Imágenes y análisis del transporte de neurofilamento en el nervio tibial de ratón extirpado
Summary
Describimos métodos de fotoactivación de fluorescencia para analizar el transporte axonal de neurofilamentos en axones mielinados individuales de nervios periféricos de ratones transgénicos que expresan una proteína neurofilament fotoactivable.
Abstract
Los polímeros de proteína de neurofilamento se mueven a lo largo de los axones en el componente lento del transporte axonal a velocidades medias de 0,35-3,5 mm/día. Hasta hace poco el estudio de este movimiento in situ sólo era posible utilizando el etiquetado de pulsos radioisotópicos, lo que permite el análisis del transporte axonal en nervios enteros con una resolución temporal de días y una resolución espacial de milímetros. Para estudiar el transporte de neurofilamento in situ con mayor resolución temporal y espacial, desarrollamos un ratón transgénico hThy1-paGFP-NFM que expresa la proteína de neurofilament M etiquetada con GFP fotoactivable en las neuronas. Aquí describimos los métodos de fuga de pulsos y propagación de pulsos de fluorescencia para analizar el transporte de neurofilamentos en axones mielinados individuales de nervios tibiales de estos ratones ex vivo. Los segmentos nerviosos aislados se mantienen en la etapa del microscopio por perfusión con solución salina oxigenada y se visualizan mediante microscopía de fluorescencia confocal de disco giratorio. La luz violeta se utiliza para activar la fluorescencia en una ventana axonal corta. La fluorescencia en las regiones activadas y flanqueantes se analiza a lo largo del tiempo, permitiendo el estudio del transporte de neurofilamento con resolución temporal y espacial en el orden de minutos y micras, respectivamente. El modelado matemático se puede utilizar para extraer parámetros cinéticos del transporte de neurofilamento, incluyendo la velocidad, el sesgo direccional y el comportamiento de pausa de los datos resultantes. Los métodos de escape de pulsos y propagación de pulsos también se pueden adaptar para visualizar el transporte de neurofilamento en otros nervios. Con el desarrollo de ratones transgénicos adicionales, estos métodos también podrían utilizarse para crear imágenes y analizar el transporte axonal de otras proteínas citoesqueléticas y citosólicas en axones.
Introduction
El transporte axonal de neurofilamentos se demostró por primera vez en la década de 1970 mediante el etiquetado de pulsos radioisotópicos1. Este enfoque ha producido una gran cantidad de información sobre el transporte de neurofilamento in vivo,pero tiene una resolución espacial y temporal relativamente baja, típicamente en el orden de milímetros y días en el mejor2. Además, el etiquetado por pulsos radioisópicos es un enfoque indirecto que requiere la inyección y el sacrificio de múltiples animales para generar un solo curso de tiempo. Con el descubrimiento de proteínas fluorescentes y los avances en la microscopía de fluorescencia en la década de 1990, posteriormente se hizo posible imaginar el transporte de neurofilamento directamente en las neuronas cultivadas en una escala de tiempo de segundos o minutos y con resolución espacial subcrómetro, lo que ofrece una visión mucho mayor del mecanismo de movimiento3. Estos estudios han revelado que los polímeros de neurofilamento en los axones se mueven rápida e intermitentemente en direcciones anterogradas y retrógradas a lo largo de las vías de los microtúbulos, propulsados por proteínas del motor de microtúbulos. Sin embargo, los neurofilamentos son estructuras limitadas por difracción de sólo 10 nm de diámetro que normalmente están espaciadas aparte de sus vecinos por sólo decenas de nanómetros; por lo tanto, los polímeros sólo pueden ser rastreados en neuronas cultivadas que contienen neurofilamentos escasamente distribuidos para que los polímeros en movimiento puedan ser resueltos de sus vecinos4. Por lo tanto, actualmente no es posible rastrear neurofilamentos individuales en axones que contienen abundantes polímeros de neurofilamento, como axones mielinados.
Para analizar el transporte axonal de neurofilamentos en axones ricos en neurofilamento utilizando microscopía de fluorescencia, utilizamos un método de fotoactivación de fluorescencia de pulso-escape que desarrollamos para estudiar el comportamiento pausador a largo plazo de los neurofilamentos en las células nerviosas cultivadas4,,5. Los neurofilamentos etiquetados con una proteína de fusión de neurofilamento fluorescente fotoactivable se activan en un segmento corto de axón, y luego la velocidad de salida de esos filamentos de la región activada se cuantifica midiendo la descomposición de la fluorescencia con el tiempo. La ventaja de este enfoque es que es un análisis a nivel de población del transporte de neurofilamento que se puede aplicar en una escala de tiempo de minutos u horas sin la necesidad de rastrear el movimiento de polímeros de neurofilamento individuales. Por ejemplo, hemos utilizado este método para analizar la cinética del transporte de neurofilamento en cultivos mielizantes6.
