Nöronlarda Hücresel İnsan Ticareti Çalışmaları Için Bir Tüpte Doğrudan Mono-Biyotinylate Rekombinant BDNF'yi Arındırmak ve Doğrudan Bir Protokol
Summary
Avi dizisi (BDNFAvi) içeren rekombinant BDNF, HEK293 hücrelerinde uygun maliyetli bir şekilde üretilir ve afinite kromatografisi ile saflaştırılır. BDNFavi daha sonra doğrudan mono-biyotinylated enzim BirA ile bir tüp içinde. BDNFavi ve mono-biyotinylated BDNFavi ticari olarak kullanılabilir BDNF ile karşılaştırıldığında kendi biyolojik aktivitelerini korumak.
Abstract
Avi dizisi (BDNFAvi) içeren rekombinant BDNF HEK293 hücrelerinde üretilir ve daha sonra afinite kromatografisi ile uygun maliyetli bir şekilde saflaştırılır. Bir tüpte BirA enzimi ile Doğrudan mono-biyotinylate BDNFAvi için tekrarlanabilir bir protokol geliştirilmiştir. Bu reaksiyonda, mono-biyotinylated BDNFAvi biyolojik aktivitesini korur.
Nörotrofinler nöronal gelişim ve bakımda rol oynayan hedef kaynaklı büyüme faktörleridir. Onlar farklı nöronal bölmeleri arasında uzun mesafe sinyal izin vermek için endositik yol boyunca hızlı taşıma mekanizmaları gerektirir. Nörotrofin lerin ticaretini incelemek için moleküler araçların geliştirilmesi, in vivo kayıt kullanarak hücredeki bu proteinlerin kesin olarak izlenmesini sağlamıştır. Bu protokolde, mono-biyotinylated BDNF üretimi için optimize edilmiş ve uygun maliyetli bir prosedür geliştirdik. Biyotentojen avi dizisi (BDNFAvi) içeren bir rekombinant BDNF varyantı mikrogram aralığındaki HEK293 hücrelerinde üretilir ve daha sonra afinite kromatografisi kullanılarak kolayca ölçeklenebilir bir işlemle saflaştırılır. Saflaştırılmış BDNF daha sonra homojen bir tüp içinde enzim BirA ile doğrudan in vitro reaksiyon ile mono-biyotinylated olabilir. Mono-biyotinylated BDNF biyolojik aktivitesi (mbtBDNF) farklı floroforlara streptavidin-konjuge konjuge olabilir. BDNFAvi ve mbtBDNF, sırasıyla batı blotunu kullanarak aşağı fosforile hedeflerin tespiti ve transkripsiyon faktörü CREB’nin aktivasyonu yoluyla gösterdikleri biyolojik aktivitelerini korumaktadırlar. Streptavidin-kuantum noktalarını kullanarak, fosfo-CREB spesifik antikor ile tespit edilen CREB aktivasyonu ile birlikte mbtBDNF içselleştirmeyi görselleştirebildik. Buna ek olarak, kontrtavidin-kuantum noktalarına konjuge mbtBDNF mikroakışkan odalarda yetişen kortikal nöronlarda retrograd taşıma analizi için uygundu. Bu nedenle, tüp üretilen mbtBDNF fizyolojik sinyal endozom dinamikleri ve nöronlarda ticareti incelemek için güvenilir bir araçtır.
Introduction
Nöronlar sinaptik iletişim sağlayan karmaşık ve özel morfolojisahip sinir sisteminin fonksiyonel birimleri, ve böylece, çeşitli uyaranlara yanıt olarak koordine ve karmaşık davranış nesil. Dendritler ve aksonlar gibi nöronal projeksiyonlar nöronal iletişimde yer alan kritik yapısal özelliklerdir ve nörotrofinler morfolojilerini ve fonksiyonlarını belirlemede önemli oyunculardır1. Nörotrofinler NGF, NT-3, NT-4 ve beyin kaynaklı nörotrofik faktör (BDNF)2dahil salgılanan büyüme faktörleri bir ailedir. Merkezi sinir sisteminde (CNS), BDNF nörotransmisyon, dendritik arborization, dendritik dikenlerin olgunlaşması, uzun vadeli potentiation, diğerleri arasında 3 dahil olmak üzere çeşitli biyolojik süreçlere katılır3,4. Bu nedenle, BDNF nöronal fonksiyonudüzenleyen kritik bir rol oynar.
