Beeldvorming en analyse van neurofilament transport in accijnzen muis tibial zenuw
Summary
We beschrijven fluorescentiefotoactivatiemethoden om het axonale transport van neurofilamenten te analyseren in enkele gedeinlineerde axonen van perifere zenuwen van transgene muizen die een fotoactief neurofilament-eiwit uitdrukken.
Abstract
Neurofilament eiwit polymeren bewegen langs axonen in de langzame component van axon vervoer bij gemiddelde snelheden van ~ 0,35-3,5 mm per dag. Tot voor kort was de studie van deze beweging in situ alleen mogelijk met behulp van radio-isotopenpuls, die analyse van axonaal transport in hele zenuwen met een temporele resolutie van dagen en een ruimtelijke resolutie van millimeters mogelijk maakt. Om neurofilamenttransport in situ te bestuderen met een hogere temporele en ruimtelijke resolutie, ontwikkelden we een hThy1-paGFP-NFM transgene muis die neurofilament-eiwit M met fotoactiviteitbare GFP in neuronen uitdrukt. Hier beschrijven we fluorescentie fotoactivatie pulse-escape en pulse-spread methoden om neurofilament transport te analyseren in enkele myelinated axonen van scheenbeen zenuwen van deze muizen ex vivo. Geïsoleerde zenuwsegmenten worden gehandhaafd op de microscoop stadium door perfusie met zuurstofrijk zout en afgebeeld door spinnen schijf confocale fluorescentie microscopie. Violet licht wordt gebruikt om de fluorescentie te activeren in een kort axonaal venster. De fluorescentie in de geactiveerde en flankerende gebieden wordt na verloop van tijd geanalyseerd, waardoor de studie van neurofilament transport met tijdelijke en ruimtelijke resolutie op de volgorde van minuten en micron, respectievelijk. Wiskundige modellering kan worden gebruikt om kinetische parameters van neurofilament transport met inbegrip van de snelheid, directionele bias en pauzeren gedrag uit de resulterende gegevens te extraheren. De puls-escape en pulse-spread methoden kunnen ook worden aangepast om neurofilament transport in andere zenuwen te visualiseren. Met de ontwikkeling van extra transgene muizen kunnen deze methoden ook worden gebruikt om het axonale transport van andere cytoskeletale en cytosolische eiwitten in axoons te beelden en te analyseren.
Introduction
Het axonale transport van neurofilamenten werd voor het eerst gedemonstreerd in de jaren 1970 door radio-isotopen pulse-labeling1. Deze aanpak heeft een schat aan informatie opgeleverd over neurofilament transport in vivo, maar het heeft een relatief lage ruimtelijke en temporele resolutie, meestal in de orde van millimeters en dagen op zijn best2. Bovendien is radio-isotopenpulslabeling een indirecte benadering die de injectie en het offer van meerdere dieren vereist om een eenmalige cursus te genereren. Met de ontdekking van fluorescerende eiwitten en vooruitgang in fluorescentiemicroscopie in de jaren 1990, werd het vervolgens mogelijk om neurofilament transport direct in gekweekte neuronen beeld op een tijdschaal van seconden of minuten en met sub-micrometer ruimtelijke resolutie, waardoor veel meer inzicht in het mechanisme van beweging3. Deze studies hebben aangetoond dat neurofilament polymeren in axonen snel en met tussenpozen bewegen in zowel anterograde als retrograde richtingen langs microtubulisporen, aangedreven door microtubuli motorische eiwitten. Echter, neurofilamenten zijn diffractie-beperkte structuren slechts 10 nm in diameter die meestal zijn verdeeld afgezien van hun buren door slechts tientallen nanometer; daarom kunnen de polymeren alleen worden gevolgd in gekweekte neuronen die schaars verdeelde neurofilamenten bevatten, zodat de bewegende polymeren kunnen worden opgelost van hun buren4. Zo is het momenteel niet mogelijk om enkele neurofilamenten in axonen te volgen die overvloedige neurofilament polymeren bevatten, zoals gesedineerde axonen.
Om het axale transport van neurofilamenten in neurofilamentrijke axonen te analyseren met behulp van fluorescentiemicroscopie, gebruiken we een fluorescentie fotoactivatie pulse-escape methode die we ontwikkelden om het langdurige pauzegedrag van neurofilamenten in gekweekte zenuwcellen4,5te bestuderen. Neurofilamenten gelabeld met een fotoactivatable fluorescerende neurofilament fusie-eiwit worden geactiveerd in een kort segment van axon, en vervolgens wordt de snelheid van vertrek van die filamenten uit het geactiveerde gebied gekwantificeerd door het fluorescentieverval in de loop van de tijd te meten. Het voordeel van deze aanpak is dat het een populatie-niveau analyse van neurofilament transport dat kan worden toegepast op een tijdschaal van minuten of uren zonder de noodzaak om de beweging van individuele neurofilament polymeren volgen. We hebben deze methode bijvoorbeeld gebruikt om de kinetiek van neurofilamenttransport in myelineculturen te analyseren6.
