Summary
该协议的目标是持续监测人类胰岛移植过程和贡献宿主与供体细胞的动态。这是通过移植人类小岛到NOD的眼部(ACE)前室来完成的。(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-鼠标接收者,然后是重复的 2 光子成像。
Abstract
成像β细胞是了解胰岛移植的关键一步。虽然在体内已经开发和利用了用于β细胞生物学记录的不同成像 平台,但它们在允许单细胞分辨率和连续纵向记录方面是有限的。由于角膜的透明度,小鼠眼前室(ACE)非常适合研究人类和小鼠胰岛细胞生物学。以下是如何使用这种方法对单个人类小岛移植进行连续纵向记录和再血管化的描述。使用NO NOD将人类小岛嫁接插入ACE。(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-小鼠作为接受者。这允许调查接受者与供体细胞的扩大和接受者细胞在促进移植物的封装和血管化方面的贡献。此外,还概述了一种分步方法,用于图像分析和定量的小岛体积或分段血管和小岛胶囊形成接受细胞。
Introduction
糖尿病描述一组代谢性疾病,其特征是血糖水平升高,其特征是胰腺胰岛β细胞损失或功能障碍导致胰岛素生产不足,通常伴有胰岛素抵抗。1型(T1D)和2型糖尿病(T2D)是复杂的疾病,其中β细胞的渐进功能障碍导致疾病发展。T1D是由对β细胞的自身免疫攻击引起的,而T2D被认为是由代谢因素驱动的,尽管有越来越多的证据表明低级全身炎症1。移植供体人类小岛,特别是T1D患者,提供生理血糖控制的潜力。然而,组织捐献者短缺和小岛移植不良使得小岛移植成为主流治疗选择。由于缺氧、炎症、免疫原源环境2,3,功能小岛移植在移植后(24~48小时)的直接转移期丢失了很大一部分功能性小岛移植物。为了评估干预方法的效率,以提高小岛的生存,持续监测这种移植是必要的。
在体内技术,以图像和跟踪移植后人类胰腺胰岛的命运仍然是一个挑战,糖尿病研究,4,5。迄今为止,非侵入性成像技术,包括正电子发射断层扫描(PET)、磁共振成像(MRI)或超声波(美国)等,在实验条件下对移植小岛进行定量和功能评估的潜力。然而,鉴于小小小的小小小小,这些模式的定量测量由于分辨率不足而受到影响。眼前腔室(ACE)作为观察的移植点,是一种很有前途的无创成像解决方案,提供有效的更高的空间分辨率和长期长时间的频繁监测。这种方法已被成功地用于研究小鼠小岛生物学(见杨等人7),自身免疫免疫反应8,以及人类小岛移植9,10。109
在这里,ACE移植方法与2光子成像方法相结合,通过连续和重复记录单个胰岛移植,在移植后长达10个月,研究人类胰岛移植过程的动态。成像深度更大、整体光漂白和照片损伤减少的多光子成像特性克服了共声显微镜11的成像局限性。荧光成像的定量涉及几个阶段,包括小岛样品制备、小岛移植、图像采集、图像滤波以去除小岛噪声或背景、分割、定量和数据分析。最具挑战性的步骤通常是将图像分割或分割为多个部分或区域。这可能涉及将信号与背景噪声分离,或根据颜色或形状的相似性聚类体素区域,以检测和标记表示小岛血管的 3D 体积的体素。一旦分段,数据对象卷大小等统计信息通常很容易提取。提供一种用于对成像数据进行量化和提取的方法,如分段和数据可视化。特别注意去除人类小岛中的自荧光,区分小岛血管和小岛胶囊形成接受细胞。
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Protocol
瑞典隆德地区伦理委员会根据《关于人类研究伦理审查法》批准了这项研究。动物实验严格按照瑞典动物实验伦理进行,并经马尔默和隆德伦理委员会批准。6 至 8 周大免疫缺陷 NOD。(Cg)-gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/- (NOD.罗莎 -番茄Rag2-/-)接受小鼠被用作人类小岛10的移植接受者。
