In Vivo Quantification du chiffre d’affaires des protéines dans le vieillissement C. Elegans à l’aide de Photoconvertible Dendra2
Summary
Présenté ici est un protocole pour surveiller la dégradation de la protéine huntingtine fusionnée au fluorophore photoconvertible Dendra2.
Abstract
Les protéines sont synthétisées et dégradées constamment dans une cellule pour maintenir l’homéostasie. Être capable de surveiller la dégradation d’une protéine d’intérêt est essentiel pour comprendre non seulement son cycle de vie, mais aussi pour découvrir les déséquilibres dans le réseau de protéostase. Cette méthode montre comment suivre la dégradation de la huntingtine protéique causant la maladie. Deux versions de huntingtine fusionnées à Dendra2 sont exprimées dans le système nerveux de C. elegans : une version physiologique ou une avec une étendue étendue et pathogène de glutamines. Dendra2 est une protéine fluorescente photoconvertible; sur une courte impulsion d’irradiation ultraviolette (UV), Dendra2 passe de vert à rouge ses spectres d’excitation/émission. Semblable à une expérience de chasse à l’impulsion, le chiffre d’affaires du red-Dendra2 converti peut être surveillé et quantifié, indépendamment de l’interférence de la nouvelle synthèse verte-Dendra2. À l’aide de la microscopie confocale et de la transparence optique de C. elegans,il est possible de surveiller et de quantifier la dégradation de huntingtin-Dendra2 dans un organisme vivant et vieillissant. La huntingtine neuronale-Dendra2 est partiellement dégradée peu après la conversion et effacée plus loin au fil du temps. Les systèmes contrôlant la dégradation sont déficients en présence de huntingtine mutante et sont encore altérés par le vieillissement. Les sous-types neuronaux du même système nerveux présentent des capacités de rotation différentes pour huntingtin-Dendra2. Dans l’ensemble, la surveillance de toute protéine d’intérêt fusionnée à Dendra2 peut fournir des informations importantes non seulement sur sa dégradation et les acteurs du réseau de protéostase impliqués, mais aussi sur son emplacement, le trafic et le transport.
Introduction
Le protéome d’un organisme vivant se renouvelle constamment. Les protéines sont continuellement dégradées et synthétisées en fonction de la demande physiologique d’une cellule. Certaines protéines sont rapidement éliminées, tandis que d’autres sont plus longues. La surveillance de la dynamique des protéines est une tâche plus simple, plus précise et moins invasive lors de l’utilisation de protéines fluorescentes génétiquement codées (FP). Les RP se forment automatiquement et peuvent être fusionnés à n’importe quelle protéine d’intérêt (POI), mais n’ont pas besoin d’enzymes pour plier ou ont besoin de cofacteurs sauf pour l’oxygène1. Une nouvelle génération de FP a récemment été conçue pour changer de couleur sur l’irradiation avec une impulsion lumineuse de longueur d’onde déterminée. Ces FPs photoactivables (PAFP) permettent l’étiquetage et le suivi des POI, ou des organites ou des cellules dans lesquelles ils résident, et d’examiner leurs paramètres quantitatifs et/ou qualitatifs2. Les FP permettent de suivre le mouvement, la directionnalité, le taux de locomotion, le coefficient de diffusion, les fractions mobiles par rapport aux fractions immobiles, le temps qu’il réside dans un compartiment cellulaire, ainsi que son taux de rotation. Pour des organites spécifiques, la locomotion et le transport, ou les événements de fission et de fusion peuvent être déterminés. Pour un type de cellule particulier, la position, le taux de division, le volume et la forme d’une cellule peuvent être établis. Surtout, l’utilisation de PAFPs permet le suivi sans visualisation continue et sans interférence à partir d’une sonde nouvellement synthétisée. Des études menées dans des cellules et dans des organismes entiers ont utilisé avec succès des PAFP pour aborder des questions biologiques in vivo, telles que le développement du cancer et de la métastase, l’assemblage ou le démontage du cytosquelette, et les interactions ARN-ADN/protéine3. Dans ce manuscrit, la microscopie légère et les PAFP sont utilisés pour découvrir les taux de rotation de la huntingtine protéique (HTT) à l’agrégation in vivo dans un modèle de C. elegans de la maladie neurodégénérative.
