I Vivo Kvantificering af protein omsætning i Aging C. Elegans bruger Photoconvertible Dendra2
Summary
Præsenteret her er en protokol til at overvåge nedbrydningen af proteinet huntingtin smeltet til fotokonvertible fluorophore Dendra2.
Abstract
Proteiner syntetiseres og nedbrydes konstant i en celle for at opretholde homøostase. At være i stand til at overvåge nedbrydningen af et protein af interesse er nøglen til at forstå ikke kun dets livscyklus, men også for at afdække ubalancer i proteostasenetværket. Denne metode viser, hvordan man kan spore nedbrydningen af det sygdomsskabende protein huntingtin. To versioner af huntingtin smeltet til Dendra2 er udtrykt i C. elegans nervesystem: en fysiologisk version eller en med en udvidet og patogen strækning af glutaminer. Dendra2 er et fotokonverterende fluorescerende protein; ved en kort ultraviolet (UV) bestrålingspuls, skifter Dendra2 sin excitation/emission spektre fra grøn til rød. Svarende til en puls-chase eksperiment, kan omsætningen af den konverterede rød-Dendra2 overvåges og kvantificeres, uanset indblanding fra nyligt syntetiseret grøn-Dendra2. Ved hjælp af konfoalbaseret mikroskopi og på grund af den optiske gennemsigtighed i C. eleganser det muligt at overvåge og kvantificere nedbrydningen af huntingtin-Dendra2 i en levende, aldrende organisme. Neuronal huntingtin-Dendra2 nedbrydes delvist kort efter omdannelse og ryddes yderligere over tid. De systemer, der styrer nedbrydningen, er mangelfulde i tilstedeværelsen af mutant huntingtin og forringes yderligere ved ældning. Neuronale undertyper inden for samme nervesystem har forskellige omsætningskapaciteter for huntingtin-Dendra2. Samlet set kan overvågning af ethvert protein af interesse, der er smeltet sammen med Dendra2, give vigtige oplysninger ikke blot om dets nedbrydning og aktørerne i det involverede proteostasisnetværk, men også om dets placering, menneskehandel og transport.
Introduction
Proteomet i en levende organisme fornyer sig konstant. Proteiner nedbrydes og syntetiseres løbende i henhold til en celles fysiologiske behov. Nogle proteiner er hurtigt elimineret, mens andre er længere levetid. Overvågning protein dynamik er en enklere, mere præcis, og mindre invasiv opgave, når du bruger genetisk kodede fluorescerende proteiner (FPs). FPs form autocatalytisk og kan smeltes til ethvert protein af interesse (POI), men kræver ikke enzymer til at folde eller har brug for cofaktorer spare for ilt1. En nyere generation af FPs er for nylig blevet manipuleret til at skifte farve på bestråling med en lys puls af bestemt bølgelængde. Disse fotoaktive FP’er (PAFPs) gør det muligt at mærke og spore POI’er eller de organeller eller celler, de bor i, og at undersøge deres kvantitative og/eller kvalitative parametre2. FPs gør det muligt at spore enhver POI’s bevægelse, retningsbestemthed, sats for bevægelse, diffuseringskoefficient, mobil versus immobile fraktioner, den tid, den er bosat i en cellulær rum, samt dens omsætningshastighed. For specifikke organeller kan bevægelse og transport eller fissions- og fusionshændelser bestemmes. For en bestemt celletype kan der oprettes en celles placering, delingshastighed, volumen og form. Afgørende, brugen af PAFPs tillader sporing uden kontinuerlig visualisering og uden interferens fra enhver nyligt syntetiseret sonde. Undersøgelser både i celler og i hele organismer har med succes anvendt PAFPs til at behandle biologiske spørgsmål in vivo, såsom udvikling af kræft og metastase, samling eller demontering af cytoskeleton, og RNA-DNA/protein interaktioner3. I dette manuskript anvendes let mikroskopi og PAFPs til at afdække omsætningsraten for det sammenlægningsudsatte protein huntingtin (HTT) in vivo i en C. elegans model af neurodegenerative sygdomme.
