بروتوكول محسن لتنقية ومباشرة أحادية الحيوية المؤتلف BDNF في أنبوب لدراسات الاتجار الخلوي في الخلايا العصبية
Summary
يتم إنتاج BDNF المؤتلف الذي يحتوي على تسلسل Avi (BDNFAvi) في خلايا HEK293 بطريقة فعالة من حيث التكلفة ويتم تنقيته بواسطة الكروماتوغرافيا المتقاربة. ثم BDNFavi هو مباشرة أحادية الحيوية مع إنزيم BirA في أنبوب. يحتفظ BDNFavi و BDNFavi أحادية الفينيل البيولوجية بنشاطهم البيولوجي عند مقارنتها بـ BDNF المتوفرة تجاريًا.
Abstract
يتم إنتاج BDNF المؤتلفة التي تحتوي على تسلسل Avi (BDNFAvi) في خلايا HEK293 ثم تنقيتها بفعالية من حيث التكلفة بواسطة الكروماتوغرافيا التقاربية. تم تطوير بروتوكول قابل للاستنساخ مباشرة أحادية أحادية BDNFAvi مع إنزيم BirA في أنبوب. في هذا التفاعل، يحتفظ BDNFAvi أحادية الحيوية بنشاطه البيولوجي.
تعتبر المغذيات العصبية عوامل نمو مشتقة من الأهداف تلعب دورًا في تطوير الخلايا العصبية وصيانتها. وهي تتطلب آليات نقل سريعة على طول المسار الداخلي للسماح بالإشارة لمسافات طويلة بين مقصورات الخلايا العصبية المختلفة. وقد مكن تطوير الأدوات الجزيئية لدراسة الاتجار بالعقاقير العصبية من التتبع الدقيق لهذه البروتينات في الخلية باستخدام في تسجيل الجسم الحي. في هذا البروتوكول، قمنا بتطوير إجراء الأمثل وفعالة من حيث التكلفة لإنتاج BDNF أحادية الحيوية. يتم إنتاج متغير BDNF المؤتلف الذي يحتوي على تسلسل أفيين قابل لاتينيلية (BDNFAvi) في خلايا HEK293 في نطاق ميكروغرام ثم تنقيته في إجراء قابل للتطوير بسهولة باستخدام الكروماتوغرافيا التقارب. ويمكن بعد ذلك تنقية BDNF تكون monotinylated متجانسة من خلال رد فعل مباشرة في المختبر مع انزيم BirA في أنبوب. يمكن أن يكون النشاط البيولوجي لBDNF أحادية الحيوية (mbtBDNF) مترافقة إلى streptavidin-الاقتران مع مختلف الفلوروفوريس. تحتفظ BDNFAvi و mbtBDNF بنشاطهما البيولوجي الذي تم إثباته من خلال الكشف عن الأهداف الفوسفورية المصبّعة باستخدام البقع الغربية وتفعيل عامل النسخ CREB على التوالي. باستخدام نقاط الكم streptavidin، كنا قادرين على تصور ميغابايتBDNF استيعابية بالتزامن مع تفعيل CREB، الذي تم الكشف عنه مع جسم مضاد محدد فوسفو-كريب. بالإضافة إلى ذلك ، mbtBDNF مترافق إلى نقاط الكم streptavidin كانت مناسبة لتحليل النقل الرجعي في الخلايا العصبية القشرية التي تزرع في غرف microfluidic. وهكذا، في أنبوب إنتاج mbtBDNF هو أداة موثوقة لدراسة الفسيولوجية الإشارات ديناميات endosome والاتجار في الخلايا العصبية.
Introduction
الخلايا العصبية هي الوحدات الوظيفية للجهاز العصبي التي تمتلك مورفولوجيا معقدة ومتخصصة تسمح بالاتصال المتشابك ، وبالتالي ، فإن توليد السلوك المنسق والمعقد استجابة للمحفزات المتنوعة. الإسقاطات العصبية مثل dendrites والمحاور هي السمات الهيكلية الحرجة المشاركة في الاتصالات العصبية، وs neurotrophins هي اللاعبين الحاسمة في تحديد مورفولوجيا ودالة1. المغذيات العصبية هي عائلة من عوامل النمو المفرزة التي تشمل NGF، NT-3، NT-4، وعامل التغذية العصبية المستمدة من الدماغ (BDNF)2. في الجهاز العصبي المركزي (CNS) ، تشارك BDNF في عمليات بيولوجية متنوعة بما في ذلك نقل الأعصاب ، التشجير ، نضوج العمود الفقري المتجني ، التقوية على المدى الطويل ، من بين أمور أخرى3،4. لذلك، BDNF يلعب دورا حاسما في تنظيم وظيفة الخلايا العصبية.
