Identifisering og karakterisering av immunogene RNA-arter i HDM-allergener som modulerer eosinofil lungebetennelse
Summary
Miljøallergener som husstøvmidd (HDM) inneholder ofte mikrobielle stoffer som aktiverer medfødte immunresponser for å regulere allergisk betennelse. Protokollen som presenteres her viser identifisering av dsRNA arter i HDM allergener og karakterisering av deres immunogene aktiviteter i modulerende eosinofillungebetennelse.
Abstract
Miljøallergener som husstøvmidd (HDM) er ofte i komplekse former som inneholder både allergiske proteiner som driver avvikende type 2-responser og mikrobielle stoffer som induserer medfødte immunresponser. Disse allergenrelaterte mikrobielle komponentene spiller en viktig rolle i å regulere utviklingen av type 2 inflammatoriske tilstander som allergisk astma. De underliggende mekanismene forblir imidlertid i stor grad udefinerte. Protokollen som presenteres her bestemmer de strukturelle egenskapene og in vivo-aktiviteten til allergenassoserende immunostimulerende RNA. Spesielt undersøkes vanlige allergener for tilstedeværelse av dobbelttrådet RNA (dsRNA) arter som kan stimulere IFN-responser i lungene og begrense utviklingen av alvorlig lungeeosinofili i en musemodell av HDM-indusert allergisk astma. Her har vi inkludert følgende tre analyser: Dot blot for å vise dsRNA-strukturene totalt RNA isolert fra allergener, inkludert HDM-arter, RT-qPCR for å måle aktivitetene til HDM RNA i interferon stimulerende gener (ISGs) uttrykk i muslunger og FACS-analyse for å bestemme effekten av HDM RNA på antall eosinofiler i BAL og lunge, henholdsvis.
Introduction
Basert på hygienehypotesen som opprinnelig ble foreslått av Strachan1, kan eksponering for miljømikriale faktorer som endotoxin beskytte mot utvikling av allergiske lidelser2,3. Under mikrobielle infeksjoner, for eksempel virusinfeksjoner, utløser den medfødte immundeteksjonen av fremmede nukleinsyrer (RNA/DNA) vertsforsvarsresponser4,,5,,6. Imidlertid forblir eksistensen og forekomsten av immunogene nukleinsyrer som lange dobbelttrådete RNA (dsRNA) arter i husstøvmidd (HDM) eller andre insektallergener ukjente. Denne protokollen ble designet for å avgjøre om HDM eller insekt og ikke-insektallergener inneholder lange dsRNA-arter som kan aktivere en beskyttende immunrespons for å motvirke utviklingen av alvorlig eosinofillungebetennelse i en musemodell av allergisk astma. Her gir vi tre enkle og raske metoder for å evaluere de strukturelle determinantene i HDM total RNA som kreves for å regulere allergenindusert eosinofillungebetennelse.
Slimhinne immunsystemet er det største immunorganet i kroppen og fungerer som den første linjen av vertsforsvar mot både mikrobielle infeksjoner og allergiske fornærmelser7,8. Den lange dsRNA, replikering mellomliggende av mange virus, er kjent for å fungere som et patogen-assosiert molekylært mønster (PAMP) for å stimulere medfødte responser via Toll som reseptor 3 (TLR3) for å indusere uttrykket av interferon stimulerte gener (ISGs)9,10,11,12,13,14. Vi har nylig vist at HDM total RNA inneholdt dsRNA strukturer, som upregulerte uttrykket av ISGs og redusert alvorlig eosinofil lungebetennelse når det administreres via intratrakeal instillasjon i en murin modell av allergisk astma indusert av HDM ekstrakter15. Alvorlighetsgraden av lungebetennelse bestemmes ved å analysere immuncelletyper i bronkoalveolære lavage (BAL) og lungevev via strømningscytometri16,17,18,19,20.