1. 岛移植准备
- Cmrl 1066 中的区域性人类小岛辅以 10 mM HEPES, 2 mM L-谷氨酰胺、50μg/mL根霉素、0.25μg/mL真菌区、20μg/mL西普罗克斯氟沙星、10 mM烟酰胺(NIC)和10%热灭活人血清在37°C下在5%CO2和加湿空气直到移植,如前面所述的12。
注:小岛应不含外分泌组织,在培养中不应相互接触。外分泌组织出现半透明。 - 在移植当天,使用连接到拉玻璃毛细管的吸气管组件将含有小孔的培养介质转移到新的培养皿中。
注:或者,使用 200 μL 移液器。在立体显微镜下,对培养皿的背面进行着色有助于使小岛更容易区分。 - 使用立体显微镜,每个移植选择+20~40个小岛,并转移到1.5 mL管。用培养箱中的培养培养剂将管子填充到顶部。
- 用石蜡膜密封管,储存在冰上直到移植。为进行移植的数量准备适当的数量。
- 或者,确保手术室有 CO2 培养箱,以保持培养中的小岛,并在每次移植前立即挑选。
2. 准备移植设备和手术台
注:所有手术工具应自动洗,手术台和器具应用70%的酒精消毒。
- 通过鼻罩将立体热头支架连接到麻醉,然后打开加热垫。
- 将气密的汉密尔顿注射器连接到聚乙烯管和钝端眼管。
注:建议在装配前用 PBS 填充所有零件。检查是否出现滞留的气泡,如果存在,请清除。 - 将汉密尔顿注射器紧紧地连接到桌子(图1a)或可移动底座(图1e),将管子连接到立体显微镜上,将管子垂下(即等待位置)。
注:使用手术胶带,因为它很容易去除和重新连接。 - 准备一个1 mL注射器连接到30G针头充满0.1毫克/千克丁丙诺啡溶液。
- 准备带无菌 PBS 的注射器。或者,使用移液器。
- 留出一个带加热灯的清洁唤醒笼。
3. 接受小鼠的麻醉和手术定位
注:所有动物在隆德大学动物设施的无病原体环境中繁殖和饲养。
- 在充满 40% O2 /60%N2/3% 异氟的腔室中麻醉鼠标,将麻醉小鼠转移到加热垫上的头架平台上 (图 1a).检查是否缺乏踏板反射。
注:异氟兰麻醉是手术后快速恢复的首选麻醉方法。显微镜室必须适当通风才能使用异氟。 - 将鼠标的鼻子放入连接到 40% O2/60% N2/0.9% =1.5% 异氟兰麻醉机的麻醉面膜中。使用拇指和手指稍微抬起头部,并使用两侧的金属碎片将其固定。确保耳机将头部直接固定到耳朵下方。在小鼠背面下皮注射0.1毫克/千克丁丙诺啡溶液。
注:丁丙诺啡用作 镇痛剂。 - 倾斜头部,使要操作的眼睛朝上,靠近研究人员。
- 轻轻缩回眼睑,用钝钳移植,把眼睛弹出,用一对钳子轻轻固定。确保钳子的尖端用连接到头架平台的聚乙烯管覆盖(图1a,插入)。
- 在眼睛上涂抹一滴无菌 PBS,始终保持双眼湿润。
- 将人类小岛从密封的1.5 mL管(第1节)转移到具有无菌PBS的培养皿中,并确保小岛彼此靠近,以尽量减少细胞培养培养培养的转移量(图1c)。
- 在眼管中拾取±20~30个小岛,通过聚乙烯管连接到汉密尔顿注射器。
注:在小岛中尽可能少地利用液体。 - 将管子倒置并连接到立体显微镜(图1d)。小心地将管子固定下来,让小岛沉入管子的末端,朝向管子。
4. 移植手术
注:该方法之前已描述为小鼠小岛6的移植。此处提供了稍微修改的过程。
- 捏后腿的垫子,确保鼠标睡着了。
- 在不中断血液流动的情况下拧紧钳子,并在眼睛上涂抹一滴无菌 PBS。
- 使用25G针作为手术刀,斜向上,仔细穿透只有一半的尖在角膜,使一个单一的横向切口。使孔向上角;移植后孔会更容易密封(图1f)。
- 小心地抬起角膜,用预先装上小岛的角膜,慢慢在眼睛中涂抹小岛。避免将导管插入前室,以防止虹膜损坏,而是小心地推向角膜开口(图 1g)。 慢慢从 ACE 中收回管。
注:针对3~8μL的注射量。如果体积太大,它会使眼睛暴露在不必要的高眼内压力下,并可能导致注射的小岛从前室回流。 - 当由于眼室压力增加而难以插入小岛时,通过加强横向切口部位重新应用小岛来扩大切口部位。
