Billeddannelse og analyse af Neurofilament Transport i punkterede mus Tibial Nerve
Summary
Vi beskriver fluorescens fotoaktivation metoder til at analysere axonal transport af neurofilamenter i enkelt myelinerede axoner af perifere nerver fra transgene mus, der udtrykker en fotoaktivatable neurofilament protein.
Abstract
Neurofilament protein polymerer bevæge sig langs axoner i den langsomme komponent af axonal transport ved gennemsnitlige hastigheder på ~ 0,35-3,5 mm / dag. Indtil for nylig studiet af denne bevægelse in situ var kun muligt ved hjælp af radioisotopisk puls-mærkning, som tillader analyse af axonal transport i hele nerver med en tidsmæssig opløsning af dage og en rumlig opløsning af millimeter. For at studere neurofilament transport in situ med højere tidsmæssig og rumlig opløsning, udviklede vi en hThy1-paGFP-NFM transgen mus, der udtrykker neurofilament protein M mærket med fotoaktivatable GFP i neuroner. Her beskriver vi fluorescens fotoaktivation puls-escape og puls-spredning metoder til at analysere neurofilament transport i enkelt myelinerede axoner af skinneben nerver fra disse mus ex vivo. Isolerede nerve segmenter opretholdes på mikroskopet fase ved perfusion med iltet saltvand og afbildet ved spinning disk konfokal fluorescens mikroskopi. Violet lys bruges til at aktivere fluorescens i et kort axonal vindue. Fluorescensen i de aktiverede og flankerende regioner analyseres over tid, hvilket gør det muligt at studere neurofilamenttransport med henholdsvis tidsmæssig og rumlig opløsning i rækkefølgen af minutter og mikron. Matematisk modellering kan bruges til at udtrække kinetiske parametre for neurofilament transport, herunder hastighed, retningsbestemt bias og pauser adfærd fra de resulterende data. Puls-escape og puls-spredning metoder kan også tilpasses til at visualisere neurofilament transport i andre nerver. Med udviklingen af yderligere transgene mus, kunne disse metoder også bruges til at afbilde og analysere axonal transport af andre cytoskeletal og cykliske proteiner i axoner.
Introduction
Den aksonale transport af neurofilamenter blev først demonstreret i 1970’erne ved radioisotopisk pulsmærkning1. Denne fremgangsmåde har givet et væld af oplysninger om neurofilament transport in vivo, men det har relativt lav rumlig og tidsmæssig opløsning, typisk i rækkefølgen af millimeter og dage i bedstefald 2. Desuden radioisotopisk puls-mærkning er en indirekte tilgang, der kræver injektion og ofring af flere dyr til at generere en enkelt tid kursus. Med opdagelsen af fluorescerende proteiner og fremskridt i fluorescensmikroskopi i 1990’erne, blev det efterfølgende muligt at billedet neurofilament transport direkte i dyrkede neuroner på en tidsskala af sekunder eller minutter og med sub-mikrometer rumlig opløsning, der giver langt større indsigt i mekanismen for bevægelse3. Disse undersøgelser har vist, at neurofilament polymerer i axoner bevæger sig hurtigt og periodisk i både anterograde og retrograd retninger langs mikrotubule spor, fremdrives af mikrotubule motorproteiner. Men neurofilaments er diffraktion-begrænsede strukturer kun 10 nm i diameter, der typisk afstand bortset fra deres naboer med kun snesevis af nanometer; derfor kan polymererne kun spores i dyrkede neuroner, der indeholder sparsomt distribuerede neurofilamenter, så de bevægelige polymerer kan løses fra deres naboer4. Således er det ikke i øjeblikket muligt at spore enkelte neurofilamenter i axoner, der indeholder rigelige neurofilament polymerer, såsom myelinerede axoner.
At analysere axonal transport af neurofilamenter i neurofilament-rige axoner ved hjælp af fluorescens mikroskopi, vi bruger en fluorescens fotoaktivation puls-escape metode, som vi udviklede til at studere den langsigtede pauser adfærd neurofilaments i dyrkede nerveceller4,5. Neurofilamenter mærket med et fotoaktivatabelt fluorescerende neurofilamentfusionsprotein aktiveres i et kort segment af axon, og derefter kvantificeres afgangshastigheden af disse filamenter fra det aktiverede område ved at måle fluorescens henfaldet over tid. Fordelen ved denne tilgang er, at det er en analyse på befolkningsniveau af neurofilamenttransport, der kan anvendes på en tidsskala af minutter eller timer uden at skulle spore bevægelsen af individuelle neurofilamentpolymerer. For eksempel har vi brugt denne metode til at analysere kinetik af neurofilament transport i myelinating kulturer6.