عمليات الخلوية المتنوعة تنظم ديناميات BDNF ووظيفته. على سطح الخلايا العصبية, BDNF يربط مستقبلات التروبوميوسين كيناز B (TrkB) و / أو مستقبلات المغذيات العصبية P75 (p75). يتم endocytosed BDNF-TrkB و BDNF-p75 complexs وفرزها في مختلف العضيات endocytic5,6,7,8. مطلوب الاتجار الصحيح داخل الخلايا من مجمع BDNF / TrkB لإشارات BDNF المناسبة في دوائر الخلايا العصبية المختلفة9,10,11. ولهذا السبب، فإن الفهم العميق لديناميات الاتجار بـ BDNF وتعديلاتها الموجودة في العمليات الفيزيولوجية المرضية أمر ضروري لفهم إشارات BDNF في الصحة والمرض. وسيساعد تطوير أدوات جزيئية جديدة ومحددة لرصد هذه العملية على دفع هذا المجال إلى الأمام والسماح بفهم أفضل للآليات التنظيمية المعنية.
هناك العديد من الأدوات المتاحة لدراسة الاتجار BDNF في الخلايا العصبية. تتضمن المنهجية الشائعة الاستخدام انتقال BDNF المؤتلف الموسومة بجزيئات الفلورسنت مثل البروتين الفلوري الأخضر (GFP) أو البديل أحادي الميل الفلوري الأحمر المتحول من GFP mCherry12،13. ومع ذلك، عيب كبير من إفراط BDNF هو أنه يلغي إمكانية تقديم تركيزات معروفة من هذا neurotrophin. أيضا، قد يؤدي إلى السمية الخلوية، الغموض تفسير النتائج14. استراتيجية بديلة هي transfection من TrkB الموسومة epitope، مثل العلم-TrkB. هذه المنهجية تسمح لدراسة TrkB ديناميات استيعاب15، لكنه ينطوي أيضا على transfection ، والتي قد تؤدي إلى تغيير وظيفة TrkB والسمية الخلوية. للتغلب على هذه العقبات المنهجية، تم تطوير المتغيرات المؤتلفة من NGF و BDNF التي تحتوي على تسلسل Avi (BDNFAvi)، والتي يمكن أن تكون أحادية البيوتينات بواسطة إنزيم بييرا ثنائيات البيوتين،16،17. يمكن أن يقترن BDNF المؤتلفة من الاقتران مع أدوات مختلفة مرتبطة بالسنتبيدين ، والتي تشمل الفلوروفهورات والخرز والجسيمات النانوية شبه المغناطيسية وغيرها للكشف عنها. من حيث التصوير الخلايا الحية، أصبحت النقاط الكمومية (QD) تستخدم كثيرا fluorophores، كما لديهم خصائص مرغوب فيه لتتبع الجسيمات المفردة، مثل زيادة السطوع ومقاومة لphotobleaching بالمقارنة مع الفلوروفوريس جزيء صغير18.