Farklı hücresel süreçler BDNF dinamiklerini ve işlevini düzenler. Nöronal yüzeyde, BDNF tropomiyozin reseptörü kiazaz B (TrkB) ve / veya p75 nörotrofin reseptörü (p75) bağlanır. BDNF-TrkB ve BDNF-p75 kompleksleri endositonve farklı endositik organeller5,6,6,7,8sıralanır. Farklı nöronal devrelerde uygun BDNF sinyalizasyonu için BDNF/TrkB kompleksinin doğru hücre içi ticareti9,10,11′dir. Bu nedenle, BDNF kaçakçılık dinamiklerinin ve patofizyolojik süreçlerde bulunan değişikliklerin derinlemesine anlaşılması, sağlık ve hastalıkta BDNF sinyalinin anlaşılması esastır. Bu süreci izlemek için yeni ve özel moleküler araçların geliştirilmesi bu alanın ilerlemesine yardımcı olacak ve ilgili düzenleyici mekanizmaların daha iyi kavranmasını sağlayacaktır.
Nöronlarda BDNF ticareti çalışmaları için çeşitli araçlar mevcuttur. Yaygın olarak kullanılan bir metodoloji, yeşil floresan protein (GFP) veya GFP mCherry12monomerikfloresan kırmızı-shifted varyantı gibi floresan molekülleri ile etiketlenmiş rekombinant BDNF transfeksiyon içerir ,13. Ancak, BDNF aşırı ekspresyon önemli bir eksiklik bu nörotrofin bilinen konsantrasyonları teslim olasılığını ortadan kaldırır olmasıdır. Ayrıca, hücresel toksisite neden olabilir, sonuçların yorumlanması gizleme14. Alternatif bir strateji flag-TrkB gibi epitop etiketli TrkB, transfeksiyon olduğunu. Bu metodoloji TrkB içselleştirme dinamiklerinin incelenmesine izin verir15, ama aynı zamanda transfeksiyon içerir, hangi değişmiş TrkB fonksiyonu ve hücresel toksisite neden olabilir. Bu metodolojik engelleri aşmak için, biotin-ligaz enzimi BirA tarafından mono-biyotinylated olabilir bir Avi dizisi (BDNFAvi) içeren NGF ve BDNF rekombinant varyantları geliştirilmiştir16,17. Biyotinylated rekombinant BDNF farklı streptavidin bağlı araçlar, hangi floroforlar dahil birleştiğinde olabilir, boncuklar, algılama için diğerleri arasında paramanyetik nano tanecikleri. Canlı hücre görüntüleme açısından, kuantum nokta (QD) sık kullanılan floroforlar haline gelmiştir, onlar tek parçacık izleme için arzu özellikleri var gibi, küçük molekül floroforlar ile karşılaştırıldığında artan parlaklık ve fotobeyazrlama direnci gibi18.
Mono-biyotinylated BDNF üretimi (mbtBDNF) BDNFAvi kullanarak plazmidlerin co-transfection BDNFAvi ve BirA ifade sürüş elde edilmiştir, affinet kromatografi si ile rekombinant protein saflaştırma takip 20 mL başına BDNF 20 mL HEK293-koşullu kültür medya17. Burada, manipülasyon kolaylığı için kromatografi sütununa dayalı bir protokolde protein iyileşmesini en üst düzeye çıkarmayı amaçlayan 500 mL HEK293 şartlı ortamdan BDNFAvi arınmasını sağlayan bu protokolün bir modifikasyonunu öneriyoruz. Kullanılan transfeksiyon maddesi olan polietilenin (PEI), transfeksiyon veriminden ödün vermeden uygun maliyetli bir yöntem sağlar. Mono-biyotinylasyon adımı, ko-transfeksiyonlarla ilişkili komplikasyonları önlemek ve BDNF’nin homojen etiketlemesini sağlamak için in vitro reaksiyona uyarlanmıştır. MbtBDNF’nin biyolojik aktivitesi batı leke ve floresan mikroskopi deneyleri ile gösterilmiştir, pCREB aktivasyonu ve canlı hücre görüntülemesi de dahil olmak üzere mikroakışkan odalarda BDNF’nin retrograd aksonal naklini incelemek için. Bu protokolün kullanımı homojen mono-biyotinylated ve biyolojik olarak aktif BDNF optimize, yüksek verimli üretim sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu makalede, sung veişbirlikçilerininçalışmalarına dayalı olarak mbtBDNF’nin bir yakınlık kromatografisi tabanlı prosedüründe üretimi ve arınması için optimize edilmiş bir metodoloji tanımlanmıştır. Optimizasyonlar, lipofektamin gibi daha pahalı transfeksiyon yöntemlerinin verimliliğini korurken uygun maliyetli bir transfeksiyon reaktifi (PEI) kullanımını içerir. Bu optimizasyon, yüksek