Un protocollo migliorato per purificare e direttamente mono-biotinyare recombinante BDNF in un tubo per gli studi sul traffico cellulare nei neuroni
Summary
Il BDNF ricombinante contenente una sequenza Avi (BDNFAvi) viene prodotto nelle cellule HEK293 in modo conveniente ed è purificato dalla cromatografia di affinità. BDNFavi viene quindi direttamente mono-biotinylated con l’enzima BirA in un tubo. BDNFavi e BDNFavi monobionlate mantengono la loro attività biologica rispetto al BDNF disponibile in commercio.
Abstract
Il BDNF ricombinante contenente una sequenza Avi (BDNFAvi) viene prodotto nelle cellule HEK293 e quindi purificato in modo conveniente dalla cromatografia di affinità. È stato sviluppato un protocollo riproducibile per mono-biotinylate BDNFAvi direttamente monobiolare con l’enzima BirA in un tubo. In questa reazione, BDNFAvi monobiolato mantiene la sua attività biologica.
Le neurotrofie sono fattori di crescita derivati dagli obiettivi che svolgono un ruolo nello sviluppo e nella manutenzione neuronali. Essi richiedono meccanismi di trasporto rapido lungo il percorso endocitico per consentire la segnalazione a lunga distanza tra diversi compartimenti neuronali. Lo sviluppo di strumenti molecolari per studiare il traffico di neurotrofinelle ha permesso il monitoraggio preciso di queste proteine nella cellula utilizzando la registrazione in vivo. In questo protocollo, abbiamo sviluppato una procedura ottimizzata ed economica per la produzione di BDNF monobionlate. Una variante BDNF ricombinante contenente una sequenza avi biotinyilable (BDNFAvi) viene prodotta in cellule HEK293 nell’intervallo di microgrammi e quindi purificata in una procedura facilmente scalabile utilizzando la cromatografia di affinità. Il BDNF purificato può quindi essere omogeneamente mono-biotinylated da una reazione diretta in vitro con l’enzima BirA in un tubo. L’attività biologica del BDNF monobiolato (mbtBDNF) può essere coniugata a streptavidin-conjugated a diversi fluorofori. BDNFAvi e mbtBDNF mantengono la loro attività biologica dimostrata attraverso il rilevamento di bersagli fosforillati a valle utilizzando macchie occidentali e l’attivazione del fattore di trascrizione CREB, rispettivamente. Utilizzando i punti streptavidin-quantum, siamo stati in grado di visualizzare l’internalizzazione mbtBDNF concomitante con l’attivazione del CREB, che è stato rilevato con un anticorpo specifico fosforo-CREB. Inoltre, mbtBDNF coniugato ai punti streptavidin-quantum era adatto per l’analisi del trasporto retrogrado nei neuroni corticali coltivati in camere microfluidiche. Così, in tubo prodotto mbtBDNF è uno strumento affidabile per studiare la dinamica endosomica di segnalazione fisiologica e il traffico di neuroni.
Introduction
I neuroni sono le unità funzionali del sistema nervoso in possesso di una morfologia complessa e specializzata che consente la comunicazione sinaptica, e quindi la generazione di un comportamento coordinato e complesso in risposta a diversi stimoli. Proiezioni neuronali come dendriti e assoni sono caratteristiche strutturali critiche coinvolte nella comunicazione neuronale, e le neurotrofie sono fattori cruciali per determinare la loro morfologia e funzione1. Le neurotrofie sono una famiglia di fattori di crescita secreti che includono NGF, NT-3, NT-4 e fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF)2. Nel sistema nervoso centrale (CNS), BDNF partecipa a diversi processi biologici tra cui neurotrasmissione, arborizzazione dendritica, maturazione delle spine dendritiche, potenziamento a lungo termine, tra gli altri3,4. Pertanto, BDNF svolge un ruolo critico nella regolazione della funzione neuronale.
Diversi processi cellulari regolano le dinamiche e le funzioni del BDNF. Sulla superficie neuronale, BDNF lega il recettore tropomiosina chinasi B (TrkB) e/o il recettore neurotrofiina p75 (p75). I complessi BDNF-TrkB e BDNF-p75 sono endocitosi e ordinati in diversi organelli endocitici5,6,77,8. Il corretto traffico intracellulare del complesso BDNF/TrkB è necessario per una corretta segnalazione BDNF in circuiti neuronali diversi9,10,11. Per questo motivo, una profonda comprensione delle dinamiche del traffico BDNF e delle sue alterazioni nei processi patofisiologici è essenziale per comprendere la segnalazione BDNF in salute e malattia. Lo sviluppo di nuovi e specifici strumenti molecolari per monitorare questo processo contribuirà a portare avanti questo campo e permetterà una migliore comprensione dei meccanismi normativi coinvolti.