وقد تم إنتاج ثنائيات أحادية BDNF (mbtBDNF) باستخدام BDNFAvi عن طريق co-transfection من plasmids القيادة التعبير عن BDNFAvi وبيرا، تليها تنقية البروتين المؤتلف عن طريق الكروماتوغرافيا تقارب مع غلة 1-2 ميكروغرام من BDNF لكل 20 مل من HEK293 وسائل الإعلام ثقافة مكيفة17. هنا، نقترح تعديل هذا البروتوكول الذي يسمح لتنقية BDNFAvi من 500 مل من وسائل الإعلام HEK293 مكيفة، والتي تسعى إلى تحقيق أقصى قدر من الانتعاش البروتين في بروتوكول قائم على عمود الكروماتوغرافيا لسهولة التلاعب. وكيل transfection المستخدمة، البولي ايثيلينمين (PEI)، يضمن طريقة فعالة من حيث التكلفة دون التضحية العائد transfection. وقد تم تكييف خطوة أحادية ثنائي الفينيل إلى تفاعل في المختبر لتجنب المضاعفات المرتبطة بالانباتات المشتركة ولضمان وضع علامات متجانسة من BDNF. وقد تجلى النشاط البيولوجي لـ mbtBDNF من خلال تجارب المجهر لطخة الغربية وفلوريسنس، بما في ذلك تنشيط pCREB والتصوير الحي للخلايا لدراسة النقل المحوري الرجعي لـ BDNF في الغرف الدقيقة الفلورية. استخدام هذا البروتوكول يسمح للإنتاج الأمثل، عالية الإنتاجية من متجانسة أحادية الحيوية و BDNF النشطة بيولوجيا.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه المقالة، يتم وصف منهجية الأمثل لإنتاج وتنقية mbtBDNF في إجراء قائم على اللونية تقارب، استنادا إلى عمل سونغ والمتعاونين17. وتشمل التحسينات استخدام كاشف نقل فعال من حيث التكلفة (PEI) مع الحفاظ على كفاءة أساليب نقل أكثر تكلفة مثل الدهون. ويترجم هذا التحسين إلى تخفيض كبير في تكلف…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب الاعتراف بامتنان الدعم المالي من Fondecyt (1171137) (FCB) ، ومركز القاعدية للتميز في العلوم والتكنولوجيا (AFB 170005) (FCB) ، Millenium – Nucleus (AFB 170005) ، ميلينيوم – نيوكليوس (AFB) P07/011-F( FCB)، وجائزة ويلكوم تراست لكبار المحققين (107116/Z/15/Z) (GS) وجائزة مؤسسة معهد بحوث الخرف في المملكة المتحدة (GS). وقد دعم هذا العمل اتحاد الميكروسكوبيا أفانزادا UC .
Materials
| 2 way stopcock | BioRad | 7328102 | Chromatography apparatus component |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | BDNF elution buffer |
| Acrylamide/Bisacrylamide | BioRad | 1610154 | SDS-PAGE gel preparation |
| Amicon Ultra-15 10K | Millipore | UFC901024 | BDNF concentration |
| Ammonium Persulfate | Sigma | A9164 | SDS-PAGE gel preparation |
| anti B-III-Tubulin antibody | Sigma | T8578 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti BDNF antibody | Alomone | AGP-021 | Western blot assays for BDNF quantification |
| anti BDNF antibody | Alomone | ANT-010 | Western blot assays for BDNF quantification |
| Anti ERK antibody | Cell Signaling | 9102 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti pCREB antibody (S133) | Cell Signaling | 9198 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti pERK antibody (T202, Y204) | Cell Signaling | 4370 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti pTrkB antibody (Y515) | Abcam | ab109684 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| Antibiotic/Antimycotic | Gibco | 15240-062 | HEK293 maintenance |
| ATP | Sigma | A26209 | BDNF monobiotinylation buffer |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504-044 | Neuron maintenance |
| Bicine | Sigma | B3876 | BDNF monobiotinylation buffer |
| BirA-GST | BPS Bioscience | 70031 | Enzyme for BDNF AviTag monobiotinylation |
| Bovine Fetal Serum | HyClone | HC.SH30396.02 | HEK293 maintenance |
| Bovine Serum Albumin | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | BDNF buffer modification component, blocking buffer for western blot and immunofluorescence |
| D-Biotin | Sigma | B4639 | BDNF monobiotinylation buffer |
| Dithiothreitol | Invitrogen | 15508-013 | |
| DMEM High Glucose Medium | Gibco | 11965-092 | Neuron seeding |
| DMEM Medium | Gibco | 11995-081 | HEK293 maintenance |
| Econo Column Funnel | BioRad | 7310003 | Chromatography apparatus component |
| EDTA | Merck | 108418 | |
| EZ-ECL Kit | Biological Industries | 1633664 | Protein detection by western blotting |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | Neuron and HEK293 maintenance |
| Glycerol | Merck | 104094 | BDNF elution buffer, lysis buffer for western blot assays |
| Hettich Rotina 46R Centrifuge | Hettich | Discontinued | Centrifuge used for clearing the medium of debris |
| Hettich Universal 32R Centrifuge | Hettich | Discontinued | Centrifuge used for protein concentrator centrifugation |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | Neuron seeding |
| ImageQuant LAS 500 | GE Healthcare Life Sciences | 29005063 | Western blot image acquisition |