注:有时,引入的气泡可用作空间支架。 - 将眼凝胶涂抹在眼睛上,松开眼部抑制钳,将鼠标留在同流体上,在相同位置放置 8~10 分钟,让小岛设置。
- 取下保持眼睑的钳子,将眼睑放回正常位置。
- 将鼠标从头架上取下,并将其转移到唤醒笼中。
- 当鼠标清醒并移动时,将其转移回原始笼子,并放在动物壳体中,直到扫描(建议至少 5 天)。
5. 通过2光子显微镜对植入的人类小岛进行成像
注:建议在移植前2光子成像前4~5天使用荧光立体显微镜(图2a+c) 对眼睛进行概览图像,以本地化感兴趣的小岛。避免在移植后尽早把眼睛限制得太紧。使用2光子成像6~7天后移植。
- 启动图像采集软件( 参见材料表)。在"激光"菜单中激活迈泰激光(电源"ON"),在"光路"菜单中将波长设置为900 nm,并应用从5%~10%激光功率(使用滑块)开始的最小传输激光功率。
注:扫描时,根据需要调整激光功率。 - 设置绿色、橙色和红色通道。使用二元镜 (LBF 760) 将发射光同时收集到三个非扫描探测器 (NDD) 上,并发布如下发射滤波器信息:红色/血管感应 680、690~730 nm;绿色/自动荧光,500~550 nm;和橙子/番茄,565×610nm(图2d)。
- 将头架台放在电动显微镜舞台上,将气垫连接到麻醉机的管子,将管连接到通风系统。打开加热垫。
- 麻醉接收小鼠,转移到头部持有人平台,抑制眼睛成像,并管理丁丙诺啡溶液如上所述(步骤3.1~3.5)。
- 根据需要调整异氟蒸汽。每分钟呼吸 ±55~65(bpm)表示最佳麻醉。如果麻醉太深,速率将为 <50 bpm,呼吸沉重或喘气;如果太轻,速率将是 >70 bpm 与表面呼吸。每15分钟通过目视检查仔细监测麻醉期间小鼠。
注:麻醉因小鼠而异,因小鼠菌株而异,并且随着麻醉时间的进展而变化。 - 将足够的眼凝胶作为眼角膜和镜片之间的浸入液体,使其慢慢积聚(图2f,插入)。避免气泡。
注:建议使用柔性金属软管灯进行侧照明,以调整焦点并本地化小岛嫁接。 - 要可视化血管,使用一次性胰岛素 30 G 注射器将 100 μL 的成像剂(例如血管感 680)静脉注射到尾静脉中。
- 在"采集模式"中,将帧大小调整为 512 x 512 和扫描速度。
注:较慢的扫描(即增加停留时间)将提高信噪比。 - 在"通道"菜单中, 调整每个 PMT 的主增益(以伏特表示)以放大信号,直到在 实时扫描模式下在屏幕上 看到图像。此值越高,探测器对信号和噪声越敏感。
注:最好将值保持在 500~800 V 之间。 - 在"Z 堆栈"菜单中,通过手动将焦点移动到小岛嫁接的顶部来定义 z 堆栈的开头和结束。通过选择"先设置"保存位置。移动到最后一个底部平面,可以集中在小岛嫁接和保存位置选择"设置最后"。使用 2 μm 的 z 步进大小。
- 通过单击"开始实验"选项卡收集最终图像堆栈,并保存为 8 位 CZI(即卡尔蔡司格式)文件。
6. 通过共和显微镜对植入的人类小岛进行成像
注:通过检测激光背散射光10,通过单独扫描(即单独轨迹)中监测体内散in vivo射信号,可以评估移植小岛的总体积、形态和可塑性。
- 拿出主光束分离器(即 LBF 滤波器),并在"光路"对话框中为共聚焦成像设置了单独的轨道。选择波长为 633 nm 且检测波长与激光相同的 Argon 激光器。Z 堆栈的步进尺寸为 2±3 μm,用于反散散光信号。
- 重新调整 z 堆栈设置以确保记录整个小岛(请参见步骤 5.10)。
- 获取图像堆栈并保存为 8 位 CZI 文件。
7. 图像分析
注:此步骤 使用了商业软件(参见材料表)。
- 去除小岛自荧光 (图 3b)
- 在[图像处理]选项卡选择"通道算术"和键入"ch1-ch2"。这将创建一个新的通道 4 (ch 4);重命名为[血管]。
