Identificación y caracterización de especies de ARN inmunogénico en alérgenos de HDM que modulan la inflamación pulmonar eosinofílica
Summary
Los alérgenos ambientales, como los ácaros del polvo de la casa (HDM), a menudo contienen sustancias microbianas que activan las respuestas inmunitarias innatas para regular la inflamación alérgica. El protocolo presentado aquí demuestra la identificación de especies de dsRNA en los alérgenos de HDM y la caracterización de sus actividades inmunogénicas en la modulación de la inflamación pulmonar eosinofílica.
Abstract
Los alérgenos ambientales, como los ácaros del polvo de la casa (HDM), a menudo se encuentran en formas complejas que contienen tanto proteínas alérgicas que impulsan respuestas aberrantes de tipo 2 como sustancias microbianas que inducen respuestas inmunitarias innatas. Estos componentes microbianos asociados a alérgenos desempeñan un papel importante en la regulación del desarrollo de condiciones inflamatorias de tipo 2 como el asma alérgica. Sin embargo, los mecanismos subyacentes siguen siendo en gran medida indefinidos. El protocolo presentado aquí determina las características estructurales y la actividad in vivo del ARN inmunoestimulante asociado al alérgeno. Específicamente, se examinan alérgenos comunes para detectar la presencia de especies de ARN de doble cadena (dsRNA) que pueden estimular las respuestas de IFN en los pulmones y restringir el desarrollo de eosinofilia pulmonar grave en un modelo de ratón de asma alérgica inducida por HDM. Aquí, hemos incluido los siguientes tres ensayos: Punto blot para mostrar las estructuras dsRNA en el ARN total aislado de alérgenos incluyendo las especies de HDM, RT-qPCR para medir las actividades de ARN HDM en genes estimulantes del interferón (ISG) expresión en los pulmones de ratón y análisis FACS para determinar los efectos del ARN HDM en el número de eosinófilos en BAL y pulmón, respectivamente.
Introduction
Sobre la base de la hipótesis de higiene propuesta originalmente por Strachan1, la exposición en la primera infancia a factores microbianos ambientales como la endotoxina puede proteger contra el desarrollo de trastornos alérgicos2,,3. Durante las infecciones microbianas, por ejemplo, infecciones virales, la detección inmunitaria innata de ácidos nucleicos extraños (ARN/ADN) desencadena las respuestas de defensa del huésped4,,5,,6. Sin embargo, la existencia y prevalencia de ácidos nucleicos inmunogénicos como especies de ARN de doble cadena (dsRNA) en los ácaros del polvo de la casa (HDM) u otros alérgenos de insectos siguen siendo desconocidas. Este protocolo fue diseñado para determinar si el HDM o los alérgenos de insectos y no insectos contienen especies de dsRNA largos que pueden activar una respuesta inmune protectora para contrarrestar el desarrollo de inflamación pulmonar eosinofílica grave en un modelo de ratón de asma alérgica. Aquí, proporcionamos tres métodos simples y rápidos para evaluar los determinantes estructurales en el ARN total de HDM que se requieren para regular la inflamación pulmonar eosinofílica inducida por alérgenos.
El sistema inmunitario mucoso es el órgano inmune más grande del cuerpo y sirve como primera línea de defensa del huésped contra infecciones microbianas e insultos alérgicos7,,8. El dsRNA largo, el intermedio de replicación de muchos virus, se sabe que funciona como un patrón molecular asociado a patógenos (PAMP) para estimular poderosamente las respuestas innatas a través de Toll como el receptor 3 (TLR3) para inducir la expresión de genes estimulados por interferón (ISG)9,,10,,11,12,,13,,14. Recientemente hemos demostrado que el ARN total del HDM contenía estructuras de ARNm, que regulaban la expresión de ISG y reducían la inflamación pulmonar eosinofílica grave cuando se administraban a través de la instilación intratraqueal en un modelo murino de asma alérgica inducida por extractos de HDM15. La gravedad de las inflamaciones pulmonares se determina mediante el análisis de los tipos de células inmunitarias en lavado broncoalveolar (BAL) y tejido pulmonar a través de la citometría de flujo16,17,18,19,20.