| Imidazole | Sigma | I55513 | BDNF buffer modification component |
| KCl | Winkler | BM-1370 | PBS component |
| KH2PO4 | Merck | 104873 | PBS component |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | Cover coating for compartmentalized neurons |
| Luer Tubing Adaptor | BioRad | 7323245 | Chromatography apparatus component |
| Luminata™ Forte Western HRP Substrate | Millipore | WBLUF0100 | Protein detection by western blotting |
| Mg(CH3COO)2 | Merck | 105819 | BDNF monobiotinylation buffer |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | Mounting reagent for immunofluorescence assays |
| MyOne C1 Streptavidin Magnetic Beads | Invitrogen | 65001 | Biotinylation verification |
| Na2HPO4 | Merck | 106586 | BDNF buffer modification component |
| NaCl | Winkler | BM-1630 | PBS component, BDNF buffer modification component |
| NaH2PO4 | Merck | 106346 | BDNF buffer modification component |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | Neuron maintenance |
| Ni-NTA Agarose Beads | Qiagen | 30210 | BDNF AviTag purification |
| Nikon Ti2-E | Nikon | Microscope for fluorescence imaging | |
| Nitrocellulose Membrane | BioRad | 1620115 | Protein transfer for western blotting |
| ORCA-Flash4.0 V3 Digital CMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | Camera for epifluorescence imaging |
| P8340 Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | P8340 | BDNF buffer modification component |
| Paraformaldehyde | Merck | 104005 | Fixative for immunofluorescence assays |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Neuron maintenance |
| Poli-D-Lysine | Corning | DLW354210 | Cover coating for compartmentalized neurons |
| Poli-L-Lysine | Millipore | P2363 | Cover coating for non-compartmentalized neurons |
| Poly-Prep Chromatography Column | BioRad | 7311550 | Chromatography apparatus component |
| Polyethyleneimine 25K | Polysciences Inc. | PLY-0296 | HEK293 transfection |
| Quantum Dots 655 streptavidin conjugate | Invitrogen | Q10121MP | Monobiotinylated BDNF AviTag label for live and fixed cell experiments |
| Saponin | Sigma | S4521 | Detergent for immunofluorescence assays |
| Sucrose | Merck | 107687 | |
| Syldgard 184 silicone elastomer base | Poirot | 4019862 | Microfluidic chamber preparation |
| TEMED | Sigma | T9281 | SDS-PAGE gel preparation |
| Tris | Winkler | BM-2000 | Lysis buffer component |
| Triton X100 | Merck | 108603 | Cell permeabilization in immunofluorescence and western blot assays |
| Trypsin-EDTA 0.5% | Gibco | 15400-054 | HEK293 passaging |
References
- Huang, E., Reichardt, L. Neurotrophins: Roles in Neuronal Development and Function. Annual Review of Neuroscience. 24, 677-736 (2001).
- Skaper, S. D. The neurotrophin family of neurotrophic factors: an overview. Methods in Mollecular Biology. 846, 1-12 (2012).
- Gonzalez, A., Moya-Alvarado, G., Gonzalez-Billault, C., Bronfman, F. C. Cellular and molecular mechanism regulating neuronal growth by brain-derived neurotrophic factor. Cytoskeleton. 73 (10), 612-628 (2016).
- Cunha, C., Brambilla, R., Thomas, K. A simple role for BDNF in learning and memory. Frontiers in Mollecular Neuroscience. 3, 1 (2010).
- Bronfman, F. C., Lazo, O. M., Flores, C., Escudero, C. A., Lewin, G., Carter, B. Spatiotemporal intracelular dynamics of neurotrophin and its receptors. Implications for neurotrophin signaling and neuronal function. Neurotrophic Factor. Handbook of Experimental Pharmacology. 220, (2014).
- Ascano, M., Bodmer, D., Kuruvilla, R. Endocytic trafficking of neurotrophins in neural development. Trends in Cell Biology. 22 (5), 266-273 (2012).
- Deinhardt, K., Salinas, S., Verastegui, C., Watson, R., Worth, D., Hanrahan, S., Bucci, C., Schiavo, G. Rab5 and Rab7 control endocytic sorting along the axonal retrograde transport pathway. Neuron. 52 (2), 293 (2006).
- Escudero, C. A., et al. c-Jun N-terminal kinase (JNK)-dependent internalization and Rab5-dependent endocytic sorting medaited long-distance retrograde neuronal death induced by axonal BDNF-p75 signaling. Scientific Reports. 9, 6070 (2019).
- Vrabec, J. P., Levin, L. A. The neurobiology of cell death in glaucoma. Eye. 21, 11-14 (2007).
- Liot, G., Zala, D., Pla, P., Mottet, G., Piel, M., Saudou, F. Mutant huntingtin alters retrograde transport of TrkB receptors in striatal dendrites. Journal of Neuroscience. 33 (15), 6298-6309 (2013).