注:绿色/自动荧光通道从红色/血管感应通道中减去。 - 重复上一步并键入"ch3-ch2"以创建新通道 (ch 5);重命名为"番茄 (全部)"。
注:从橙色/番茄通道中减去绿色/自动荧光通道。
- 在[图像处理]选项卡选择"通道算术"和键入"ch1-ch2"。这将创建一个新的通道 4 (ch 4);重命名为[血管]。
- 通过手动绘图定义小岛掩码 (图 3c)
- 创建新曲面(蓝色符号),并在向导中选择"手动编辑"。将指针保持为"选择"模式,并在3D视图中取消单击"音量"( 场景下)以可视化节。
- 为便于小岛边界歧视,请激活所有通道,包括 ch 1+ch 3。
注:橙色/番茄通道可用于通过番茄胶囊信号定义小岛边界。或者,增加通道强度,使用多通道小岛自荧光和探测器背景信号作为指导。 - 在"绘图"选项卡选择"轮廓"并单击"绘制"中,开始绘制小岛边框周围的轮廓,从切片位置 1 开始。
- 移动到新的切片位置并重复绘制轮廓。以小岛顶部的最后一个切片结束,然后通过单击"创建曲面"选项卡结束。通常,每 10 个切片绘制一个轮廓就足够了 。
- 使用小岛面膜的"小岛血管"和"小岛番茄"荧光的分割(图3d)。
- 选择以前定义的"岛蒙版"对象,转到编辑选项卡(铅笔 符号),然后单击"全部蒙版"选项卡,该选项卡将打开一个新窗口。
- 在通道选择下拉菜单中选择以前命名的通道"Vasculature"(ch4),并激活选项"应用掩码前重复通道","常量内/外",将外表面的体素设置为"0.000",从而创建一个新通道;重命名为[岛血管] (ch6) 。
- 重复步骤 7.3.1 和 7.3.2,并在通道选择Tomato下拉菜单中选择以前创建的通道"番茄(全部)"(ch 5)以创建新通道;重命名为 [岛番茄](ch 7) 。
- 小岛血管的表面渲染 (图 3e)
- 在"场景"菜单中创建新曲面,并在向导中选择"自动创建"。
- 将源通道设置为以前创建的"岛血管"(ch 6) 并选择背景减法。如果需要,可以调整自动阈值估计。与响应荧光通道进行比较(例如,通过混合/混合新创建的曲面选项卡)。在向导中继续。
- 可选地使用筛选器。例如,选择"体积"并调整窗口中的滤镜(黄色),该窗口可以移除选定的曲面对象。完成向导并命名新的曲面对象"小岛血管"。
- "小番茄血管"荧光信号的分割 (图 3f)
- 在以前创建的"岛体血管"曲面 对象中,转到编辑选项卡并单击"全部蒙版"选项卡,该选项卡将打开一个新窗口。
- 选择以前命名的通道"岛番茄"(ch 7)在通道选择下拉菜单,并设置体素外表面到"10.000",这将创建新通道;重命名为[岛番茄血管](ch 8) 。
- "番茄胶囊"荧光信号的分割 (图 3g)
- 选择"通道算术"中的"图像处理"选项卡和键入"ch7-ch8",创建新的通道;重命名为 [番茄胶囊] (ch 9) 。
注:从总的"小番茄"荧光信号中减去"小番茄"荧光信号。
- 选择"通道算术"中的"图像处理"选项卡和键入"ch7-ch8",创建新的通道;重命名为 [番茄胶囊] (ch 9) 。
- [岛番茄血管] 和 [番茄胶囊]的表面渲染(图 3h)
- 按照步骤7.4,并在向导选择源通道"岛番茄血管"(ch 8)或"番茄胶囊"(ch 9)创建相应的新的表面对象。
- 总小岛表面的表面渲染( 图 3i)
- 打开小岛反散散器文件并创建新曲面。
- 在向导中,选择"自动创建"并定义"感兴趣区域"。
注:"感兴趣区域" 用于分隔多个小岛的信号并定义要分析的小岛的深度(例如,顶部 75 μm)。 - 如果需要,在"绝对强度"中调整阈值。可以单击或关闭曲面对象以与相应的通道强度进行交叉检查。关闭向导。
- 量化 (图 3j)
- 在"场景"菜单中选择一个已创建的曲面对象,然后转到"统计"选项卡。
- 要检索所选曲面对象中的详细体积数据,请选择"详细"选项卡,并从下拉菜单中选择"特定值"和"体积"。要检索所选曲面对象的总体积值,请转到"详细"选项卡并选择"平均值"。