For nylig har vi beskrevet udviklingen af en hThy1-paGFP-NFM transgene mus, der udtrykker lave niveauer af en paGFP-mærket neurofilament protein M (paGFP-NFM) i neuroner under kontrol af den menneskelige neuron-specifikke Thy1 promotor7. Denne mus tillader analyse af neurofilament transport in situ ved hjælp af fluorescens mikroskopi. I denne artikel beskriver vi de eksperimentelle tilgange til analyse af neurofilament transport i myelinerede axoner af tibial nerver fra disse mus ved hjælp af to tilgange. Den første af disse tilgange er puls-escape metode, der er beskrevet ovenfor. Denne metode kan generere oplysninger om neurofilamenters pauseadfærd, men er blind for den retning, hvori filamenterne afviger fra det aktiverede område, og tillader derfor ikke måling af nettoretningalitet og transporthastighed8. Den anden af disse tilgange er en ny puls-spread metode, hvor vi analyserer ikke kun tab af fluorescens fra den aktiverede region, men også den forbigående stigning i fluorescens i to flankerende vinduer, hvorigennem fluorescerende filamenter bevæger sig, da de afgår den aktiverede region i både anterograde og tilbageskridt retninger. I begge tilgange, parametre for neurofilament transport såsom den gennemsnitlige hastighed, netto directionalitet og pauser adfærd kan opnås ved hjælp af matematisk analyse og modellering af ændringerne i fluorescens i målevinduerne. Figur 3 illustrerer disse to tilgange.
Denne protokol viser dissektion og forberedelse af nerve, aktivering og billeddannelse af paGFP fluorescens, og kvantificering af neurofilament transport fra de erhvervede billeder ved hjælp af FIJI distributionspakke af ImageJ9. Vi bruger tibial nerve, fordi det er lang (flere cm) og ikke gren; i princippet er enhver nerve udtrykkelig paGFP-NFM dog egnet til brug med denne teknik, hvis den kan dissekeres og affjedre uden at beskadige axonerne.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der skal gøres opmærksom på analysen af eksperimenter med pulse-escape og pulsspredning, da der er et betydeligt potentiale for at indføre fejl under efterbehandlingen, hovedsagelig under flat-field-korrektionen, billedjusteringen og blegemiddelkorrektionen. Flat-field korrektion er nødvendig for at korrigere for manglende ensartethed i belysningen, hvilket resulterer i en fall-off i intensitet på tværs af synsfeltet fra centrum til periferi. Omfanget af ikke-ensartethed er bølgelængdeafhængig og bør derfor al…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke Paula Monsma for instruktion og bistand med konfokale mikroskopi og tibial nerve dissektion og Dr. Atsuko Uchida, Chloe Duger og Sana Chahande for hjælp med mus ærholdning. Dette arbejde blev delvist støttet af det kollaborative National Science Foundation Grants IOS1656784 til A.B. og IOS1656765 til PJ, og National Institutes of Health Grants R01 NS038526, P30 NS104177 og S10 OD010383 til A.B. N.P.B. blev støttet af et stipendium fra Ohio State University President’s Postdoctoral Scholars Program.
Materials
| 14 x 22 Rectangle Gasket 0.1mm | Bioptechs | 1907-1422-100 | inner gasket |
| 2-deoxy-D-glucose | Sigma | D6134 | |
| 30mm Round Gasket w/ Holes | Bioptechs | 1907-08-750 | outer gasket |
| 35 x 10mm dish | Thermo Fisher | 153066 | dissection dishes |
| 40mm round coverslips | Bioptechs | 40-1313-0319 | |
| 60mL syringe – Luer-lock tip | BD | 309653 | |
| Andor Revolution WD spinning-disk confocal system | Andor | outfitted with Perfect Focus and FRAPPA systems | |
| Calcium chloride | Fisher | C79 | |
| Coverslips | Fisher | 12-541-B | for fluorescein slide |
| D-(+)-glucose solution | Sigma | G8769 | |
| Dissecting pins | Fine Science Tools | 26001-70 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | fine tipped forceps |
| Dissection microscope | Zeiss | 47 50 03 | |
| Dissection pan with wax | Ginsberg Scientific | 568859 | |
| Dissection scissors | Fine Science Tools | 14061-09 | initial dissection scissors |
| FCS2 perfusion chamber | Bioptechs | 060319-2-03 | |
| Fluorescein sodium | Fluka | 46960 | |
| Inline solution heater | Warner Instruments | SH27-B | |
| Laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | initial dissection forceps |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Microaqueduct slide | Bioptechs | 130119-5 | |
| Microscope slides | Fisher | 12-544-3 | for fluorescein slide |
| Microscope stage insert | Applied Scientific Instrumentation | I-3017 | |
| Objective heater system | Okolab | Oko Touch with objective collar | |
| Objective oil – type A | Nikon | discontinued | |
| Plan Apo VC 100x 1.40 NA objective | Nikon | MRD01901 | |
| Potassium chloride | Fisher | P217 | |
| Potassium phosphate | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium iodoacetate | Sigma-Aldrich | I2512 | |
| Syringe pump | Sage Instruments | Model 355 | |
| Tubing adapter – female | Small Parts Inc. | 1005109 | |
| Tubing adapter – male | Small Parts Inc. | 1005012 | |
| Tygon tubing | Bioptechs | 1/16" ID, 1/32" wall thickness | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | fine scissors |
References
- Hoffman, P. N., Lasek, R. J. The slow component of axonal transport. Identification of major structural polypeptides of the axon and their generality among mammalian neurons. Journal of Cell Biology. 66 (2), 351-366 (1975).