Este protocolo incluye tres ensayos: 1) detección rápida de estructuras de dsRNA con mancha de puntos de ARN utilizando un anticuerpo monoclonal de ratón J2 que se une específicamente al dsRNA (40bp) de una manera independiente de la secuencia; 2) evaluación rápida de los efectos in vivo del ARN inmunoestimulador en los pulmones de ratón midiendo la inducción de ISG utilizando RT-qPCR; 3) cuantificación precisa de eosinófilos en BAL y pulmón en el contexto de la inflamación pulmonar inducida por HDM utilizando análisis de citometría de flujo.
Los ensayos anteriores se pueden utilizar para estudiar no sólo las enfermedades pulmonares alérgicas, sino también las infecciones bacterianas y virales respiratorias. Por ejemplo, el anticuerpo J2 específico de dsRNA también se puede utilizar en otras aplicaciones como cromatografía inmunoafinada, inmunohistoquímica, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) e inmunosuración21,,22,,23. Además, se pueden utilizar varias aplicaciones aguas abajo de la recolección de fluidos BAL para cuantificar contenidos solubles como citoquinas y quimioquinas utilizando ELISA, y el perfilado transcripcional de células en las vías respiratorias (por ejemplo, macrófagos alveolares). Aunque hay una variedad de protocolos disponibles en la literatura para evaluar las condiciones pulmonares, la mayoría de estos protocolos a menudo se centran en la validación de destino. Los procedimientos descritos aquí se pueden aplicar para identificar componentes en alérgenos ambientales que son importantes para regular el desarrollo de enfermedades alérgicas.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo actual describe cómo evaluar las propiedades inmunoestimuladoras del ARN microbiano asociado al alérgeno y sus impactos en el desarrollo de la inflamación pulmonar eosinofílica en un modelo de ratón de asma alérgica. Aunque los dsRNAs largos se conocen como los intermedios de replicación de muchos virus que pueden activar poderosamente las respuestas de interferón en las células de los mamíferos, sus presencias en los alérgenos HDM se han desconocido hasta nuestro trabajo reciente<sup class="xref"…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a la Sra. Karla Gorena por la asistencia técnica en citometría de flujo. L.S. cuenta con el apoyo del Consejo de Becas de China y la Fundación Provincial de Innovación de Hunan para El Posgrado (CX201713068). H.H.A. cuenta con el apoyo del Departamento de Ciencias de Laboratorio Clínico, Facultad de Ciencias Médicas Aplicadas, Universidad Jouf, Sakaka, Arabia Saudita. X.D.L. cuenta con el apoyo del Fondo de Inicio de la Escuela de Medicina de UT Health San Antonio y el Fondo Max y Minnei Voelcker.