Recientemente, describimos el desarrollo de un ratón transgénico hThy1-paGFP-NFM que expresa bajos niveles de una proteína de neurofilamento etiquetada con paGFP M (paGFP-NFM) en las neuronas bajo el control del promotor Thy1 específico de la neurona humana7. Este ratón permite el análisis del transporte de neurofilamento in situ utilizando microscopía de fluorescencia. En este artículo, describimos los enfoques experimentales para analizar el transporte de neurofilamento en axones mielinados de nervios tibiales de estos ratones utilizando dos enfoques. El primero de estos enfoques es el método de escape de pulsos descrito anteriormente. Este método puede generar información sobre el comportamiento de pausa de los neurofilamentos, pero es ciego a la dirección en la que los filamentos salen de la región activada, y por lo tanto no permite la medición de la direccionalidad de la red y la velocidad de transporte8. El segundo de estos enfoques es un nuevo método de propagación de pulsos en el que analizamos no sólo la pérdida de fluorescencia de la región activada, sino también el aumento transitorio de la fluorescencia en dos ventanas de flanqueo a través de las cuales los filamentos fluorescentes se mueven a medida que salen de la región activada tanto en direcciones anterogradas como retrógradas. En ambos enfoques, se pueden obtener parámetros de transporte de neurofilamento como la velocidad media, la direccionalidad de la red y el comportamiento de pausa mediante el análisis matemático y el modelado de los cambios en la fluorescencia en las ventanas de medición. La Figura 3 ilustra estos dos enfoques.
Este protocolo demuestra la disección y preparación del nervio, la activación y la toma de imágenes de la fluorescencia paGFP, y la cuantificación del transporte de neurofilamento a partir de las imágenes adquiridas utilizando el paquete de distribución FIJI de ImageJ9. Usamos el nervio tibial porque es largo (varios cm) y no se ramifica; sin embargo, en principio cualquier nervio que exprese paGFP-NFM es apropiado para su uso con esta técnica si puede ser diseccionado y desenvado sin dañar los axones.
Protocol
Representative Results
Discussion
Se debe tener cuidado en el análisis de los experimentos de fuga de pulsos y propagación de pulsos porque existe un potencial significativo para la introducción de errores durante el postprocesamiento, principalmente durante la corrección de campo plano, la alineación de la imagen y la corrección del lejía. La corrección de campo plano es necesaria para corregir la no uniformidad en la iluminación, lo que resulta en una caída de intensidad en todo el campo de visión desde el centro hasta la periferia. El grado…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a Paula Monsma por la instrucción y la asistencia con la microscopía confocal y la disección del nervio tibial y al Dr. Atsuko Uchida, Chloe Duger y Sana Chahande por su ayuda con la cría de ratones. Este trabajo fue apoyado en parte por la colaboración National Science Foundation Grants IOS1656784 to A.B. y IOS1656765 a P.J., y los Institutos Nacionales de Subvenciones de Salud R01 NS038526, P30 NS104177 y S10 OD010383 a A.B. N.P.B. fueron apoyados por una beca del Programa de Becas Postdoctorales del Presidente de la Universidad Estatal de Ohio.
Materials
| 14 x 22 Rectangle Gasket 0.1mm | Bioptechs | 1907-1422-100 | inner gasket |
| 2-deoxy-D-glucose | Sigma | D6134 | |
| 30mm Round Gasket w/ Holes | Bioptechs | 1907-08-750 | outer gasket |
| 35 x 10mm dish | Thermo Fisher | 153066 | dissection dishes |
| 40mm round coverslips | Bioptechs | 40-1313-0319 | |
| 60mL syringe – Luer-lock tip | BD | 309653 | |
| Andor Revolution WD spinning-disk confocal system | Andor | outfitted with Perfect Focus and FRAPPA systems | |
| Calcium chloride | Fisher | C79 | |
| Coverslips | Fisher | 12-541-B | for fluorescein slide |
| D-(+)-glucose solution | Sigma | G8769 | |
| Dissecting pins | Fine Science Tools | 26001-70 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | fine tipped forceps |
| Dissection microscope | Zeiss | 47 50 03 | |
| Dissection pan with wax | Ginsberg Scientific | 568859 | |
| Dissection scissors | Fine Science Tools | 14061-09 | initial dissection scissors |
| FCS2 perfusion chamber | Bioptechs | 060319-2-03 | |
| Fluorescein sodium | Fluka | 46960 | |
| Inline solution heater | Warner Instruments | SH27-B | |
| Laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | initial dissection forceps |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Microaqueduct slide | Bioptechs | 130119-5 | |
| Microscope slides | Fisher | 12-544-3 | for fluorescein slide |
| Microscope stage insert | Applied Scientific Instrumentation | I-3017 | |
| Objective heater system | Okolab | Oko Touch with objective collar | |
| Objective oil – type A | Nikon | discontinued | |
| Plan Apo VC 100x 1.40 NA objective | Nikon | MRD01901 | |
| Potassium chloride | Fisher | P217 | |
| Potassium phosphate | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium iodoacetate | Sigma-Aldrich | I2512 | |
| Syringe pump | Sage Instruments | Model 355 | |
| Tubing adapter – female | Small Parts Inc. | 1005109 | |
| Tubing adapter – male | Small Parts Inc. | 1005012 | |
| Tygon tubing | Bioptechs | 1/16" ID, 1/32" wall thickness | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | fine scissors |
References
- Hoffman, P. N., Lasek, R. J. The slow component of axonal transport. Identification of major structural polypeptides of the axon and their generality among mammalian neurons. Journal of Cell Biology. 66 (2), 351-366 (1975).