Ci sono diversi strumenti disponibili per lo studio del traffico di BDNF nei neuroni. Una metodologia comunemente usata prevede la trasfezione di BDNF ricombinante etichettato con molecole fluorescenti come la proteina fluorescente verde (GFP) o la variante fluorescente fluorescente monomerica di GFP mCherry12,13. Tuttavia, una grave carenza di sovraespressione BDNF è che elimina la possibilità di fornire concentrazioni note di questa neurotrofia. Inoltre, può provocare tossicità cellulare, oscurando l’interpretazione dei risultati14. Una strategia alternativa è la trasfezione di un TrkB con etichetta epitope, come Flag-TrkB. Questa metodologia consente lo studio delle dinamiche di internalizzazione TrkB15, ma comporta anche la trasfezione, che potrebbe provocare alterata funzione TrkB e tossicità cellulare. Per superare questi ostacoli metodologici, sono state sviluppate varianti ricombinanti di NGF e BDNF contenenti una sequenza Avi (BDNFAvi), che può essere monobiota dall’enzima biotina-ligase BirA, sono state sviluppate16,17. Il BDNF ricombinante biotinylato può essere accoppiato a diversi strumenti legati alla streptavidina, che includono fluorofori, perline, nanoparticelle paramagnetiche tra gli altri per il rilevamento. In termini di imaging a cellule vive, i punti quantici (QD) sono diventati fluorofori usati di frequente, in quanto hanno caratteristiche desiderabili per il tracciamento di singole particelle, come una maggiore luminosità e resistenza al fotobleaching rispetto ai piccoli fluorofori molecolari18.
La produzione di BDNF monobiotinylata (mbtBDNF) utilizzando BDNFAvi è stata ottenuta mediante co-trasfezione di plasmidi guidando l’espressione di BDNFAvi e BirA, seguito dalla purificazione della proteina ricombinante mediante cromatografia di affinità con una resa di 1-2 g di BDNF per 20 mL di supporti di coltura con condizioni HEK29317. Qui, proponiamo una modifica di questo protocollo che consente la purificazione BDNFAvi da 500 mL di supporti con condizione HEK293, che cerca di massimizzare il recupero delle proteine in un protocollo basato su colonna cromatografia per facilità di manipolazione. L’agente di trasfezione usato, la polietileneimina (PEI), garantisce un metodo conveniente senza sacrificare la resa della trasfezione. La fase di monobiozione è stata adattata a una reazione in vitro per evitare le complicazioni associate alla co-transfections e per garantire un’etichettatura omogenea del BDNF. L’attività biologica del mbtBDNF è stata dimostrata da esperimenti di microscopia a macchia e fluorescenza occidentali, tra cui l’attivazione del pCREB e l’imaging a cellule vive per studiare il trasporto assonale retrogrado del BDNF in camere microfluidiche. L’uso di questo protocollo consente una produzione ottimizzata e ad alto rendimento di BDNF omogeneo monobio-biobiolato e biologicamente attivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo articolo viene descritta una metodologia ottimizzata per la produzione e la purificazione di mbtBDNF in una procedura basata sulla cromatografia di affinità, basata sul lavoro di Sung e dei collaboratori17. Le ottimizzazioni includono l’uso di una reagente di trasfezione conveniente (PEI) pur mantenendo l’efficienza di metodi di trasfezione più costosi come la lipofectamine. Questa ottimizzazione si traduce in una significativa riduzione dei costi nel protocollo, consentendo una scalab…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori riconoscono con gratitudine il sostegno finanziario di Fondecyt (1171137) (FCB), il Basal Center of Excellence in Science and Technology (AFB 170005) (FCB), Millenium-Nucle (P07/011-F) (FCB), il Wellcome Trust Senior Investigator Award (107116 / 15 / s) (GS) e un premio UK Dementia Research Institute Foundation (GS). Questo lavoro è stato supportato dall’Unidad de Microscopa Avanzada UC (UMA UC).