Le protocole décrit ici quantifie la stabilité et la dégradation de la protéine de fusion huntingtine-Dendra2 (HTT-D2). Dendra2 est un PAFP monomériquede deuxième génération qui commute irréversiblement ses spectres d’émission/excitation du vert au rouge en réponse à la lumière bleue UV ou visible, avec une augmentation de son intensité allant jusqu’à 4 000 fois5,6. Huntingtine est la protéine responsable de la cause de la maladie de Huntington (MH), un trouble neurodégénératif héréditaire mortel. Huntingtin exon-1 contient un tronçon de glutamines (CAG, Q). Lorsque la protéine est exprimée avec plus de 39Q, elle se replie mal en une protéine mutante, toxique et pathogène. Mutant HTT est sujette à l’agrégation et conduit à la mort et la dégénérescence des cellules neuronales, soit en tant qu’espèces oligomériques courtes ou comme plus grandes amyloïdes très structurées7.
Le nématode est un système modèle pour étudier le vieillissement et la neurodégénérescence grâce à sa facilité de manipulation, la nature isogénique, la courte durée de vie, et sa transparence optique8. Pour étudier la stabilité de HTT in vivo, une construction de fusion a été exprimée dans le système nerveux de C. elegans. Un transgène HTT-D2 contenant soit un tronçon physiologique de 25Qs (HTTQ25-D2) ou un tronçon pathologique de 97Qs (HTTQ97-D2) est surexprimé pan-neuronal tout au long de la durée de vie du nématode9. En soumettant C. elegans en direct à un point de lumière bref et concentré, un seul neurone est photoswitched et le HTT-D2 converti est suivi au fil du temps. Pour établir la quantité de HTT-D2 dégradée, la différence entre le signal rouge du HTT-D2 fraîchement converti est comparée au signal rouge restant de HTT-D2 après une période déterminée. Par conséquent, il devient possible d’étudier comment la huntingtine est dégradée lorsqu’elle est trouvée sous sa forme étendue et toxique par rapport à sa forme physiologique; comment les neurones antérieurs ou postérieurs réagissent différemment à la présence de Q97 par rapport au Q25, en particulier sur des périodes prolongées; et comment l’effondrement du réseau de protéostase (PN) pendant le vieillissement contribuent aux différences dans les taux de dégradation. Ces résultats ne décrivent qu’un petit ensemble d’observations sur le chiffre d’affaires de HTT-D2. Cependant, beaucoup plus de questions biologiques pertinentes à la fois dans le domaine de l’agrégation des protéines et de la protéostasie peuvent être abordées avec cette application in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pour comprendre la fonction d’une protéine, il est important de comprendre sa synthèse, son emplacement et sa dégradation. Avec le développement de FP nouveaux, stables et brillants, la visualisation et la surveillance des POI sont devenues plus faciles et plus efficaces. Les PAFP de fusion génétiquement exprimés comme Dendra2 sont particulièrement bien placés pour étudier la stabilité d’un POI. Lors de l’exposition à la lumière bleu pourpre, Dendra2 se brise à un endroit précis dans une triade d’a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous reconnaissons le DFG (KI-1988/5-1 à JK, NeuroCure PhD fellowship par le NeuroCure Cluster of Excellence à MLP) pour le financement. Nous reconnaissons également le centre d’imagerie du Leibniz Research Institute for Molecular Pharmacology Berlin (FMP) pour fournir l’imagerie mise en place. En outre, nous tenons à remercier Diogo Feleciano qui a établi le système Dendra2 dans le laboratoire et fourni des instructions.
Materials
| Agar-Agar Kobe I | Carl Roth GmbH + Co. KG | 5210.2 | NGM component |
| Agarose, Universal Grade | Bio & Sell GmbH | BS20.46.500 | Mounting slide component |
| BD Bacto Peptone | BD-Bionsciences | 211677 | NGM component |
| Deckgläser-18x18mm | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0657.2 | Cover slips |
| EC Plan-Neufluar 20x/0.50 Ph2 M27 | Carl Zeiss AG | Objective | |
| Fiji/ImageJ 1.52p | NIH | Analysis Software | |
| Levamisole Hydrochloride | AppliChem GmbH | A4341 | Anesthetic |
| LSM710-ConfoCor3 | Carl Zeiss AG | Laser Scanning Confocal Micoscope | |
| Mounting stereomicroscope | Leica Camera AG | Mounting microscope | |
| neuronal-HTTQ25-Dendra2 | this paper | C. elegans strain | |
| neuronal-HTTQ97-Dendra2 | this paper | C. elegans strain | |
| OP50 Escherichia coli | CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) | OP50 | Nematode food source |
| Sodium Chloride | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3957.2 | NGM component |
| Standard-Objektträger | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0656.1 | Glass slides |
| ZEN2010 B SP1 | Carl Zeiss AG | Confocal acquisition software |
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