Denne protokollen inneholder tre analyser: 1) rask påvisning av dsRNA-strukturer med RNA dot blot ved hjelp av en mus monoklonalt antistoff J2 som spesifikt binder seg til dsRNA (≥40bp) på en sekvensuavhengig måte; 2) rask evaluering for in vivo effekter av immunostimulerende RNA i muselunger ved å måle induksjon av ISGs ved hjelp av RT-qPCR; 3) nøyaktig kvantifisering av eosinofiler i BAL og lunge i sammenheng med HDM-indusert lungebetennelse ved hjelp av flow cytometrianalyse.
Ovennevnte analyser kan brukes til å studere ikke bare allergiske lungesykdommer, men også respiratoriske bakterielle og virusinfeksjoner. For eksempel kan dsRNA-spesifikke J2-antistoff også brukes i andre applikasjoner som immunoaffinitetkromatografi, immunohistokjemi, enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA) og immunstoppnåelse21,22,23. I tillegg kan flere applikasjoner nedstrøms balvæskeoppsamling benyttes for å kvantifisere løselig innhold som cytokiner og kjemikere ved hjelp av ELISA, og transkripsjonsprofilering av celler i luftveiene (f.eks. alveolær makrofager). Selv om det finnes en rekke protokoller tilgjengelig i litteraturen for å evaluere lungeforhold, fokuserer de fleste av disse protokollene ofte på målvalideringen. Prosedyrene som er beskrevet her, kan brukes til å identifisere komponenter i miljøallergener som er viktige for å regulere utviklingen av allergiske sykdommer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den nåværende protokollen beskriver hvordan man evaluerer de immunostimulerende egenskapene til allergenassosiert mikrobiell RNA og deres virkninger på utviklingen av eosinofillungebetennelse i en musemodell av allergisk astma. Selv om lange dsRNAs er kjent som replikering mellomprodukter av mange virus som kan kraftig aktivere interferon svar i pattedyr celler, deres tilstedeværelse i HDM allergener har vært ukjent før vårt siste arbeid15. Kombinasjonen av RNA dot blot, RT-qPCR og FACS ana…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Ms. Karla Gorena for teknisk assistanse i flow cytometri. L.S. støttes av China Scholarship Council og Hunan Provincial Innovation Foundation for Postgraduate (CX201713068). H.H.A. støttes av Institutt for kliniske laboratorievitenskap, College of Applied Medical Sciences, Jouf University, Sakaka, Saudi-Arabia. X.D.L. støttes av UT Health San Antonio School of Medicine Startup Fund og Max og Minnei Voelcker Fund.
Materials
| 0.40 µm Falcon Cell Strainer | Thermo Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| 1 mL syringes | Henke Sass Wolf | 5010.200V0 | |
| 15 mL Tube | TH.Geyer | 7696702 | |
| 50 mL Tube | TH.Geyer | 7696705 | |
| 70% ethanol | Decon Labs | 2701 | |
| Absolute Counting Beads | Life Technologies Europe B.V. | C36950 | |
| ACK-RBC lysing buffer | Lonza | 10-548E | |
| Amersham Hybond-N+ Membrane | GE Healthcare | RPN203B | |
| Ant | San Antonio | Note: Locally collected | |
| Antibody dilution buffer | (see Table 5 for recipe) | ||
| Anti-Mouse CD11b V450 Rat (clone M1/70) | BD Bioscience | 560456 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD11c PE-Cy7 (clone N418) | BioLegend | 117317 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD19 Alexa Flour 647 (clone 1D3) | eBioscience | 15-0193-81 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD3e APC (clone 145-2C11) | Invitrogen | 15-0031-81 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD45 APC-Cy7 (clone: 30-F11) | BioLegend | 103130 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse Fixable Viabillity Dye eFluor 506 | Invitrogen | 65-0866-14 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse IgG (H+L), AP Conjugate | Promega | S3721 | |