Onlangs hebben we beschreven de ontwikkeling van een hThy1-paGFP-NFM transgene muis die lage niveaus van een paGFP-tagged neurofilament eiwit M (paGFP-NFM) in neuronen onder de controle van de menselijke neuron-specifieke Thy1 promotor7uitdrukt. Deze muis maakt de analyse van neurofilament transport in situ met behulp van fluorescentie microscopie. In dit artikel beschrijven we de experimentele benaderingen voor het analyseren van neurofilamenttransport in geïhileerde axonen van scheenzuwen van deze muizen met behulp van twee benaderingen. De eerste van deze benaderingen is de hierboven beschreven puls-escape methode. Deze methode kan informatie genereren over het pauzeren van gedrag van de neurofilamenten, maar is blind voor de richting waarin de filamenten het geactiveerde gebied verlaten, en laat daarom geen meting van de netto directionaliteit en transportsnelheid8toe. De tweede van deze benaderingen is een nieuwe puls-spread methode waarbij we analyseren niet alleen het verlies van fluorescentie uit de geactiveerde regio, maar ook de voorbijgaande toename van fluorescentie in twee flankerende ramen waardoor de fluorescerende filamenten bewegen als ze vertrekken de geactiveerde regio in zowel anterograde en retrograde richtingen. In beide benaderingen kunnen parameters van neurofilamenttransport zoals de gemiddelde snelheid, netto directionaliteit en pauzegedrag worden verkregen door wiskundige analyse en modellering van de veranderingen in fluorescentie in de meetvensters. Figuur 3 illustreert deze twee benaderingen.
Dit protocol toont dissectie en voorbereiding van de zenuw, activering en beeldvorming van de paGFP fluorescentie, en kwantificering van neurofilament vervoer van de verworven beelden met behulp van de FIJI distributiepakket van ImageJ9. We gebruiken de scheenzenuw omdat het lang is (enkele cm) en niet vertakt; in principe is elke zenuw die paGFP-NFM uitdrukt echter geschikt voor gebruik met deze techniek als deze kan worden ontleed en ontleed zonder de axonen te beschadigen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Er moet aandacht worden besreed bij de analyse van puls-escape en pulse-spread experimenten omdat er een aanzienlijk potentieel is voor de invoering van fouten tijdens de nabewerking, voornamelijk tijdens de vlakke veldcorrectie, beelduitlijning en bleekmiddelcorrectie. Correctie op vlak veld is noodzakelijk om te corrigeren voor niet-uniformiteit in de verlichting, wat resulteert in een val in intensiteit over het gezichtsveld van centrum naar periferie. De mate van niet-uniformiteit is golflengteafhankelijk en moet dus…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen Paula Monsma bedanken voor instructie en hulp met confocale microscopie en scheenbeen zenuwdissectie en Dr. Atsuko Uchida, Chloe Duger en Sana Chahande voor hulp bij de muishouderij. Dit werk werd mede ondersteund door collaborative National Science Foundation Grants IOS1656784 aan A.B. en IOS1656765 naar P.J., en National Institutes of Health Grants R01 NS038526, P30 NS104177 en S10 OD010383 naar A.B. N.P.B. werd ondersteund door een fellowship van het Postdoctoral Scholars Program van de Ohio State University President.
Materials
| 14 x 22 Rectangle Gasket 0.1mm | Bioptechs | 1907-1422-100 | inner gasket |
| 2-deoxy-D-glucose | Sigma | D6134 | |
| 30mm Round Gasket w/ Holes | Bioptechs | 1907-08-750 | outer gasket |
| 35 x 10mm dish | Thermo Fisher | 153066 | dissection dishes |
| 40mm round coverslips | Bioptechs | 40-1313-0319 | |
| 60mL syringe – Luer-lock tip | BD | 309653 | |
| Andor Revolution WD spinning-disk confocal system | Andor | outfitted with Perfect Focus and FRAPPA systems | |
| Calcium chloride | Fisher | C79 | |
| Coverslips | Fisher | 12-541-B | for fluorescein slide |
| D-(+)-glucose solution | Sigma | G8769 | |
| Dissecting pins | Fine Science Tools | 26001-70 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | fine tipped forceps |
| Dissection microscope | Zeiss | 47 50 03 | |
| Dissection pan with wax | Ginsberg Scientific | 568859 | |
| Dissection scissors | Fine Science Tools | 14061-09 | initial dissection scissors |
| FCS2 perfusion chamber | Bioptechs | 060319-2-03 | |
| Fluorescein sodium | Fluka | 46960 | |
| Inline solution heater | Warner Instruments | SH27-B | |
| Laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | initial dissection forceps |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Microaqueduct slide | Bioptechs | 130119-5 | |
| Microscope slides | Fisher | 12-544-3 | for fluorescein slide |
| Microscope stage insert | Applied Scientific Instrumentation | I-3017 | |
| Objective heater system | Okolab | Oko Touch with objective collar | |
| Objective oil – type A | Nikon | discontinued | |
| Plan Apo VC 100x 1.40 NA objective | Nikon | MRD01901 | |
| Potassium chloride | Fisher | P217 | |
| Potassium phosphate | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium iodoacetate | Sigma-Aldrich | I2512 | |
| Syringe pump | Sage Instruments | Model 355 | |
| Tubing adapter – female | Small Parts Inc. | 1005109 | |
| Tubing adapter – male | Small Parts Inc. | 1005012 | |
| Tygon tubing | Bioptechs | 1/16" ID, 1/32" wall thickness | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | fine scissors |
References
- Hoffman, P. N., Lasek, R. J. The slow component of axonal transport. Identification of major structural polypeptides of the axon and their generality among mammalian neurons. Journal of Cell Biology. 66 (2), 351-366 (1975).