Materials
| 0.40 µm Falcon Cell Strainer | Thermo Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| 1 mL syringes | Henke Sass Wolf | 5010.200V0 | |
| 15 mL Tube | TH.Geyer | 7696702 | |
| 50 mL Tube | TH.Geyer | 7696705 | |
| 70% ethanol | Decon Labs | 2701 | |
| Absolute Counting Beads | Life Technologies Europe B.V. | C36950 | |
| ACK-RBC lysing buffer | Lonza | 10-548E | |
| Amersham Hybond-N+ Membrane | GE Healthcare | RPN203B | |
| Ant | San Antonio | Note: Locally collected | |
| Antibody dilution buffer | (see Table 5 for recipe) | ||
| Anti-Mouse CD11b V450 Rat (clone M1/70) | BD Bioscience | 560456 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD11c PE-Cy7 (clone N418) | BioLegend | 117317 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD19 Alexa Flour 647 (clone 1D3) | eBioscience | 15-0193-81 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD3e APC (clone 145-2C11) | Invitrogen | 15-0031-81 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD45 APC-Cy7 (clone: 30-F11) | BioLegend | 103130 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse Fixable Viabillity Dye eFluor 506 | Invitrogen | 65-0866-14 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse IgG (H+L), AP Conjugate | Promega | S3721 | |
| Anti-Mouse Ly-6G FITC (clone RB6-8C5) | Invitrogen | 11-5931-82 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse MHC II APC-eFluor 780 (clone M5/114.15.2) | eBioscience | 47-5321-80 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse Siglec-F PE (clone E50-2440) | BD Pharmingen | 552126 | 1 to 200 dilution |
| BCIP/NBT substrate | Thermo Fisher Scientific | PI34042 | |
| Blocking Buffer | (see Table 5 for recipe) | ||
| Cannual, 20G X 1.5” | CADENCE SCIENCE | 9920 | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004030 | |
| CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad Laboratories | 1855485 | |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | C298-500 | |
| Cockroach | Greer Laboratories | B26 | |
| Counting beads | Thermo Fisher Scientific | 01-1234-42 | |
| D. farinae | Greer Laboratories | B81 | |
| D. pteronyssinus | Greer Laboratories | B82 | |
| Denville Cell Culture Plates with lid, 96 well cell culture plate | Thomas Scientific | 1156F03 | |
| Digital Dry Bath – Four Blocks | Universal Medical, Inc. | BSH1004 | |
| Earthworm | San Antonio | Note: Locally collected | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6511 | |
| FACS buffer | (see recipe in Table 5) | ||
| Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes, 5 mL | STEMCELLTM TECHNOLOGIES | 38056 | |
| Flow cytometer (BD FACS Celesta) | BD Biosciences | ||
| Fly | Greer Laboratories | B8 | |
| Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5135 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3110 | |
| HT-DNA | Sigma | D6898 | |
| In Vivo MAb anti-mouse CD16/CD32 (clone: 2.4G2) | Bio X Cell | BE0307 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad Laboratories | 1708891 | |
| Isoflurane | Abbott Labs | sc-363629Rx | |
| Isopropanol | Thermo Fisher Scientific | BP2618500 | |
| J2 anti-dsRNA monoclonal antibody | SCICONS | 10010200 | |
| Lung digestion solution | (see recipe in Table 5) | ||
| Lysing Matrix D | MP Biomedicals | 116913050-CF | |
| Lysing Matrix D, 2 mL tube | MP Biomedicals | SKU:116913100 | |
| Mice (female, 8-12 weeks old, C57BL/6J) | Jackson Laboratory | #000664 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | Sigma-Aldrich | 30120.094 | |
| Microscope | Olympus | CK30 | |
| Mini-BeadBeater | Homogenizers | SKU:BS:607 | |
| Mini-Beadbeater-16 | Biospec | 607 | |
| Mosquito | Greer Laboratories | B55 | |
| NanoDrop 2000C | Thermo Scientific Spectophotometer Medex Supply | TSCND2000C | |
| Needle, 21 G x 1 1/2 in | BD Biosciences | 305167 | |
| Non-fat milk | Bio-Rad Laboratories | 1706404 | |
| Nylon string | Dynarex | 3243 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Lonza | BE17-516F | |
| RNase III | Thermo Fisher Scientific | AM2290 | |
| RNase T1 | Thermo Fisher Scientific | AM2283 | |
| Scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-6802 | |
| Shaker or Small laboratory mixer | Boekel Scientific | 201100 | |
| SPHERO AccuCount Fluorescent | Spherotech | ACFP-70-5 | 1 to 10 dilution |
| Spider | San Antonio | Note: Locally collected | |
| TBS | (see recipe in Table 5) | ||
| TBS-T | (see recipe in Table 5) | ||
| Total cell medium | (see recipe in Table 5) | ||
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| UV Stratalinker 2400 UV | LabX | 20447 | |
| Wasp | San Antonio | Note: Locally collected |
References
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