| Anti-Mouse Ly-6G FITC (clone RB6-8C5) | Invitrogen | 11-5931-82 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse MHC II APC-eFluor 780 (clone M5/114.15.2) | eBioscience | 47-5321-80 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse Siglec-F PE (clone E50-2440) | BD Pharmingen | 552126 | 1 to 200 dilution |
| BCIP/NBT substrate | Thermo Fisher Scientific | PI34042 | |
| Blocking Buffer | (see Table 5 for recipe) | ||
| Cannual, 20G X 1.5” | CADENCE SCIENCE | 9920 | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004030 | |
| CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad Laboratories | 1855485 | |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | C298-500 | |
| Cockroach | Greer Laboratories | B26 | |
| Counting beads | Thermo Fisher Scientific | 01-1234-42 | |
| D. farinae | Greer Laboratories | B81 | |
| D. pteronyssinus | Greer Laboratories | B82 | |
| Denville Cell Culture Plates with lid, 96 well cell culture plate | Thomas Scientific | 1156F03 | |
| Digital Dry Bath – Four Blocks | Universal Medical, Inc. | BSH1004 | |
| Earthworm | San Antonio | Note: Locally collected | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6511 | |
| FACS buffer | (see recipe in Table 5) | ||
| Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes, 5 mL | STEMCELLTM TECHNOLOGIES | 38056 | |
| Flow cytometer (BD FACS Celesta) | BD Biosciences | ||
| Fly | Greer Laboratories | B8 | |
| Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5135 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3110 | |
| HT-DNA | Sigma | D6898 | |
| In Vivo MAb anti-mouse CD16/CD32 (clone: 2.4G2) | Bio X Cell | BE0307 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad Laboratories | 1708891 | |
| Isoflurane | Abbott Labs | sc-363629Rx | |
| Isopropanol | Thermo Fisher Scientific | BP2618500 | |
| J2 anti-dsRNA monoclonal antibody | SCICONS | 10010200 | |
| Lung digestion solution | (see recipe in Table 5) | ||
| Lysing Matrix D | MP Biomedicals | 116913050-CF | |
| Lysing Matrix D, 2 mL tube | MP Biomedicals | SKU:116913100 | |
| Mice (female, 8-12 weeks old, C57BL/6J) | Jackson Laboratory | #000664 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | Sigma-Aldrich | 30120.094 | |
| Microscope | Olympus | CK30 | |
| Mini-BeadBeater | Homogenizers | SKU:BS:607 | |
| Mini-Beadbeater-16 | Biospec | 607 | |
| Mosquito | Greer Laboratories | B55 | |
| NanoDrop 2000C | Thermo Scientific Spectophotometer Medex Supply | TSCND2000C | |
| Needle, 21 G x 1 1/2 in | BD Biosciences | 305167 | |
| Non-fat milk | Bio-Rad Laboratories | 1706404 | |
| Nylon string | Dynarex | 3243 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Lonza | BE17-516F | |
| RNase III | Thermo Fisher Scientific | AM2290 | |
| RNase T1 | Thermo Fisher Scientific | AM2283 | |
| Scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-6802 | |
| Shaker or Small laboratory mixer | Boekel Scientific | 201100 | |
| SPHERO AccuCount Fluorescent | Spherotech | ACFP-70-5 | 1 to 10 dilution |
| Spider | San Antonio | Note: Locally collected | |
| TBS | (see recipe in Table 5) | ||
| TBS-T | (see recipe in Table 5) | ||
| Total cell medium | (see recipe in Table 5) | ||
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| UV Stratalinker 2400 UV | LabX | 20447 | |
| Wasp | San Antonio | Note: Locally collected |
References
- Strachan, D. P. Hay fever, hygiene, and household size. BMJ. 299, 1259-1260 (1989).
- Schuijs, M. J., et al. Farm dust and endotoxin protect against allergy through A20 induction in lung epithelial cells. Science. 349, 1106-1110 (2015).
- Stein, M. M., et al. Innate Immunity and Asthma Risk in Amish and Hutterite Farm Children. New England Journal of Medicine. 375, 411-421 (2016).
- Roers, A., Hiller, B., Hornung, V. Recognition of Endogenous Nucleic Acids by the Innate Immune System. Immunity. 44, 739-754 (2016).