maliyet etkinliğini korurken ölçeklenebilirlik sağlayan protokolde önemli bir …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar fondecyt (1171137) (FCB), Bazal Center of Excellence in Science and Technology (AFB 170005) (FCB), Millenium-Nucleus (P07/011-F) (FCB), Wellcome Trust Senior Investigator Award (107116/Z/15/Z) (GS) ve İngiltere Araştırma Enstitüsü (GS) tarafından mali destek kabul eder. Bu çalışma Unidad de Microscopía Avanzada UC (UMA UC) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 2 way stopcock | BioRad | 7328102 | Chromatography apparatus component |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | BDNF elution buffer |
| Acrylamide/Bisacrylamide | BioRad | 1610154 | SDS-PAGE gel preparation |
| Amicon Ultra-15 10K | Millipore | UFC901024 | BDNF concentration |
| Ammonium Persulfate | Sigma | A9164 | SDS-PAGE gel preparation |
| anti B-III-Tubulin antibody | Sigma | T8578 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti BDNF antibody | Alomone | AGP-021 | Western blot assays for BDNF quantification |
| anti BDNF antibody | Alomone | ANT-010 | Western blot assays for BDNF quantification |
| Anti ERK antibody | Cell Signaling | 9102 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti pCREB antibody (S133) | Cell Signaling | 9198 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti pERK antibody (T202, Y204) | Cell Signaling | 4370 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti pTrkB antibody (Y515) | Abcam | ab109684 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| Antibiotic/Antimycotic | Gibco | 15240-062 | HEK293 maintenance |
| ATP | Sigma | A26209 | BDNF monobiotinylation buffer |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504-044 | Neuron maintenance |
| Bicine | Sigma | B3876 | BDNF monobiotinylation buffer |
| BirA-GST | BPS Bioscience | 70031 | Enzyme for BDNF AviTag monobiotinylation |
| Bovine Fetal Serum | HyClone | HC.SH30396.02 | HEK293 maintenance |
| Bovine Serum Albumin | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | BDNF buffer modification component, blocking buffer for western blot and immunofluorescence |
| D-Biotin | Sigma | B4639 | BDNF monobiotinylation buffer |
| Dithiothreitol | Invitrogen | 15508-013 | |
| DMEM High Glucose Medium | Gibco | 11965-092 | Neuron seeding |
| DMEM Medium | Gibco | 11995-081 | HEK293 maintenance |
| Econo Column Funnel | BioRad | 7310003 | Chromatography apparatus component |
| EDTA | Merck | 108418 | |
| EZ-ECL Kit | Biological Industries | 1633664 | Protein detection by western blotting |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | Neuron and HEK293 maintenance |
| Glycerol | Merck | 104094 | BDNF elution buffer, lysis buffer for western blot assays |
| Hettich Rotina 46R Centrifuge | Hettich | Discontinued | Centrifuge used for clearing the medium of debris |
| Hettich Universal 32R Centrifuge | Hettich | Discontinued | Centrifuge used for protein concentrator centrifugation |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | Neuron seeding |
| ImageQuant LAS 500 | GE Healthcare Life Sciences | 29005063 | Western blot image acquisition |
| Imidazole | Sigma | I55513 | BDNF buffer modification component |
| KCl | Winkler | BM-1370 | PBS component |
| KH2PO4 | Merck | 104873 | PBS component |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | Cover coating for compartmentalized neurons |
| Luer Tubing Adaptor | BioRad | 7323245 | Chromatography apparatus component |
| Luminata™ Forte Western HRP Substrate | Millipore | WBLUF0100 | Protein detection by western blotting |
| Mg(CH3COO)2 | Merck | 105819 | BDNF monobiotinylation buffer |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | Mounting reagent for immunofluorescence assays |
