynamics of bronchoalveolar lavage fluid from a mouse model of bronchial asthma during A(H1N1)pdm09 influenza infection. Science Reports. 7, 9128 (2017).
  17. Yao, Y., et al. Induction of Autonomous Memory Alveolar Macrophages Requires T Cell Help and Is Critical to Trained Immunity. Cell. 175, 1634-1650 (2018).
  18. Dua, K., Shukla, S. D., Hansbro, P. M. Aspiration techniques for bronchoalveolar lavage in translational respiratory research: Paving the way to develop novel therapeutic moieties. Journal of Biological Methods. 4, 73 (2017).
  19. Van Hoecke, L., et al. Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration. Journal of Visualized Experiments. (123), e55398 (2017).
  20. Salahuddin, S., et al. Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment. Journal of Visualized Experiments. (148), e59427 (2019).
  21. Son, K. N., Liang, Z., Lipton, H. L. Double-Stranded RNA Is Detected by Immunofluorescence Analysis in RNA and DNA Virus Infections, Including Those by Negative-Stranded RNA Viruses. Journal of Virology. 89, 9383-9392 (2015).
  22. Monsion, B., et al. Efficient Detection of Long dsRNA in Vitro and in Vivo Using the dsRNA Binding Domain from FHV B2 Protein. Front Plant Sci. 9, 70 (2018).
  23. Redente, E. F., et al. Age and sex dimorphisms contribute to the severity of bleomycin-induced lung injury and fibrosis. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 301, 510-518 (2011).
  24. Card, J. W., et al. Gender differences in murine airway responsiveness and lipopolysaccharide-induced inflammation. Journal of Immunology. 177, 621-630 (2006).
  25. Gueders, M. M., et al. Mouse models of asthma: a comparison between C57BL/6 and BALB/c strains regarding bronchial responsiveness, inflammation, and cytokine production. Inflammation Research. 58, 845-854 (2009).

Play Video

Cite This Article
Alanazi, H. H., She, L., Li, X. Identification and Characterization of Immunogenic RNA Species in HDM Allergens that Modulate Eosinophilic Lung Inflammation. J. Vis. Exp. (159), e61183, doi:10.3791/61183 (2020).

View Video