- Schlee, M., Hartmann, G. Discriminating self from non-self in nucleic acid sensing. Nature Reviews Immunology. 16, 566-580 (2016).
- Wu, J., Chen, Z. J. Innate immune sensing and signaling of cytosolic nucleic acids. Annual Reviews Immunology. 32, 461-488 (2014).
- O’Hara, A. M., Shanahan, F. The gut flora as a forgotten organ. EMBO Reports. 7 (7), 688-693 (2006).
- . Focused Meeting 2018: Microbes and Mucosal Surfaces Available from: https://microbiologysociety.org/event/society-events-and-meetings/focused-meeting-2018-microbes-and-mucosal-surfaces.html (2018)
- Weber, F., et al. Double-stranded RNA is produced by positive-strand RNA viruses and DNA viruses but not in detectable amounts by negative-strand RNA viruses. Journal of Virology. 80, 5059-5064 (2006).
- Barral, P. M., et al. Functions of the cytoplasmic RNA sensors RIG-I and MDA-5: Key regulators of innate immunity. Pharmacology and Therapeutics. 124, 219-234 (2009).
- Netea, M. G., et al. From the Th1/Th2 paradigm towards a Toll-like receptor/T-helper bias. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49, 3991-3996 (2005).
- McNally, B., et al. Intranasal administration of dsRNA analog poly(I:C) induces interferon-alpha receptor-dependent accumulation of antigen experienced T cells in the airways. PLoS One. 7, 51351 (2012).
- Seya, T., Takeda, Y., Matsumoto, M. Tumor vaccines with dsRNA adjuvant ARNAX induces antigen-specific tumor shrinkage without cytokinemia. Oncoimmunology. 5, 1043506 (2016).
- Toussi, D. N., Massari, P. Immune Adjuvant Effect of molecularly defined Toll-Like Receptor Ligands. Vaccines (Basel). 2, 323-353 (2014).
- She, L., et al. Immune Sensing of Aeroallergen-Associated Double-Stranded RNA Triggers an IFN Response and Modulates Type 2 Lung Inflammation. Journal of Immunology. 203, 2520-2531 (2019).
- Fujimoto, Y., et al. Pulmonary inflammation and cytokine dynamics of bronchoalveolar lavage fluid from a mouse model of bronchial asthma during A(H1N1)pdm09 influenza infection. Science Reports. 7, 9128 (2017).
- Yao, Y., et al. Induction of Autonomous Memory Alveolar Macrophages Requires T Cell Help and Is Critical to Trained Immunity. Cell. 175, 1634-1650 (2018).
- Dua, K., Shukla, S. D., Hansbro, P. M. Aspiration techniques for bronchoalveolar lavage in translational respiratory research: Paving the way to develop novel therapeutic moieties. Journal of Biological Methods. 4, 73 (2017).
- Van Hoecke, L., et al. Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration. Journal of Visualized Experiments. (123), e55398 (2017).
- Salahuddin, S., et al. Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment. Journal of Visualized Experiments. (148), e59427 (2019).
- Son, K. N., Liang, Z., Lipton, H. L. Double-Stranded RNA Is Detected by Immunofluorescence Analysis in RNA and DNA Virus Infections, Including Those by Negative-Stranded RNA Viruses. Journal of Virology. 89, 9383-9392 (2015).
- Monsion, B., et al. Efficient Detection of Long dsRNA in Vitro and in Vivo Using the dsRNA Binding Domain from FHV B2 Protein. Front Plant Sci. 9, 70 (2018).
- Redente, E. F., et al. Age and sex dimorphisms contribute to the severity of bleomycin-induced lung injury and fibrosis. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 301, 510-518 (2011).
- Card, J. W., et al. Gender differences in murine airway responsiveness and lipopolysaccharide-induced inflammation. Journal of Immunology. 177, 621-630 (2006).
- Gueders, M. M., et al. Mouse models of asthma: a comparison between C57BL/6 and BALB/c strains regarding bronchial responsiveness, inflammation, and cytokine production. Inflammation Research. 58, 845-854 (2009).