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Representative Results
非标记的人类小岛被移植到8周大的女性NOD的ACE中。(Cg)-gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-(NOD.罗莎- 番茄Rag2=/=)接受小鼠。为了防止人体组织排斥,免疫缺陷的Rag2敲除小鼠被选为接受者。在这些转基因小鼠中,所有细胞和组织都表示一种以膜为目标的番茄荧光蛋白(mT),可以清楚地识别接受者和供体组织。高分辨率 2 光子显微镜对小岛移植物的重复成像可以识别参与移植过程的 mT+ 受助细胞及其动态迁移模式。
一般来说,人类小岛在受接受小鼠的ACE中的移植设置(图1a)与单岛形状和大小方面的合成小鼠岛移植相似(图1b,c)。c图1d,e显示了一个典型的移植,详细的示意图显示横向切口部位(图1f)和小岛进入眼室(图1g)和注射小鼠小岛(图1h)或人类小岛(图1i)的代表性结果。e人类小岛嫁接率普遍较低(+30%)比鼠标小岛(50~70%)。造成这种差异的一个可能原因是,人类小岛的供应是不可预知的,通常只有1天的通知,而且获得的小岛在捐赠者年龄、捐赠者体重指数、纯度(45%~86%)和后隔离培养时间(2~5天)上各不相同。相比之下,与小鼠的孤立可以很容易地进行规划。这些小鼠与6-8周大(即年轻的成人)小鼠分离,具有高纯度和短的隔夜培养时间。在解释结果时,应考虑小鼠和人类小岛嫁接之间的这些差异。
人体体荧光成像人类小岛移植物受到组织自身荧光的显著干扰(图4)。利用可见光谱中的传统波长成像剂对ACE移植的人类小岛移植移植的再血管化过程的可视化受到低信噪比和高水平天然小岛自荧光的阻碍, 用光谱范围为 500~700 nm(图4a)的 μ-扫描图像或带滤波器的敏感非扫描 PMT 探测器(用于检测 dextran TR (610~675 nm) (图4b)进行说明。在小鼠小岛移植中未观察到这种高背景(图4c)。NIR发射成像剂血管感知680显示信号与背景比明显较高,因为近红外范围690~730nm的背景噪声降低(图4d,图3a)。"未使用"通道(即 500–550 nm)的额外记录可用于稍后的图像处理步骤,以消除自然小岛自荧光引起的剩余背景噪声。2光子/共声成像设置(图2d+f)与前面描述的6类似,除了使用900nm 2光子激发和荧光检测安吉奥森680、自动荧光和番茄通道与非扫描PMTs 1-3(图2d)。建议测量每个显微镜设置的激光输出功率到达样品(图2e)。此外,建议使用立体显微镜(图2a+c)对移植的小岛进行初步成像,这将有助于选择感兴趣的小岛,避免移植失败的2光子显微镜图像。
从许多图像中提取定量数据的目的是消除数据选择中的潜在偏差,并获取在比较实验时检测合法效果所需的统计能力。从胰腺胰岛荧光成像的定量涉及几个步骤,每个步骤都可能影响另一个步骤的结果。在这里,使用了交互式成像软件。它包含允许可视化体积图像和对象的特征,以及根据对象的形态或强度识别对象。图 3说明了图像分割中的不同步骤。通过减去"自动荧光"通道去除自荧光,提高了信噪比(图3a,b)。b称为"小岛掩码"(图3c)和相应通道(图3d)的小岛边界是手动定义的。番茄信号分割成小岛血管和小岛胶囊(图3f,g)和最终表面渲染(g图3e,h,i)用于提取定量数据h。i
图5显示了同一人类小岛移植在2周、2个月、5个月和8个月后移植到NOD的ACE中具有代表性的纵向成像会话。罗莎- 番茄Rag2-/-接收鼠标。图示为最初记录的 RAW 数据的最大强度投影 (MIP) 图像 (图5a),在小岛自荧光去除后处理的图像 (图 5b+e, f=i),和分段的小岛物体,包括胶囊 (图5j,m)或小岛血管形成mT=接受细胞 (红色, 图5n +q)和总小岛血管 (绿色, 图5n+q).