- Brown, A. Slow Axonal Transport. Reference Module in Biomedical Sciences. , (2014).
- Wang, L., Ho, C. -. L., Sun, D., Liem, R. K. H., Brown, A. Rapid movement of axonal neurofilaments interrupted by prolonged pauses. Nature Cell Biology. 2 (3), 137-141 (2000).
- Uchida, A., Monsma, P. C., Fenn, J. D., Brown, A. Live-cell imaging of neurofilament transport in cultured neurons. Methods in Cell Biology. 131, 21-90 (2016).
- Trivedi, N., Jung, P., Brown, A. Neurofilaments switch between distinct mobile and stationary states during their transport along axons. Journal of Neuroscience. 27 (3), 507-516 (2007).
- Monsma, P. C., Li, Y., Fenn, J. D., Jung, P., Brown, A. Local regulation of neurofilament transport by myelinating cells. Journal of Neuroscience. 34 (8), 2979-2988 (2014).
- Walker, C. L., et al. Local Acceleration of Neurofilament Transport at Nodes of Ranvier. Journal of Neuroscience. 39 (4), 663-677 (2019).
- Li, Y., Brown, A., Jung, P. Deciphering the axonal transport kinetics of neurofilaments using the fluorescence photoactivation pulse-escape method. Physical Biology. 11 (2), 026001 (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Breuer, A. C., et al. Fast axonal transport in amyotrophic lateral sclerosis: an intra-axonal organelle traffic analysis. Neurology. 37 (5), 738-748 (1987).
- Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, photoactivation, photoconversion, and FLIP. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (12), (2010).
- Model, M. Intensity calibration and flat-field correction for fluorescence microscopes. Current Protocols in Cytometry. 68, (2014).
- Schmidt, M. M., Dringen, R. Differential effects of iodoacetamide and iodoacetate on glycolysis and glutathione metabolism of cultured astrocytes. Frontiers in Neuroenergetics. 1, 1-10 (2009).
- Surre, J., et al. Strong increase in the autofluorescence of cells signals struggle for survival. Scientific Reports. 8 (1), 12088 (2018).
- Cox, M., Lucey, S., Sridharan, S., Cohn, J. Least Squares Congealing for Unsupervised Alignment of Images. Proceedings of the IEEE Computer Society Conference on Computer Vision and Pattern Recognition. , (2008).
- Huang, S., Heikal, A. A., Webb, W. W. Two-photon fluorescence spectroscopy and microscopy of NAD(P)H and flavoprotein. Biophysical Journal. 82 (5), 2811-2825 (2002).
- Fenn, J. D., Johnson, C. M., Peng, J., Jung, P., Brown, A. Kymograph analysis with high temporal resolution reveals new features of neurofilament transport kinetics. Cytoskeleton. 75 (1), 22-41 (2018).
- Alami, N. H., Jung, P., Brown, A. Myosin Va increases the efficiency of neurofilament transport by decreasing the duration of long-term pauses. Journal of Neuroscience. 29 (20), 6625-6634 (2009).
- Xu, Z., Tung, V. W. Temporal and Spatial Variations in Slow Axonal Transport Velocity Along Peripheral Motoneuron Axons. Neuroscience. 102 (1), 193-200 (2001).
- Jung, P., Brown, A. Modeling the Slowing of Neurofilament Transport Along the Mouse Sciatic Nerve. Physical Biology. 6 (4), 046002 (2009).
- Cohen, J. The effect size index: d. Statistical Power Analysis for the Behavioral Sciences 2nd ed. , 20-26 (1988).
- Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. Imaging axonal transport of mitochondria in vivo. Nature Methods. 4 (7), 559-561 (2007).
- Gilley, J., et al. Age-dependent axonal transport and locomotor changes and tau hypophosphorylation in a “P301L” tau knockin mouse. Neurobiology of Aging. 33 (3), 1-15 (2012).
- Marinkovic, P., et al. Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 109 (11), 4296-4301 (2012).
- Milde, S., Adalbert, R., Elaman, M. H., Coleman, M. P. Axonal transport declines with age in two distinct phases separated by a period of relative stability. Neurobiology of Aging. 36 (2), 971-981 (2015).
- Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons. Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).
