I Vivo Kvantifisering av proteinomsetning i aldring C. Elegans ved hjelp av photoconvertible Dendra2
Summary
Presentert her er en protokoll for å overvåke nedbrytning av protein huntingtin smeltet til fotokonverterbar fluorophore Dendra2.
Abstract
Proteiner syntetiseres og degraderes hele tiden i en celle for å opprettholde homeostase. Å kunne overvåke nedbrytningen av et protein av interesse er nøkkelen til å forstå ikke bare livssyklusen, men også å avdekke ubalanser i proteostasenettverket. Denne metoden viser hvordan du sporer nedbrytningen av det sykdomsfremkallende proteinjakttinet. To versjoner av huntingtin smeltet til Dendra2 uttrykkes i C. elegans nervesystemet: en fysiologisk versjon eller en med en utvidet og patogen strekning av glutaminer. Dendra2 er et fotokonverterbart fluorescerende protein; ved en kort ultrafiolett (UV) bestrålingspuls, bytter Dendra2 eksitasjons-/utslippsspektraen fra grønt til rødt. I likhet med et pulsjakteksperiment, kan omsetningen til den konverterte rød-Dendra2 overvåkes og kvantifiseres, uavhengig av interferens fra nylig syntetisert grønn-Dendra2. Ved hjelp av konkalsk-basert mikroskopi og på grunn av den optiske gjennomsiktigheten til C. elegans,er det mulig å overvåke og kvantifisere nedbrytningen av huntingtin-Dendra2 i en levende, aldrende organisme. Neuronal huntingtin-Dendra2 er delvis degradert kort tid etter konvertering og ryddet videre over tid. Systemene som kontrollerer nedbrytning er mangelfulle i nærvær av mutert huntingtin og er ytterligere svekket med aldring. Nevronale undertyper i samme nervesystem viser ulike omsetningskapasiteter for huntingtin-Dendra2. Samlet sett kan overvåking av protein av interesse smeltet til Dendra2 gi viktig informasjon ikke bare om nedbrytning og aktørene i proteostasenettverket som er involvert, men også på plassering, menneskehandel og transport.
Introduction
Proteomen til en levende organisme fornyer seg hele tiden. Proteiner er kontinuerlig degradert og syntetisert i henhold til den fysiologiske etterspørselen til en celle. Noen proteiner elimineres raskt, mens andre lenger blir levd. Overvåking av proteindynamikk er en enklere, mer nøyaktig og mindre invasiv oppgave når du bruker genetisk kodede fluorescerende proteiner (FPer). FPs danner autokatalytisk og kan smeltes til ethvert protein av interesse (POI), men krever ikke enzymer for å brette eller trenger kofaktorer spare for oksygen1. En nyere generasjon av FPs har nylig blitt utviklet for å bytte farge ved bestråling med en lys puls av bestemt bølgelengde. Disse fotoaktivatable FPs (PAFPs) tillater merking og sporing av POIer, eller organeller eller celler de bor i, og for å undersøke deres kvantitative og / eller kvalitative parametere2. FPs gjør det mulig å spore noen POI bevegelse, retningsbestemthet, frekvensen av bevegelse, koeffisient av diffusjon, mobil versus immobile fraksjoner, tiden den ligger i ett mobilrom, samt omsetningshastigheten. For spesifikke organeller kan bevegelse og transport, eller fisjon og fusjonshendelser bestemmes. For en bestemt celletype kan en celleposisjon, delingshastighet, volum og form opprettes. Avgjørende, bruk av PAFPs tillater sporing uten kontinuerlig visualisering og uten interferens fra noen nylig synthetized probe. Studier både i celler og i hele organismer har brukt PAFPs for å løse biologiske spørsmål in vivo, for eksempel utvikling av kreft og metastase, montering eller demontering av cytoskeleton, og RNA-DNA/ protein interaksjoner3. I dette manuskriptet brukes lysmikroskopi og PAFPs til å avdekke omsetningsraten til aggregasjonsutsatt protein huntingtin (HTT) in vivo i en C. elegans modell av nevrodegenerativ sykdom.