Den her beskrevne protokol kvantificerer stabiliteten og nedbrydningen af fusionsproteinet huntingtin-Dendra2 (HTT-D2). Dendra2 er en anden generations monomerisk PAFP4, der uigenkaldeligt skifter sin emission / excitation spektre fra grøn til rød som reaktion på enten UV eller synligt blåt lys, med en stigning i dens intensitet på op til 4.000-fold5,6. Huntingtin er det protein, der er ansvarligt for at forårsage Huntingtons Sygdom (HS), en dødelig arvelig neurodegenerativ lidelse. Huntingtin exon-1 indeholder en strækning af glutaminer (CAG, Q). Når proteinet udtrykkes med over 39Q, misfolds det til et mutant, giftigt og patogent protein. Mutant HTT er tilbøjelig til sammenlægning og fører til neuronal celledød og degeneration, enten som korte oligomerarter eller som større højt strukturerede amyloider7.
Den nematode er en model system til at studere aldring og neurodegeneration takket være dens lethed af manipulation, isogene natur, kort levetid, og dens optiske gennemsigtighed8. For at studere stabiliteten af HTT in vivo, en fusion konstruktion blev udtrykt i nervesystemet af C. elegans. En HTT-D2 transgene, der indeholder enten en fysiologisk strækning på 25Qs (HTTQ25-D2) eller en patologisk strækning på 97Qs (HTTQ97-D2) er overudtrykt pan-neuronalt hele nematodens levetid9. Ved at udsætte levende C. elegans for en kort og fokuseret lyspunkt, en enkelt neuron er photoswitched og den konverterede HTT-D2 spores over tid. For at bestemme mængden af HTT-D2 forringet sammenlignes forskellen mellem det røde signal fra den nykonverterede HTT-D2 med det resterende røde signal fra HTT-D2 efter en bestemt periode. Det bliver derfor muligt at undersøge, hvordan huntingtin nedbrydes, når det findes i sin udvidede og toksiske form i forhold til dets fysiologiske form; hvordan forreste eller bageste neuroner reagerer forskelligt på tilstedeværelsen af Q97 versus Q25, især over længere perioder; og hvordan sammenbruddet af proteostase-netværket (PN) under aldring bidrager til forskellene i nedbrydningshastigheder. Disse resultater beskriver kun et lille sæt bemærkninger om omsætningen i HTT-D2. Men mange flere biologiske spørgsmål, der er relevante for både området for proteinaggregering og proteostase, kan behandles med denne in vivo-applikation.
Protocol
Representative Results
Discussion
For at forstå et proteins funktion er det vigtigt at forstå dets syntese, placering og nedbrydning. Med udviklingen af nye, stabile og lyse FPs, visualisering og overvågning POI’er er blevet lettere og mere effektiv. Genetisk udtrykt fusion PAFPs såsom Dendra2 er unikt positioneret til at studere stabiliteten af en POI. Ved udsættelse for lilla-blåt lys, Dendra2 pauser på et præcist sted inden for en triade af bevarede aminosyrer. Fluorophore gennemgår en lille strukturel ændring, hvilket resulterer i en fuldst…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi anerkender DFG (KI-1988/5-1 til JK, NeuroCure PhD-stipendium fra NeuroCure Cluster of Excellence til MLP) for finansiering. Vi anerkender også Imaging Core Facility af Leibniz Research Institute for Molecular Pharmacology Berlin (FMP) for at levere billeddannelse oprettet. Derudover vil vi gerne takke Diogo Feleciano, der etablerede Dendra2-systemet i laboratoriet og gav instruktioner.
Materials
| Agar-Agar Kobe I | Carl Roth GmbH + Co. KG | 5210.2 | NGM component |
| Agarose, Universal Grade | Bio & Sell GmbH | BS20.46.500 | Mounting slide component |
| BD Bacto Peptone | BD-Bionsciences | 211677 | NGM component |
| Deckgläser-18x18mm | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0657.2 | Cover slips |
| EC Plan-Neufluar 20x/0.50 Ph2 M27 | Carl Zeiss AG | Objective | |
| Fiji/ImageJ 1.52p | NIH | Analysis Software | |
| Levamisole Hydrochloride | AppliChem GmbH | A4341 | Anesthetic |
| LSM710-ConfoCor3 | Carl Zeiss AG | Laser Scanning Confocal Micoscope | |
| Mounting stereomicroscope | Leica Camera AG | Mounting microscope | |
| neuronal-HTTQ25-Dendra2 | this paper | C. elegans strain | |
| neuronal-HTTQ97-Dendra2 | this paper | C. elegans strain | |
| OP50 Escherichia coli | CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) | OP50 | Nematode food source |
| Sodium Chloride | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3957.2 | NGM component |
| Standard-Objektträger | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0656.1 | Glass slides |
| ZEN2010 B SP1 | Carl Zeiss AG | Confocal acquisition software |
References
- Tsien, R. Y. The Green Fluorescent Protein. Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 509-544 (1998).
- Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Fluorescent Proteins for Photoactivation Experiments. Methods in Cell Biology. 85 (08), 45-61 (2008).
- Lukyanov, K. A., Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Verkhusha, V. V. Photoactivatable fluorescent proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 885-890 (2005).
- Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2. Nature Protocols. 2 (8), 2024-2032 (2007).
- Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nature Biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).
- Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Using photoactivatable fluorescent protein Dendra2 to track protein movement. BioTechniques. 42 (5), 553-565 (2007).
- Bates, G. P., et al. Huntington disease. Nature Reviews Disease Primers. 1 (1), 15005 (2015).
- Nussbaum-Krammer, C. I., Morimoto, R. I. Caenorhabditis elegans as a model system for studying non-cellautonomous mechanisms in protein-misfolding diseases. DMM Disease Models and Mechanisms. 7 (1), 31-39 (2014).
- Chen, L., Fu, Y., Ren, M., Xiao, B., Rubin, C. S. A RasGRP, C. elegans RGEF-1b, Couples External Stimuli to Behavior by Activating LET-60 (Ras) in Sensory Neurons. Neuron. 70 (1), 51-65 (2011).
- . Plasmids 101: A Desktop Resource Available from: https://info.addgene.org/download-addgenes-ebook-plasmids-101-3rd-edition (2020)
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. The EMBO Journal. 10 (12), 3959-3970 (1991).
- Mariol, M. C., Walter, L., Bellemin, S., Gieseler, K. A rapid protocol for integrating extrachromosomal arrays with high transmission rate into the C. elegans genome. Journal of Visualized Experiments. (82), e50773 (2013).
- Kreis, P., et al. ATM phosphorylation of the actin-binding protein drebrin controls oxidation stress-resistance in mammalian neurons and C. elegans. Nature Communications. 10 (1), 1-13 (2019).
- Juenemann, K., Wiemhoefer, A., Reits, E. A. Detection of ubiquitinated huntingtin species in intracellular aggregates. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 1-8 (2015).
- Hamer, G., Matilainen, O., Holmberg, C. I. A photoconvertible reporter of the ubiquitin-proteasome system in vivo. Nature Methods. 7 (6), 473-478 (2010).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: the online review of C. elegans biology. 1999, 1-11 (2006).
- Collins, J. J., Huang, C., Hughes, S., Kornfeld, K. The measurement and analysis of age-related changes in Caenorhabditis elegans. WormBook: the online review of C. elegans biology. , 1-21 (2008).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Hobert, O. Specification of the nervous system. WormBook. , 1-19 (2005).
- Ross, C. A., Poirier, M. A. What is the role of protein aggregation in neurodegeneration?. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 891-898 (2005).
- Adam, V., Nienhaus, K., Bourgeois, D., Nienhaus, G. U. Structural basis of enhanced photoconversion yield in green fluorescent protein-like protein Dendra2. Biochemistry. 48 (22), 4905-4915 (2009).
- Tsvetkov, A. S., et al. Proteostasis of polyglutamine varies among neurons and predicts neurodegeneration. Nature Chemical Biology. 9 (9), 586-594 (2013).
- Barmada, S. J., et al. Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models. Nature Chemical Biology. 10 (8), 677-685 (2014).
- Feleciano, D. R., et al. Crosstalk Between Chaperone-Mediated Protein Disaggregation and Proteolytic Pathways in Aging and Disease. Frontiers in Aging Neuroscience. 11, (2019).
- Zhang, L., et al. Method for real-time monitoring of protein degradation at the single cell level. BioTechniques. 42 (4), 446-450 (2007).
- Zhang, Z., Heidary, D. K., Richards, C. I. High resolution measurement of membrane receptor endocytosis. Journal of Biological Methods. 5 (4), 105 (2018).
- Gunewardene, M. S., et al. Superresolution imaging of multiple fluorescent proteins with highly overlapping emission spectra in living cells. Biophysical Journal. 101 (6), 1522-1528 (2011).
