Imagem e Análise do Transporte de Neurofilamento em Nervo Tibial de Camundongo Excised
Summary
Descrevemos métodos de fotoativação de fluorescência para analisar o transporte axonal de neurofilamentos em axônios mieliados únicos de nervos periféricos de camundongos transgênicos que expressam uma proteína de neurofilamento fotoativavel.
Abstract
Os polímeros de proteína neurofilamental movem-se ao longo dos axônios no componente lento do transporte axonal a velocidades médias de ~0,35-3,5 mm/dia. Até recentemente, o estudo desse movimento in situ só era possível utilizando rotulagem de pulso radioisotópica, que permite a análise do transporte axonal em nervos inteiros com resolução temporal de dias e resolução espacial de milímetros. Para estudar o transporte de neurofilamento in situ com maior resolução temporal e espacial, desenvolvemos um camundongo transgênico hThy1-paGFP-NFM que expressa proteína de neurofilamento M marcada com GFP fotoativatável em neurônios. Aqui descrevemos os métodos de fotoativação de fluorescência de fuga de pulso e difusão de pulso para analisar o transporte de neurofilamento em axônios mieliados únicos de nervos tibiais desses camundongos ex vivo. Segmentos nervosos isolados são mantidos no estágio do microscópio por perfusão com soro fisiológico oxigenado e imageados por microscopia de fluorescência confocal de disco giratório. A luz violeta é usada para ativar a fluorescência em uma janela axonal curta. A fluorescência nas regiões ativadas e flanqueadas é analisada ao longo do tempo, permitindo o estudo do transporte de neurofilamento com resolução temporal e espacial na ordem de minutos e mícrons, respectivamente. A modelagem matemática pode ser usada para extrair parâmetros cinéticos do transporte de neurofilamento, incluindo a velocidade, viés direcional e comportamento de pausa dos dados resultantes. Os métodos de fuga de pulso e difusão de pulso também podem ser adaptados para visualizar o transporte de neurofilamento em outros nervos. Com o desenvolvimento de camundongos transgênicos adicionais, esses métodos também poderiam ser usados para imagem e análise do transporte axonal de outras proteínas citoesqueletal e citosóica em axônios.
Introduction
O transporte axonal de neurofilamentos foi demonstrado pela primeira vez na década de 1970 pela rotulagem de pulso radioisotópica1. Essa abordagem tem gerado uma riqueza de informações sobre o transporte de neurofilamento in vivo,mas tem resolução espacial e temporal relativamente baixa, tipicamente na ordem dos milímetros e dias, no máximo2. Além disso, a rotulagem de pulso radioisotópica é uma abordagem indireta que requer a injeção e o sacrifício de vários animais para gerar um curso único. Com a descoberta de proteínas fluorescentes e os avanços na microscopia de fluorescência na década de 1990, tornou-se posteriormente possível a imagem do transporte de neurofilamento diretamente em neurônios cultos em uma escala de tempo de segundos ou minutos e com resolução espacial sub-micrômetro, proporcionando uma visão muito maior do mecanismo do movimento3. Esses estudos revelaram que os polímeros de neurofilamento em axônios se movem de forma rápida e intermitente em direções anterogradas e retrógradas ao longo de trilhas de microtúbulos, impulsionados por proteínas motoras microtúbulas. No entanto, neurofilamentos são estruturas limitadas à difração com apenas 10 nm de diâmetro que são tipicamente espaçadas além de seus vizinhos por apenas dezenas de nanômetros; portanto, os polímeros só podem ser rastreados em neurônios cultivados que contenham neurofilamentos pouco distribuídos para que os polímeros em movimento possam ser resolvidos a partir de seus vizinhos4. Assim, não é possível rastrear neurofilamentos únicos em axônios que contenham polímeros neurofilados abundantes, como axônios mieliados.
Para analisar o transporte axonal de neurofilamentos em axônios ricos em neurofilamentos usando microscopia de fluorescência, utilizamos um método de fotoativação de fluorescência de fuga de pulso que desenvolvemos para estudar o comportamento de pausa a longo prazo de neurofilamentos em células nervosas cultivadas4,,5. Neurofilamentos marcados com uma proteína de fusão de neurofilamento fluorescente fotoativat são ativados em um pequeno segmento de axônio, e então a taxa de saída desses filamentos da região ativada é quantificada pela medição da decadência da fluorescência ao longo do tempo. A vantagem dessa abordagem é que é uma análise em nível populacional do transporte de neurofilamento que pode ser aplicada em uma escala de tempo de minutos ou horas sem a necessidade de rastrear o movimento de polímeros de neurofilamento individual. Por exemplo, usamos este método para analisar a cinética do transporte de neurofilamento nas culturas mielique6.