图1:将胰岛移植到眼前室。
(a) 移植设置显示麻醉小鼠固定在立体热头架和外露的眼睛(插入)旁边的准备汉密尔顿注射器固定在桌子上和立体显微镜准备挑选小鼠小岛(b)或人类小岛(c)。(d) 装有小岛眼管的等待位置。(e) 移植过程中,和 (f) 单侧切口的示意图绘制,用于小心地抬起角膜与眼角膜尖,并分配小岛到前室(g).注射老鼠小岛(h)或人类小岛(i)后立即的眼睛图像。比例线 = 500 μm. 请单击此处查看此图的较大版本。
图2:ACE植入胰岛移植的成像。
(a) 实验荧光立体显微镜成像设置。B6的宽场( b ) 或荧光图像 (c) .罗莎- 番茄岛移植。(d) 简化发射光路方案。LBF:激光阻挡滤波器(主光束分离器);LP:长通;BP:带通;PMT:光电倍增器。(e) 激光输出功率在很大程度上取决于波长.图显示了与激光束的功率水平 (%) 相关的实际激光输出功率 (W), 用于显微镜设置。圆: 800 nm, 方形: 900 nm, 三角形: 1,000 nm.(f) 实验成像设置显示接收小鼠与ACE移植小岛(插入)安装在电动阶段的商业显微镜。比例线 = 100 μm 请单击此处查看此图的较大版本。
图3:在NOC的ACE中嫁接的人类小岛的图像分割。罗莎- 番茄Rag2-/- 接收鼠标。
(a) 原始记录:显示的是人类小岛的图像堆栈的 3D 渲染,具有合并通道或分裂通道的光学部分 Angiosense 680 (ch 1)、自动荧光 (ch 2) 和番茄 (ch 3)。(b) 图像堆栈的3D渲染与合并通道或光学部分与分裂通道[Vasculature](ch 4) 和[番茄(全部)](ch5)后自动荧光去除。(c) 岛面膜(黄色)。(d) 图像堆栈的3D渲染与合并或分割通道[小岛血管](ch 6,白色),[小岛番茄](ch 7,红色)。(e) 从 ch 6创建的表面物体[小岛血管] 。(f) 图像堆栈与合并通道的3D渲染 [小岛血管] (ch 6, 绿色) 和 [小岛番茄血管] (ch 8, 红色)。(g) 3D渲染的[番茄胶囊] (ch 9) 后通道减法 ch 7+ch 8 或光学部分与合并通道 "番茄胶囊" (ch 9, 白色), 小岛番茄血管 (ch 8, 红色), 和小岛血管 (ch 6, 绿色).(h) 番茄胶囊的表面渲染(从 ch 9 创建)和小岛番茄血管(从 ch 8 创建)。(i) 从人类小岛背散散信号的岛体分割显示选择"感兴趣区域"(左)和分割表面对象(中间)与通道强度(右)。(j) 从统计选项卡中检索数据。比例线 = 50 μm. 请单击此处查看此图的较大版本。
图4:人类小岛自荧光。
人类小岛(a、b、d)或B6鼠岛d(c)被移植到NOD的ACE中。Rag2-/-或B6接收小鼠,并注射了德xtran TR (a+c) 或血管感680成像剂 (d)用于血管的可视化。(a) 在 500~700 nm 范围内对人类小岛移植物进行+扫描,在 900 nm 时进行 2 光子激发。人类 (b ) 或鼠标小岛移植(c ) 的最大图像投影 (MIP) 图像在 900 nm 时兴奋,并检测出 NDD 的 TR 滤波器 (610–675 nm)。(d) 人类小岛移植物的MIP在900nm时兴奋,使用NDD的血管感680滤波器(690~730nm)进行检测。比例线 = 50 μm. 请单击此处查看此图的较大版本。
图5:移植的人类小岛通过表达受接受源细胞的mT逐渐重新血管化和封装。
人类小岛移植到NOD的前眼室。 罗莎- 番茄Rag2+/= 受助小鼠,被反复成像长达 8 个月。血管感知680被注射用于血管的可视化。(a) 在移植后5个月内,原始记录的原始原始数据的最大强度预测(MIP)分裂(血管、自动荧光、mT)或合并通道和背散散光信号。单是总血管的MIPS (b=e) 或与膜靶向番茄荧光 (mT) (f=i) 在小岛自发光去除后合并 (绿色, a).在指示时间点移植后,分段小岛番茄胶囊(j=m)和小岛番茄血管 (红色) 或总小岛血管 (绿色)(n=q)的 3D 渲染。比例线 = 50 μm. 请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
提出了一种通过观察接受者和供体组织的介入来研究人类胰岛细胞移植过程的方法。在将人类小岛植入免疫缺陷小鼠眼的前室的微创手术后,小鼠在手术后几分钟内迅速恢复。手术在一只眼睛上执行。一般来说,从植入后5~7天开始,角膜被充分治愈,可以进行病毒内成像。
在这个协议中,人类小岛嫁接的质量至关重要。人类小岛的质量以及移植结果可能因捐赠者的年龄、BMI和隔离过程,以及到达之前和之后小岛培养的时间而异。从经批准用于临床移植和研究目的的器官供体胰腺处理的人类胰岛经捐赠者同意使用。他们是在胰腺消化和胰岛净化过程后获得的,描述在其他地方12。与孤立的 murine 小岛类似,这些小岛在酶消化步骤14、15期间会经历许多细胞攻击,如缺血、机械应力、基底蛋白损失和岛内内内内内内皮细胞 (ECs) 的部分中断。尽管文化条件不断改善,大量优质人类小岛恢复,但移植时间仍然是一个关键因素。在文化的第一天,人类小岛显示小岛内EC的显著损失,在6天的培养中,只有小的内皮结构在小岛核心可以检测到16。这种岛内内内皮细胞的丧失可能是减少人类小岛移植的关键因素,因为供岛内腹膜是再血管化过程中的重要参与者。
