We beschrijven fluorescentiefotoactivatiemethoden om het axonale transport van neurofilamenten te analyseren in enkele gedeinlineerde axonen van perifere zenuwen van transgene muizen die een fotoactief neurofilament-eiwit uitdrukken.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Beeldvorming en analyse van neurofilament transport in accijnzen muis tibial zenuw
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Neurofilament eiwit polymeren bewegen langs axonen in de langzame component van axon vervoer bij gemiddelde snelheden van ~ 0,35-3,5 mm per dag. Tot voor kort was de studie van deze beweging in situ alleen mogelijk met behulp van radio-isotopenpuls, die analyse van axonaal transport in hele zenuwen met een temporele resolutie van dagen en een ruimtelijke resolutie van millimeters mogelijk maakt. Om neurofilamenttransport in situ te bestuderen met een hogere temporele en ruimtelijke resolutie, ontwikkelden we een hThy1-paGFP-NFM transgene muis die neurofilament-eiwit M met fotoactiviteitbare GFP in neuronen uitdrukt. Hier beschrijven we fluorescentie fotoactivatie pulse-escape en pulse-spread methoden om neurofilament transport te analyseren in enkele myelinated axonen van scheenbeen zenuwen van deze muizen ex vivo. Geïsoleerde zenuwsegmenten worden gehandhaafd op de microscoop stadium door perfusie met zuurstofrijk zout en afgebeeld door spinnen schijf confocale fluorescentie microscopie. Violet licht wordt gebruikt om de fluorescentie te activeren in een kort axonaal venster. De fluorescentie in de geactiveerde en flankerende gebieden wordt na verloop van tijd geanalyseerd, waardoor de studie van neurofilament transport met tijdelijke en ruimtelijke resolutie op de volgorde van minuten en micron, respectievelijk. Wiskundige modellering kan worden gebruikt om kinetische parameters van neurofilament transport met inbegrip van de snelheid, directionele bias en pauzeren gedrag uit de resulterende gegevens te extraheren. De puls-escape en pulse-spread methoden kunnen ook worden aangepast om neurofilament transport in andere zenuwen te visualiseren. Met de ontwikkeling van extra transgene muizen kunnen deze methoden ook worden gebruikt om het axonale transport van andere cytoskeletale en cytosolische eiwitten in axoons te beelden en te analyseren.
Inleiding
Het axonale transport van neurofilamenten werd voor het eerst gedemonstreerd in de jaren 1970 door radio-isotopen pulse-labeling1. Deze aanpak heeft een schat aan informatie opgeleverd over neurofilament transport in vivo, maar het heeft een relatief lage ruimtelijke en temporele resolutie, meestal in de orde van millimeters en dagen op zijn best2. Bovendien is radio-isotopenpulslabeling een indirecte benadering die de injectie en het offer van meerdere dieren vereist om een eenmalige cursus te genereren. Met de ontdekking van fluorescerende eiwitten en vooruitgang in fluorescentiemicroscopie in de jaren 1990, w....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle methoden die hier beschreven zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Ohio State University.
1. Voorbereiding van de zenuwsoutoplossing
- Maak 100 mL van Breuer's zoutoplossing10: 98 mM NaCl, 1 mM KCl, 2 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4, 1,5 mM CaCl2, 5,6% D-glucose, 23,8 mM NaHCO3 in dubbelgedestilleerd water.
- Bel 95% zuurstof/5% kooldioxide (carbogen) door de zoutoplossing gedurende ten minste 30 minuten voor gebruik. Restjes zout kunnen binnen een week worden hergebruikt; het moet echter vóór elk gebruik o....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Figuur 3 toont representatieve beelden van puls-escape en pulse-spread experimenten. We hebben verschillende studies gepubliceerd die gegevens beschrijven die zijn verkregen met behulp van de puls-escape-methode en onze methoden voor de analyse van die gegevens5,6,7,8,17. Hieronder laten we zien hoe de pulsspreadgegevens informati.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Er moet aandacht worden besreed bij de analyse van puls-escape en pulse-spread experimenten omdat er een aanzienlijk potentieel is voor de invoering van fouten tijdens de nabewerking, voornamelijk tijdens de vlakke veldcorrectie, beelduitlijning en bleekmiddelcorrectie. Correctie op vlak veld is noodzakelijk om te corrigeren voor niet-uniformiteit in de verlichting, wat resulteert in een val in intensiteit over het gezichtsveld van centrum naar periferie. De mate van niet-uniformiteit is golflengteafhankelijk en moet dus.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs willen Paula Monsma bedanken voor instructie en hulp met confocale microscopie en scheenbeen zenuwdissectie en Dr. Atsuko Uchida, Chloe Duger en Sana Chahande voor hulp bij de muishouderij. Dit werk werd mede ondersteund door collaborative National Science Foundation Grants IOS1656784 aan A.B. en IOS1656765 naar P.J., en National Institutes of Health Grants R01 NS038526, P30 NS104177 en S10 OD010383 naar A.B. N.P.B. werd ondersteund door een fellowship van het Postdoctoral Scholars Program van de Ohio State University President.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 14 x 22 Rectangle Gasket 0.1mm | Bioptechs | 1907-1422-100 | inner gasket |
| 2-deoxy-D-glucose | Sigma | D6134 | |
| 30mm Round Gasket w/ Holes | Bioptechs | 1907-08-750 | outer gasket |
| 35 x 10mm dish | Thermo Fisher | 153066 | dissection dishes |
| 40mm round coverslips | Bioptechs | 40-1313-0319 | |
| 60mL syringe - Luer-lock tip | BD | 309653 | |
| Andor Revolution WD spinning-disk confocal system | Andor | outfitted with Perfect Focus and FRAPPA systems | |
| Calcium chloride | Fisher | C79 | |
| Coverslips | Fisher | 12-541-B | for fluorescein slide |
| D-(+)-glucose solution | Sigma | G8769 | |
| Dissecting pins | Fine Science Tools | 26001-70 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | fine tipped forceps |
| Dissection microscope | Zeiss | 47 50 03 | |
| Dissection pan with wax | Ginsberg Scientific | 568859 | |
| Dissection scissors | Fine Science Tools | 14061-09 | initial dissection scissors |
| FCS2 perfusion chamber | Bioptechs | 060319-2-03 | |
| Fluorescein sodium | Fluka | 46960 | |
| Inline solution heater | Warner Instruments | SH27-B | |
| Laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | initial dissection forceps |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Microaqueduct slide | Bioptechs | 130119-5 | |
| Microscope slides | Fisher | 12-544-3 | for fluorescein slide |
| Microscope stage insert | Applied Scientific Instrumentation | I-3017 | |
| Objective heater system | Okolab | Oko Touch with objective collar | |
| Objective oil - type A | Nikon | discontinued | |
| Plan Apo VC 100x 1.40 NA objective | Nikon | MRD01901 | |
| Potassium chloride | Fisher | P217 | |
| Potassium phosphate | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium iodoacetate | Sigma-Aldrich | I2512 | |
| Syringe pump | Sage Instruments | Model 355 | |
| Tubing adapter - female | Small Parts Inc. | 1005109 | |
| Tubing adapter - male | Small Parts Inc. | 1005012 | |
| Tygon tubing | Bioptechs | 1/16" ID, 1/32" wall thickness | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | fine scissors |
Referenties
- Hoffman, P. N., Lasek, R. J. The slow component of axonal transport. Identification of major structural polypeptides of the axon and their generality among mammalian neurons. Journal of Cell Biology. 66 (2), 351-366 (1975).
- Brown, A. Slow Axonal Transport.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