| MyOne C1 Streptavidin Magnetic Beads | Invitrogen | 65001 | Biotinylation verification |
| Na2HPO4 | Merck | 106586 | BDNF buffer modification component |
| NaCl | Winkler | BM-1630 | PBS component, BDNF buffer modification component |
| NaH2PO4 | Merck | 106346 | BDNF buffer modification component |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | Neuron maintenance |
| Ni-NTA Agarose Beads | Qiagen | 30210 | BDNF AviTag purification |
| Nikon Ti2-E | Nikon | Microscope for fluorescence imaging | |
| Nitrocellulose Membrane | BioRad | 1620115 | Protein transfer for western blotting |
| ORCA-Flash4.0 V3 Digital CMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | Camera for epifluorescence imaging |
| P8340 Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | P8340 | BDNF buffer modification component |
| Paraformaldehyde | Merck | 104005 | Fixative for immunofluorescence assays |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Neuron maintenance |
| Poli-D-Lysine | Corning | DLW354210 | Cover coating for compartmentalized neurons |
| Poli-L-Lysine | Millipore | P2363 | Cover coating for non-compartmentalized neurons |
| Poly-Prep Chromatography Column | BioRad | 7311550 | Chromatography apparatus component |
| Polyethyleneimine 25K | Polysciences Inc. | PLY-0296 | HEK293 transfection |
| Quantum Dots 655 streptavidin conjugate | Invitrogen | Q10121MP | Monobiotinylated BDNF AviTag label for live and fixed cell experiments |
| Saponin | Sigma | S4521 | Detergent for immunofluorescence assays |
| Sucrose | Merck | 107687 | |
| Syldgard 184 silicone elastomer base | Poirot | 4019862 | Microfluidic chamber preparation |
| TEMED | Sigma | T9281 | SDS-PAGE gel preparation |
| Tris | Winkler | BM-2000 | Lysis buffer component |
| Triton X100 | Merck | 108603 | Cell permeabilization in immunofluorescence and western blot assays |
| Trypsin-EDTA 0.5% | Gibco | 15400-054 | HEK293 passaging |
References
- Huang, E., Reichardt, L. Neurotrophins: Roles in Neuronal Development and Function. Annual Review of Neuroscience. 24, 677-736 (2001).
- Skaper, S. D. The neurotrophin family of neurotrophic factors: an overview. Methods in Mollecular Biology. 846, 1-12 (2012).
- Gonzalez, A., Moya-Alvarado, G., Gonzalez-Billault, C., Bronfman, F. C. Cellular and molecular mechanism regulating neuronal growth by brain-derived neurotrophic factor. Cytoskeleton. 73 (10), 612-628 (2016).
- Cunha, C., Brambilla, R., Thomas, K. A simple role for BDNF in learning and memory. Frontiers in Mollecular Neuroscience. 3, 1 (2010).
- Bronfman, F. C., Lazo, O. M., Flores, C., Escudero, C. A., Lewin, G., Carter, B. Spatiotemporal intracelular dynamics of neurotrophin and its receptors. Implications for neurotrophin signaling and neuronal function. Neurotrophic Factor. Handbook of Experimental Pharmacology. 220, (2014).
- Ascano, M., Bodmer, D., Kuruvilla, R. Endocytic trafficking of neurotrophins in neural development. Trends in Cell Biology. 22 (5), 266-273 (2012).
- Deinhardt, K., Salinas, S., Verastegui, C., Watson, R., Worth, D., Hanrahan, S., Bucci, C., Schiavo, G. Rab5 and Rab7 control endocytic sorting along the axonal retrograde transport pathway. Neuron. 52 (2), 293 (2006).
- Escudero, C. A., et al. c-Jun N-terminal kinase (JNK)-dependent internalization and Rab5-dependent endocytic sorting medaited long-distance retrograde neuronal death induced by axonal BDNF-p75 signaling. Scientific Reports. 9, 6070 (2019).
- Vrabec, J. P., Levin, L. A. The neurobiology of cell death in glaucoma. Eye. 21, 11-14 (2007).
- Liot, G., Zala, D., Pla, P., Mottet, G., Piel, M., Saudou, F. Mutant huntingtin alters retrograde transport of TrkB receptors in striatal dendrites. Journal of Neuroscience. 33 (15), 6298-6309 (2013).