- Brown, A. Slow Axonal Transport. Reference Module in Biomedical Sciences. , (2014).
- Wang, L., Ho, C. -. L., Sun, D., Liem, R. K. H., Brown, A. Rapid movement of axonal neurofilaments interrupted by prolonged pauses. Nature Cell Biology. 2 (3), 137-141 (2000).
- Uchida, A., Monsma, P. C., Fenn, J. D., Brown, A. Live-cell imaging of neurofilament transport in cultured neurons. Methods in Cell Biology. 131, 21-90 (2016).
- Trivedi, N., Jung, P., Brown, A. Neurofilaments switch between distinct mobile and stationary states during their transport along axons. Journal of Neuroscience. 27 (3), 507-516 (2007).
- Monsma, P. C., Li, Y., Fenn, J. D., Jung, P., Brown, A. Local regulation of neurofilament transport by myelinating cells. Journal of Neuroscience. 34 (8), 2979-2988 (2014).
- Walker, C. L., et al. Local Acceleration of Neurofilament Transport at Nodes of Ranvier. Journal of Neuroscience. 39 (4), 663-677 (2019).
- Li, Y., Brown, A., Jung, P. Deciphering the axonal transport kinetics of neurofilaments using the fluorescence photoactivation pulse-escape method. Physical Biology. 11 (2), 026001 (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Breuer, A. C., et al. Fast axonal transport in amyotrophic lateral sclerosis: an intra-axonal organelle traffic analysis. Neurology. 37 (5), 738-748 (1987).
- Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, photoactivation, photoconversion, and FLIP. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (12), (2010).
- Model, M. Intensity calibration and flat-field correction for fluorescence microscopes. Current Protocols in Cytometry. 68, (2014).
- Schmidt, M. M., Dringen, R. Differential effects of iodoacetamide and iodoacetate on glycolysis and glutathione metabolism of cultured astrocytes. Frontiers in Neuroenergetics. 1, 1-10 (2009).
- Surre, J., et al. Strong increase in the autofluorescence of cells signals struggle for survival. Scientific Reports. 8 (1), 12088 (2018).
- Cox, M., Lucey, S., Sridharan, S., Cohn, J. Least Squares Congealing for Unsupervised Alignment of Images. Proceedings of the IEEE Computer Society Conference on Computer Vision and Pattern Recognition. , (2008).
- Huang, S., Heikal, A. A., Webb, W. W. Two-photon fluorescence spectroscopy and microscopy of NAD(P)H and flavoprotein. Biophysical Journal. 82 (5), 2811-2825 (2002).
- Fenn, J. D., Johnson, C. M., Peng, J., Jung, P., Brown, A. Kymograph analysis with high temporal resolution reveals new features of neurofilament transport kinetics. Cytoskeleton. 75 (1), 22-41 (2018).
- Alami, N. H., Jung, P., Brown, A. Myosin Va increases the efficiency of neurofilament transport by decreasing the duration of long-term pauses. Journal of Neuroscience. 29 (20), 6625-6634 (2009).
- Xu, Z., Tung, V. W. Temporal and Spatial Variations in Slow Axonal Transport Velocity Along Peripheral Motoneuron Axons. Neuroscience. 102 (1), 193-200 (2001).
- Jung, P., Brown, A. Modeling the Slowing of Neurofilament Transport Along the Mouse Sciatic Nerve. Physical Biology. 6 (4), 046002 (2009).
- Cohen, J. The effect size index: d. Statistical Power Analysis for the Behavioral Sciences 2nd ed. , 20-26 (1988).
- Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. Imaging axonal transport of mitochondria in vivo. Nature Methods. 4 (7), 559-561 (2007).
- Gilley, J., et al. Age-dependent axonal transport and locomotor changes and tau hypophosphorylation in a “P301L” tau knockin mouse. Neurobiology of Aging. 33 (3), 1-15 (2012).
- Marinkovic, P., et al. Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 109 (11), 4296-4301 (2012).
- Milde, S., Adalbert, R., Elaman, M. H., Coleman, M. P. Axonal transport declines with age in two distinct phases separated by a period of relative stability. Neurobiology of Aging. 36 (2), 971-981 (2015).
- Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons. Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).