Protokollen som er beskrevet her kvantifiserer stabiliteten og nedbrytningen av fusjonsproteinet huntingtin-Dendra2 (HTT-D2). Dendra2 er en andregenerasjons monomeric PAFP4 som irreversibelt bytter sin utslipp / eksitasjonspektrast fra grønn til rød som svar på enten UV eller synlig blått lys, med en økning i intensiteten på opptil 4000 ganger5,6. Huntingtin er proteinet som er ansvarlig for å forårsake Huntington sykdom (HS), en dødelig arvelig nevrodegenerativ lidelse. Huntingtin exon-1 inneholder en strekning av glutaminer (CAG, Q). Når proteinet uttrykkes med over 39Q, feilfolder det inn i et mutert, giftig og patogent protein. Mutant HTT er utsatt for aggregering og fører til nevronal celle død og degenerasjon, enten som korte oligomeriske arter eller som større svært strukturerte amyloider7.
Nematoden er et modellsystem for å studere aldring og nevrodegenerasjon takket være sin enkle manipulasjon, isogen natur, kort levetid og optisk gjennomsiktighet8. For å studere stabiliteten til HTT in vivo, ble en fusjonskonstruksjon uttrykt i nervesystemet til C. elegans. En HTT-D2 transgene som inneholder enten en fysiologisk strekning av 25Qs (HTTQ25-D2) eller en patologisk strekning på 97Qs (HTTQ97-D2) er overexpressed pan-neuronally gjennom nematodens levetid9. Ved å utsette live C. elegans til et kort og fokusert lyspunkt, er et enkelt nevron fotowitched og den konverterte HTT-D2 spores over tid. For å fastslå mengden HTT-D2 degradert, sammenlignes forskjellen mellom det røde signalet til den nykonverterte HTT-D2 med det gjenværende røde signalet til HTT-D2 etter en bestemt tidsperiode. Derfor blir det mulig å undersøke hvordan huntingtin brytes ned når det finnes i sin utvidede og giftige form sammenlignet med den fysiologiske formen; hvordan fremre eller bakre nevroner reagerer annerledes på tilstedeværelsen av Q97 versus Q25, spesielt over lengre tidsperioder; og hvordan sammenbruddet av proteostase nettverket (PN) under aldring bidra til forskjellene i nedbrytning priser. Disse resultatene beskriver bare et lite sett med observasjoner om omsetningen av HTT-D2. Imidlertid kan mange flere biologiske spørsmål som er relevante for både feltet proteinaggregasjon og proteostase, løses med denne in vivo-applikasjonen.
Protocol
Representative Results
Discussion
For å forstå et protein funksjon er det viktig å forstå sin syntese, plassering og nedbrytning. Med utviklingen av nye, stabile og lyse FPer har visualisering og overvåking av INTERESSEPUNKTER blitt enklere og mer effektivt. Genetisk uttrykte fusjon PAFPs som Dendra2 er unikt posisjonert for å studere stabiliteten til et INTERESSEPUNKT. Ved eksponering for lilla-blått lys, dendra2 bryter på et presist sted innenfor en triade av bevarte aminosyrer. Fluorophore gjennomgår en liten strukturell endring, noe som resu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi anerkjenner DFG (KI-1988/5-1 til JK, NeuroCure PhD-fellesskap av NeuroCure Cluster of Excellence til MLP) for finansiering. Vi anerkjenner også Imaging Core Facility av Leibniz Research Institute for Molecular Pharmacology Berlin (FMP) for å gi bildebehandling satt opp. I tillegg vil vi takke Diogo Feleciano som etablerte Dendra2-systemet i laboratoriet og ga instruksjoner.
Materials
| Agar-Agar Kobe I | Carl Roth GmbH + Co. KG | 5210.2 | NGM component |
| Agarose, Universal Grade | Bio & Sell GmbH | BS20.46.500 | Mounting slide component |
| BD Bacto Peptone | BD-Bionsciences | 211677 | NGM component |
| Deckgläser-18x18mm | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0657.2 | Cover slips |
| EC Plan-Neufluar 20x/0.50 Ph2 M27 | Carl Zeiss AG | Objective | |
| Fiji/ImageJ 1.52p | NIH | Analysis Software | |
| Levamisole Hydrochloride | AppliChem GmbH | A4341 | Anesthetic |
| LSM710-ConfoCor3 | Carl Zeiss AG | Laser Scanning Confocal Micoscope | |
| Mounting stereomicroscope | Leica Camera AG | Mounting microscope | |
| neuronal-HTTQ25-Dendra2 | this paper | C. elegans strain | |
| neuronal-HTTQ97-Dendra2 | this paper | C. elegans strain | |
| OP50 Escherichia coli | CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) | OP50 | Nematode food source |
| Sodium Chloride | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3957.2 | NGM component |
| Standard-Objektträger | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0656.1 | Glass slides |
| ZEN2010 B SP1 | Carl Zeiss AG | Confocal acquisition software |
References
- Tsien, R. Y. The Green Fluorescent Protein. Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 509-544 (1998).
- Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Fluorescent Proteins for Photoactivation Experiments. Methods in Cell Biology. 85 (08), 45-61 (2008).
- Lukyanov, K. A., Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Verkhusha, V. V. Photoactivatable fluorescent proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 885-890 (2005).
- Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2. Nature Protocols. 2 (8), 2024-2032 (2007).
- Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nature Biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).
- Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Using photoactivatable fluorescent protein Dendra2 to track protein movement. BioTechniques. 42 (5), 553-565 (2007).
- Bates, G. P., et al. Huntington disease. Nature Reviews Disease Primers. 1 (1), 15005 (2015).
- Nussbaum-Krammer, C. I., Morimoto, R. I. Caenorhabditis elegans as a model system for studying non-cellautonomous mechanisms in protein-misfolding diseases. DMM Disease Models and Mechanisms. 7 (1), 31-39 (2014).
- Chen, L., Fu, Y., Ren, M., Xiao, B., Rubin, C. S. A RasGRP, C. elegans RGEF-1b, Couples External Stimuli to Behavior by Activating LET-60 (Ras) in Sensory Neurons. Neuron. 70 (1), 51-65 (2011).
- . Plasmids 101: A Desktop Resource Available from: https://info.addgene.org/download-addgenes-ebook-plasmids-101-3rd-edition (2020)
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. The EMBO Journal. 10 (12), 3959-3970 (1991).
- Mariol, M. C., Walter, L., Bellemin, S., Gieseler, K. A rapid protocol for integrating extrachromosomal arrays with high transmission rate into the C. elegans genome. Journal of Visualized Experiments. (82), e50773 (2013).
- Kreis, P., et al. ATM phosphorylation of the actin-binding protein drebrin controls oxidation stress-resistance in mammalian neurons and C. elegans. Nature Communications. 10 (1), 1-13 (2019).
- Juenemann, K., Wiemhoefer, A., Reits, E. A. Detection of ubiquitinated huntingtin species in intracellular aggregates. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 1-8 (2015).
- Hamer, G., Matilainen, O., Holmberg, C. I. A photoconvertible reporter of the ubiquitin-proteasome system in vivo. Nature Methods. 7 (6), 473-478 (2010).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: the online review of C. elegans biology. 1999, 1-11 (2006).
- Collins, J. J., Huang, C., Hughes, S., Kornfeld, K. The measurement and analysis of age-related changes in Caenorhabditis elegans. WormBook: the online review of C. elegans biology. , 1-21 (2008).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Hobert, O. Specification of the nervous system. WormBook. , 1-19 (2005).
- Ross, C. A., Poirier, M. A. What is the role of protein aggregation in neurodegeneration?. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 891-898 (2005).
- Adam, V., Nienhaus, K., Bourgeois, D., Nienhaus, G. U. Structural basis of enhanced photoconversion yield in green fluorescent protein-like protein Dendra2. Biochemistry. 48 (22), 4905-4915 (2009).
- Tsvetkov, A. S., et al. Proteostasis of polyglutamine varies among neurons and predicts neurodegeneration. Nature Chemical Biology. 9 (9), 586-594 (2013).
- Barmada, S. J., et al. Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models. Nature Chemical Biology. 10 (8), 677-685 (2014).
- Feleciano, D. R., et al. Crosstalk Between Chaperone-Mediated Protein Disaggregation and Proteolytic Pathways in Aging and Disease. Frontiers in Aging Neuroscience. 11, (2019).
- Zhang, L., et al. Method for real-time monitoring of protein degradation at the single cell level. BioTechniques. 42 (4), 446-450 (2007).
- Zhang, Z., Heidary, D. K., Richards, C. I. High resolution measurement of membrane receptor endocytosis. Journal of Biological Methods. 5 (4), 105 (2018).
- Gunewardene, M. S., et al. Superresolution imaging of multiple fluorescent proteins with highly overlapping emission spectra in living cells. Biophysical Journal. 101 (6), 1522-1528 (2011).