- Brown, A. Slow Axonal Transport. Reference Module in Biomedical Sciences. , (2014).
- Wang, L., Ho, C. -. L., Sun, D., Liem, R. K. H., Brown, A. Rapid movement of axonal neurofilaments interrupted by prolonged pauses. Nature Cell Biology. 2 (3), 137-141 (2000).
- Uchida, A., Monsma, P. C., Fenn, J. D., Brown, A. Live-cell imaging of neurofilament transport in cultured neurons. Methods in Cell Biology. 131, 21-90 (2016).
- Trivedi, N., Jung, P., Brown, A. Neurofilaments switch between distinct mobile and stationary states during their transport along axons. Journal of Neuroscience. 27 (3), 507-516 (2007).
- Monsma, P. C., Li, Y., Fenn, J. D., Jung, P., Brown, A. Local regulation of neurofilament transport by myelinating cells. Journal of Neuroscience. 34 (8), 2979-2988 (2014).
- Walker, C. L., et al. Local Acceleration of Neurofilament Transport at Nodes of Ranvier. Journal of Neuroscience. 39 (4), 663-677 (2019).
- Li, Y., Brown, A., Jung, P. Deciphering the axonal transport kinetics of neurofilaments using the fluorescence photoactivation pulse-escape method. Physical Biology. 11 (2), 026001 (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Breuer, A. C., et al. Fast axonal transport in amyotrophic lateral sclerosis: an intra-axonal organelle traffic analysis. Neurology. 37 (5), 738-748 (1987).
- Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, photoactivation, photoconversion, and FLIP. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (12), (2010).
- Model, M. Intensity calibration and flat-field correction for fluorescence microscopes. Current Protocols in Cytometry. 68, (2014).
- Schmidt, M. M., Dringen, R. Differential effects of iodoacetamide and iodoacetate on glycolysis and glutathione metabolism of cultured astrocytes. Frontiers in Neuroenergetics. 1, 1-10 (2009).
- Surre, J., et al. Strong increase in the autofluorescence of cells signals struggle for survival. Scientific Reports. 8 (1), 12088 (2018).
- Cox, M., Lucey, S., Sridharan, S., Cohn, J. Least Squares Congealing for Unsupervised Alignment of Images. Proceedings of the IEEE Computer Society Conference on Computer Vision and Pattern Recognition. , (2008).
- Huang, S., Heikal, A. A., Webb, W. W. Two-photon fluorescence spectroscopy and microscopy of NAD(P)H and flavoprotein. Biophysical Journal. 82 (5), 2811-2825 (2002).
- Fenn, J. D., Johnson, C. M., Peng, J., Jung, P., Brown, A. Kymograph analysis with high temporal resolution reveals new features of neurofilament transport kinetics. Cytoskeleton. 75 (1), 22-41 (2018).
- Alami, N. H., Jung, P., Brown, A. Myosin Va increases the efficiency of neurofilament transport by decreasing the duration of long-term pauses. Journal of Neuroscience. 29 (20), 6625-6634 (2009).
- Xu, Z., Tung, V. W. Temporal and Spatial Variations in Slow Axonal Transport Velocity Along Peripheral Motoneuron Axons. Neuroscience. 102 (1), 193-200 (2001).
- Jung, P., Brown, A. Modeling the Slowing of Neurofilament Transport Along the Mouse Sciatic Nerve. Physical Biology. 6 (4), 046002 (2009).
- Cohen, J. The effect size index: d. Statistical Power Analysis for the Behavioral Sciences 2nd ed. , 20-26 (1988).
- Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. Imaging axonal transport of mitochondria in vivo. Nature Methods. 4 (7), 559-561 (2007).
- Gilley, J., et al. Age-dependent axonal transport and locomotor changes and tau hypophosphorylation in a “P301L” tau knockin mouse. Neurobiology of Aging. 33 (3), 1-15 (2012).
- Marinkovic, P., et al. Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 109 (11), 4296-4301 (2012).
- Milde, S., Adalbert, R., Elaman, M. H., Coleman, M. P. Axonal transport declines with age in two distinct phases separated by a period of relative stability. Neurobiology of Aging. 36 (2), 971-981 (2015).
- Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons. Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).