Recentemente, descrevemos o desenvolvimento de um rato transgênico hThy1-paGFP-NFM que expressa baixos níveis de uma proteína de neurofilamento com marca paGFP M (paGFP-NFM) em neurônios sob o controle do promotor Thy1 específico do neurônio humano7. Este camundongo permite a análise do transporte de neurofilamento in situ usando microscopia de fluorescência. Neste artigo, descrevemos as abordagens experimentais para a análise do transporte de neurofilamento em axônios mieliados de nervos tibiais desses camundongos usando duas abordagens. A primeira dessas abordagens é o método de fuga de pulso descrito acima. Este método pode gerar informações sobre o comportamento de pausa dos neurofilamentos, mas é cego para a direção em que os filamentos partem da região ativada e, portanto, não permite a medição da direcionalidade líquida e da velocidade de transporte8. A segunda dessas abordagens é um novo método de propagação de pulso no qual analisamos não apenas a perda de fluorescência da região ativada, mas também o aumento transitório da fluorescência em duas janelas de flanqueamento através das quais os filamentos fluorescentes se movem à medida que saem da região ativada em direções anterogradas e retrógradas. Em ambas as abordagens, parâmetros de transporte de neurofilamento, como a velocidade média, direcionalidade líquida e comportamento de pausa podem ser obtidos utilizando-se análise matemática e modelagem das mudanças na fluorescência nas janelas de medição. A Figura 3 ilustra essas duas abordagens.
Este protocolo demonstra dissecação e preparação do nervo, ativação e imagem da fluorescência paGFP e quantificação do transporte de neurofilamento a partir das imagens adquiridas utilizando o pacote de distribuição FIJI da ImageJ9. Usamos o nervo tibial porque é longo (vários cm) e não ramifica; no entanto, em princípio, qualquer nervo que expresse paGFP-NFM é apropriado para uso com esta técnica se ela pode ser dissecada e desapeto sem danificar os axônios.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deve-se tomar cuidado na análise de experimentos de fuga de pulso e difusão de pulso, pois há um potencial significativo para a introdução de erros durante o pós-processamento, principalmente durante a correção de campo plano, alinhamento de imagem e correção de alvejante. A correção em campo plano é necessária para corrigir a não uniformidade na iluminação, o que resulta em uma queda de intensidade em todo o campo de visão do centro para a periferia. A extensão da não uniformidade é dependente do co…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer paula Monsma por instrução e assistência com microscopia confocal e dissecção do nervo tibial e Dr. Atsuko Uchida, Chloe Duger e Sana Chahande pela assistência com a criação de ratos. Este trabalho foi apoiado em parte pela Colaborativa National Science Foundation Grants IOS1656784 to A.B. e IOS1656765 a P.J., e Institutos Nacionais de Subsídios à Saúde R01 NS038526, P30 NS104177 e S10 OD010383 a A.B. N.P.B. foi apoiado por uma bolsa do Programa de Pós-Doutorado do Presidente da Universidade estadual de Ohio.
Materials
| 14 x 22 Rectangle Gasket 0.1mm | Bioptechs | 1907-1422-100 | inner gasket |
| 2-deoxy-D-glucose | Sigma | D6134 | |
| 30mm Round Gasket w/ Holes | Bioptechs | 1907-08-750 | outer gasket |
| 35 x 10mm dish | Thermo Fisher | 153066 | dissection dishes |
| 40mm round coverslips | Bioptechs | 40-1313-0319 | |
| 60mL syringe – Luer-lock tip | BD | 309653 | |
| Andor Revolution WD spinning-disk confocal system | Andor | outfitted with Perfect Focus and FRAPPA systems | |
| Calcium chloride | Fisher | C79 | |
| Coverslips | Fisher | 12-541-B | for fluorescein slide |
| D-(+)-glucose solution | Sigma | G8769 | |
| Dissecting pins | Fine Science Tools | 26001-70 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | fine tipped forceps |
| Dissection microscope | Zeiss | 47 50 03 | |
| Dissection pan with wax | Ginsberg Scientific | 568859 | |
| Dissection scissors | Fine Science Tools | 14061-09 | initial dissection scissors |
| FCS2 perfusion chamber | Bioptechs | 060319-2-03 | |
| Fluorescein sodium | Fluka | 46960 | |
| Inline solution heater | Warner Instruments | SH27-B | |
| Laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | initial dissection forceps |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Microaqueduct slide | Bioptechs | 130119-5 | |
| Microscope slides | Fisher | 12-544-3 | for fluorescein slide |
| Microscope stage insert | Applied Scientific Instrumentation | I-3017 | |
| Objective heater system | Okolab | Oko Touch with objective collar | |
| Objective oil – type A | Nikon | discontinued | |
| Plan Apo VC 100x 1.40 NA objective | Nikon | MRD01901 | |
| Potassium chloride | Fisher | P217 | |
| Potassium phosphate | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium iodoacetate | Sigma-Aldrich | I2512 | |
| Syringe pump | Sage Instruments | Model 355 | |
| Tubing adapter – female | Small Parts Inc. | 1005109 | |
| Tubing adapter – male | Small Parts Inc. | 1005012 | |
| Tygon tubing | Bioptechs | 1/16" ID, 1/32" wall thickness | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | fine scissors |
References
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