在移植过程中保持不育对于避免免疫功能低下的NO NOD中的眼部感染至关重要。罗莎- 番茄Rag2- /- 老鼠。通常,移植手术是在干净的条件下使用手套、实验室外套、头盖和口罩进行的,但不是在生物安全柜内。所有用过的溶液都是无菌过滤的,注射器、管子、管子和纱布用70%乙醇冲洗。唤醒笼是自动 <3>开的。虽然由于在手术过程中手动处理小鼠,无法保证完全不育,但小岛污染或眼部感染不是此程序的问题。
稳定而充分的麻醉是低帧率数据采集期间减少眼动和漂移的重要和关键因素,不同麻醉剂的有效性可能不同。在光,一般异氟麻醉下,眼睛偶尔会以缓慢滚动的方式移动,麻醉深度增加(从1~2%)通常可以减少眼睛的运动。使用可吸入麻醉的显著优势是它的快速效果和恢复时间。然而,应该指出,使用异氟兰可能会改变胰岛素分泌19。
图像分析和分割,或将图像分割为多个区域,在数据选择20中具有挑战性,并存在潜在的偏差。分割旨在识别对象,如"小血管"进行定量。在这里,基于强度阈值的方法应用于选择区域(即"绝对强度")或强度差异以查找边(即"背景减法")。目前,荧光显微镜中还没有通用的分段解决方案。一种方法就是试验支持一系列方法的商业软件。如果阈值因背景强度变化而失败,则图像捕获设置中的细微更改可能会改善分割结果。
这种方法的一个局限性在于,人类移植被接受者细胞更迅速地取代,事实上,由小鼠接受者内皮细胞完全重组。如果目的是研究通过与人类内皮细胞相互作用迁移到小岛帕伦奇马的采用性转移的人类免疫细胞,这将排除人类细胞相互作用的研究。然而,在小鼠和人类小岛移植中,类似的再血管化发生在接受者中,并遵循针对该物种的不同解剖 3D 计划。
贝塔细胞替代疗法的成功率不断提高。然而,由于缺乏适当的病毒内成像技术,在评估小岛嫁接和体内生存效率方面仍然存在各种挑战。前眼室是一个有用的移植点,支持胰岛细胞的重复和长期体内成像 in vivo,用于研究胰岛形态学、血管化模式、贝塔细胞功能和细胞分辨率下贝塔细胞死亡。
这里报道的ACE移植现场研究人类小岛移植移植过程的方案允许对人类小岛移植进行纵向监测,其分辨率远高于其他替代纵向平台,如MRI 21、22、PET,2223、SPECT24或生物发光25。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究得到了瑞典研究理事会、战略研究领域 Exodiab、Dnr 2009-1039、瑞典战略研究基金会 Dnr IRC15-0067、Lund皇家物理学会、糖尿病基金会和巴恩迪亚贝特本特公司的支持。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Anasthesia machine, e.g. Anaesthesia Unit U-400 | Agnthos | 8323001 | used for isofluran anasthesia during surgery and imaging |
-induction chamber 1.4 L | Agnthos | 8329002 | connect via tubing to U-400 |
-gas routing switch | Agnthos | 8433005 | connect via tubing to U-400 |
AngioSense 680 EX | Percin Elmer | NEV10054EX | imaging agent for injection, used to image blood vessels in human islet grafts |
Aspirator tubes assemblies | Sigma | A5177-5EA | connect with pulled capillary pipettes for manual islet picking |
Buprenorphine (Temgesic) 0.3mg/ml | Schering-Plough Europé | 64022 | fluid, for pain relief |
Capillary pipettes | VWR | 321242C | used together with Aspirator tubes assemblies |
Dextran-Texas Red (TR), 70kDa | Invitrogen | D1830 | imaging agent for injection |
Eye cannula, blunt end , 25 G | BVI Visitec/BD | BD585107 | custom made from Tapered Hydrode lineator [Blumenthal], dimensions: 0.5 x 22mm (25G x 7/8in) (45?), tip tapered to 30 G (0.3mm) |
Eye gel | Novartis | Viscotears, contains Carbomer 2 mg/g | |
Hamilton syringe 0.5 ml, Model 1750 TPLT | Hamilton | 81242 | Plunger type gas-tight syringe for islet injection |
Head holder | |||
-Head holding adapter | Narishige | SG-4N-S | assemled onto metal plate |
-gas mask | Narishige | GM-4-S | |