- Zhou, B., Cai, Q., Xie, Y., Sheng, Z. H. Snapin recruits dynein to BDNF-TrkB signaling endosomes for retrograde axonal transport and is essential for dendrite growth of cortical neurons. Cell Reports. 2 (1), 42-51 (2012).
- Haubensak, W., Narz, F., Heumann, R., Lessmann, V. BDNF-GFP containing secretory granules are localized in the vicinity of synaptic junctions of cultured cortical neurons. Journal of Cell Science. 111 (11), 1483-1493 (1998).
- Adachi, N., et al. Glucocorticoid affects dendritic transport of BDNF-containing vesicles. Scientific Reports. 5, 12684 (2015).
- Biocompare: The Buyer’s Guide for Life Scientists. Mirus Bio. Cellular Toxicity Caused by Transfection: Why is it important Available from: https://www.biocompare.com/Bench-Tips/121111-Cellular-Toxicity-Caused-by-Transfection-Why-is-it-important/ (2012)
- Zhao, L., et al. Mechanism underlying activity-dependent insertion of TrkB into the neuronal surface. Journal of Cell Science. 122 (17), 3123-3136 (2009).
- Zhao, X., Zhou, Y., Weissmiller, A., Pearn, M., Mobley, W., Wu, C. Real-time imaging of axonal transport of quantum dot-labeled BDNF in primary neurons. Journal of Visualized Experiments. 91, 51899 (2014).
- Sung, K., Maloney, M., Yang, J., Wu, C. A novel method for producing mono-biotinylated, biologically active neurotrophic factors: an essential reagent for single molecule study of axonal transport. Journal of Neuroscience Methods. 200 (2), 121-128 (2011).
- Deerinck, T. The application of fluorescent quantum dots to confocal, multiphoton and electron microscopic imaging. Toxicologic Pathology. 36 (1), 112-116 (2008).
- Unsain, N., Nuñez, N., Anastasia, A., Mascó, D. H. Status epilepticus induces a TrkB to p75 neurotrophin receptor switch and increases brain-derived neurotrophic factor interaction with p75 neurotrophon receptor: an initial event in neuronal injury induction. Neuroscience. 154 (3), 978-993 (2008).
- Walker, J. M. The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation. Methods Mol Biol. 32, 5-8 (1994).
- Moya-Alvarado, G., Gonzalez, A., Stuardo, N., Bronfman, F. C. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) regulates Rab5-positive early endosomes in hippocampal neurons to induce dendritic branching. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 493 (2018).
- Sasi, M., Vignoli, B., Canossa, M., Blum, R. Neurobiology of local and intercellular BDNF signaling. Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 469 (5), 593-610 (2017).
- . The Rab5-Rab11 endosomal pathway is required for BDNF-induced CREB transcriptional regulation in neurons Available from: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/844720v1 (2019)
- Mowla, , et al. Biosynthesis and post-translational processing of the precursor to brain-derived neurotrophic factor. Journal of Biological Chemistry. 276 (16), 12660-12666 (2001).
- Longo, P., Kavran, J., Kim, M. S., Leahy, D. Transient Mammalian Cell Transfection with Polyethyleneimine (PEI). Methods in Enzymology. 529, 227-240 (2013).
- Raymond, C., Tom, R., Perret, S., Moussouami, P., L’Abbé, D., St-Laurent, G., Durocher, Y. A simplified polyethyleneimine-mediated transfection process for large-scale and high-throughput applications. Methods. 55 (1), 44-51 (2011).
- Dalton, A., Barton, W. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Science. 23 (5), 517-525 (2014).
- Hunter, M., Yuan, P., Vavilala, D., Fox, M. Optimization of protein expression in mammalian cells. Current Protocols in Protein Science. 95 (1), 77 (2019).
- Stepanenko, A. A., Heng, H. H. Transient and stable vector transfection: Pitfalls, off-target effects, artifacts. Mutation Research. 773, 91-103 (2017).
- Guerzoni, L. P., Nicolas, V., Angelova, A. In vitro modulation of TrkB receptor signaling upon sequential delivery of curcumin-DHA loaded carriers towards promoting neuronal survival. Pharmaceutical Research. 34 (2), 492-505 (2017).
- Angelova, A., Angelov, B. Dual and multi-drug delivery nanoparticles towards neuronal survival and synaptic repair. Neural Regeneration Research. 12 (6), 886-889 (2017).