- Zhou, B., Cai, Q., Xie, Y., Sheng, Z. H. Snapin recruits dynein to BDNF-TrkB signaling endosomes for retrograde axonal transport and is essential for dendrite growth of cortical neurons. Cell Reports. 2 (1), 42-51 (2012).
- Haubensak, W., Narz, F., Heumann, R., Lessmann, V. BDNF-GFP containing secretory granules are localized in the vicinity of synaptic junctions of cultured cortical neurons. Journal of Cell Science. 111 (11), 1483-1493 (1998).
- Adachi, N., et al. Glucocorticoid affects dendritic transport of BDNF-containing vesicles. Scientific Reports. 5, 12684 (2015).
- Biocompare: The Buyer’s Guide for Life Scientists. Mirus Bio. Cellular Toxicity Caused by Transfection: Why is it important Available from: https://www.biocompare.com/Bench-Tips/121111-Cellular-Toxicity-Caused-by-Transfection-Why-is-it-important/ (2012)
- Zhao, L., et al. Mechanism underlying activity-dependent insertion of TrkB into the neuronal surface. Journal of Cell Science. 122 (17), 3123-3136 (2009).
- Zhao, X., Zhou, Y., Weissmiller, A., Pearn, M., Mobley, W., Wu, C. Real-time imaging of axonal transport of quantum dot-labeled BDNF in primary neurons. Journal of Visualized Experiments. 91, 51899 (2014).
- Sung, K., Maloney, M., Yang, J., Wu, C. A novel method for producing mono-biotinylated, biologically active neurotrophic factors: an essential reagent for single molecule study of axonal transport. Journal of Neuroscience Methods. 200 (2), 121-128 (2011).
- Deerinck, T. The application of fluorescent quantum dots to confocal, multiphoton and electron microscopic imaging. Toxicologic Pathology. 36 (1), 112-116 (2008).
- Unsain, N., Nuñez, N., Anastasia, A., Mascó, D. H. Status epilepticus induces a TrkB to p75 neurotrophin receptor switch and increases brain-derived neurotrophic factor interaction with p75 neurotrophon receptor: an initial event in neuronal injury induction. Neuroscience. 154 (3), 978-993 (2008).
- Walker, J. M. The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation. Methods Mol Biol. 32, 5-8 (1994).
- Moya-Alvarado, G., Gonzalez, A., Stuardo, N., Bronfman, F. C. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) regulates Rab5-positive early endosomes in hippocampal neurons to induce dendritic branching. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 493 (2018).
- Sasi, M., Vignoli, B., Canossa, M., Blum, R. Neurobiology of local and intercellular BDNF signaling. Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 469 (5), 593-610 (2017).
- . The Rab5-Rab11 endosomal pathway is required for BDNF-induced CREB transcriptional regulation in neurons Available from: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/844720v1 (2019)
- Mowla, , et al. Biosynthesis and post-translational processing of the precursor to brain-derived neurotrophic factor. Journal of Biological Chemistry. 276 (16), 12660-12666 (2001).
- Longo, P., Kavran, J., Kim, M. S., Leahy, D. Transient Mammalian Cell Transfection with Polyethyleneimine (PEI). Methods in Enzymology. 529, 227-240 (2013).
- Raymond, C., Tom, R., Perret, S., Moussouami, P., L’Abbé, D., St-Laurent, G., Durocher, Y. A simplified polyethyleneimine-mediated transfection process for large-scale and high-throughput applications. Methods. 55 (1), 44-51 (2011).
- Dalton, A., Barton, W. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Science. 23 (5), 517-525 (2014).
- Hunter, M., Yuan, P., Vavilala, D., Fox, M. Optimization of protein expression in mammalian cells. Current Protocols in Protein Science. 95 (1), 77 (2019).
- Stepanenko, A. A., Heng, H. H. Transient and stable vector transfection: Pitfalls, off-target effects, artifacts. Mutation Research. 773, 91-103 (2017).
- Guerzoni, L. P., Nicolas, V., Angelova, A. In vitro modulation of TrkB receptor signaling upon sequential delivery of curcumin-DHA loaded carriers towards promoting neuronal survival. Pharmaceutical Research. 34 (2), 492-505 (2017).
- Angelova, A., Angelov, B. Dual and multi-drug delivery nanoparticles towards neuronal survival and synaptic repair. Neural Regeneration Research. 12 (6), 886-889 (2017).