-UST-2 Solid Universal Joint | Narishige | UST-2 | assemled onto metal plate |
-custom made metal plate for head-holder assembly | |||
-Dumont #5, straight | Agnthos | 0207-5TI-PS or 0208-5-PS | attached to UST-2 (custom made) |
Heating pad, custom made | taped to the stereotaxic platform | ||
Human islet culture media | |||
-CMRL 1066 | ICN Biomedicals | cell culture media for human islets | |
-HEPES | GIBCO BRL | ||
-L-glutamin | GIBCO BRL | ||
-Gentamycin | GIBCO BRL | ||
-Fungizone | GIBCO BRL | ||
-Ciproxfloxacin | Bayer healthcare AG | ||
-Nicotinamide | Sigma | ||
Image analysis software | Bitplane | Imaris 9 | |
Image Aquisition software | Zeiss | ZEN 2010 | |
Infrared lamp | VWR | 1010364937 | used to keep animals warm in the wake-up cage |
Isoflurane Isoflo | Abott Scandinavia/Apotek | fluid, for anesthesia | |
Needle 25 G (0.5 x 16mm), orange | BD | 10442204 | used as scalpel |
Petri dishes, 90mm | VWR | 391-0440 | |
2-Photon/confocal microscope | |||
-LSM7 MP upright microscope | Zeiss | ||
-Ti:Sapphire laser Tsunami | Spectra-Physics, Mai Tai | ||
-long distance water-dipping lens 20x/NA1.0 | Zeiss | ||
-ET710/40m (Angiosense 680) | Chroma | 288003 | |
-ET645/65m-2p (TR) | Chroma | NC528423 | |
-ET525/50 (GFP) | Chroma | ||
-ET610/75 (tomato) | Chroma | ||
-main beam splitter T680lpxxr | Chroma | T680lpxxr | Dichroic mirror to transmit 690 nm and above and reflect 440 to 650 nm size 25.5 x 36 x 1 mm |
Polythene tubing (0.38mm ID, 1.09 mm OD) | Smiths Medical Danmark | 800/100/120 | to connect with Hamilton syringe and eye canula |
Stereomicroscope | Nikon | Model SMZ645, for islet picking | |
Stereomicroscope (Flourescence) | for islet graft imaging | ||
-AZ100 Multizoom | Nikon | wide field and long distance | |
-AZ Plan Apo 1x | Nikon | ||
-AZ Plan Apo 4x | Nikon | ||
-AZ-FL Epiflourescence with C-LHGFI HG lamp | Nikon | ||
-HG Manual New Intensilight | Nikon | ||
-Epi-FL Filter Block TEXAS RED | Nikon | contains EX540-580, DM595 and BA600-660 | |
-Epi-FL Filter Block G-2A | Nikon | (EX510-560, DM575 and BA590) | |
-Epi-FL Filter Block B-2A | Nikon | (EX450-490, DM505 and BA520) | |
-DS-Fi1 Colour Digital Camera (5MP) | Nikon | ||
Syringe 1-ml, Omnitix | Braun | 9161406V | for Buprenorphine injection, used with 27 G needle |
Surgical tape | 3M |
References
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