Materials
| 2 way stopcock | BioRad | 7328102 | Chromatography apparatus component |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | BDNF elution buffer |
| Acrylamide/Bisacrylamide | BioRad | 1610154 | SDS-PAGE gel preparation |
| Amicon Ultra-15 10K | Millipore | UFC901024 | BDNF concentration |
| Ammonium Persulfate | Sigma | A9164 | SDS-PAGE gel preparation |
| anti B-III-Tubulin antibody | Sigma | T8578 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti BDNF antibody | Alomone | AGP-021 | Western blot assays for BDNF quantification |
| anti BDNF antibody | Alomone | ANT-010 | Western blot assays for BDNF quantification |
| Anti ERK antibody | Cell Signaling | 9102 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti pCREB antibody (S133) | Cell Signaling | 9198 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti pERK antibody (T202, Y204) | Cell Signaling | 4370 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti pTrkB antibody (Y515) | Abcam | ab109684 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| Antibiotic/Antimycotic | Gibco | 15240-062 | HEK293 maintenance |
| ATP | Sigma | A26209 | BDNF monobiotinylation buffer |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504-044 | Neuron maintenance |
| Bicine | Sigma | B3876 | BDNF monobiotinylation buffer |
| BirA-GST | BPS Bioscience | 70031 | Enzyme for BDNF AviTag monobiotinylation |
| Bovine Fetal Serum | HyClone | HC.SH30396.02 | HEK293 maintenance |
| Bovine Serum Albumin | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | BDNF buffer modification component, blocking buffer for western blot and immunofluorescence |
| D-Biotin | Sigma | B4639 | BDNF monobiotinylation buffer |
| Dithiothreitol | Invitrogen | 15508-013 | |
| DMEM High Glucose Medium | Gibco | 11965-092 | Neuron seeding |
| DMEM Medium | Gibco | 11995-081 | HEK293 maintenance |
| Econo Column Funnel | BioRad | 7310003 | Chromatography apparatus component |
| EDTA | Merck | 108418 | |
| EZ-ECL Kit | Biological Industries | 1633664 | Protein detection by western blotting |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | Neuron and HEK293 maintenance |
| Glycerol | Merck | 104094 | BDNF elution buffer, lysis buffer for western blot assays |
| Hettich Rotina 46R Centrifuge | Hettich | Discontinued | Centrifuge used for clearing the medium of debris |
| Hettich Universal 32R Centrifuge | Hettich | Discontinued | Centrifuge used for protein concentrator centrifugation |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | Neuron seeding |
| ImageQuant LAS 500 | GE Healthcare Life Sciences | 29005063 | Western blot image acquisition |
| Imidazole | Sigma | I55513 | BDNF buffer modification component |
| KCl | Winkler | BM-1370 | PBS component |
| KH2PO4 | Merck | 104873 | PBS component |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | Cover coating for compartmentalized neurons |
| Luer Tubing Adaptor | BioRad | 7323245 | Chromatography apparatus component |
| Luminata™ Forte Western HRP Substrate | Millipore | WBLUF0100 | Protein detection by western blotting |
| Mg(CH3COO)2 | Merck | 105819 | BDNF monobiotinylation buffer |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | Mounting reagent for immunofluorescence assays |
| MyOne C1 Streptavidin Magnetic Beads | Invitrogen | 65001 | Biotinylation verification |
| Na2HPO4 | Merck | 106586 | BDNF buffer modification component |
| NaCl | Winkler | BM-1630 | PBS component, BDNF buffer modification component |
| NaH2PO4 | Merck | 106346 | BDNF buffer modification component |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | Neuron maintenance |
| Ni-NTA Agarose Beads | Qiagen | 30210 | BDNF AviTag purification |
| Nikon Ti2-E | Nikon | Microscope for fluorescence imaging | |
| Nitrocellulose Membrane | BioRad | 1620115 | Protein transfer for western blotting |
| ORCA-Flash4.0 V3 Digital CMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | Camera for epifluorescence imaging |
| P8340 Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | P8340 | BDNF buffer modification component |
| Paraformaldehyde | Merck | 104005 | Fixative for immunofluorescence assays |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Neuron maintenance |
| Poli-D-Lysine | Corning | DLW354210 | Cover coating for compartmentalized neurons |
| Poli-L-Lysine | Millipore | P2363 | Cover coating for non-compartmentalized neurons |
| Poly-Prep Chromatography Column | BioRad | 7311550 | Chromatography apparatus component |
| Polyethyleneimine 25K | Polysciences Inc. | PLY-0296 | HEK293 transfection |
| Quantum Dots 655 streptavidin conjugate | Invitrogen | Q10121MP | Monobiotinylated BDNF AviTag label for live and fixed cell experiments |
| Saponin | Sigma | S4521 | Detergent for immunofluorescence assays |
| Sucrose | Merck | 107687 | |
| Syldgard 184 silicone elastomer base | Poirot | 4019862 | Microfluidic chamber preparation |
| TEMED | Sigma | T9281 | SDS-PAGE gel preparation |
| Tris | Winkler | BM-2000 | Lysis buffer component |
| Triton X100 | Merck | 108603 | Cell permeabilization in immunofluorescence and western blot assays |
| Trypsin-EDTA 0.5% | Gibco | 15400-054 | HEK293 passaging |
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