ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
Внутривенное введение раковых клеток часто используется в исследованиях метастазирования, но метастатическую опухолевую нагрузку может быть трудно проанализировать. Здесь мы демонстрируем модель инъекции метастазирования в хвостовую вену и включаем новый подход к анализу результирующей метастатической опухолевой нагрузки на легкие.
Abstract
Метастазы, основная причина заболеваемости и смертности для большинства больных раком, могут быть сложными для доклинического моделирования у мышей. Доступно несколько моделей спонтанного метастазирования. Таким образом, экспериментальная модель метастазирования, включающая инъекцию в хвостовую вену подходящих клеточных линий, является основой исследований метастазирования. Когда раковые клетки вводятся в боковую хвостовую вену, легкие являются их предпочтительным местом колонизации. Потенциальным ограничением этого метода является точная количественная оценка метастатической опухолевой нагрузки на легкие. В то время как некоторые исследователи подсчитывают макрометастазы заранее определенного размера и / или включают микрометастазы после разрезания ткани, другие определяют область метастатических поражений относительно нормальной области ткани. Оба этих метода количественной оценки могут быть чрезвычайно сложными, когда метастатическая нагрузка высока. Здесь мы демонстрируем внутривенную инъекционную модель метастазирования в легких с последующим передовым методом количественной оценки метастатической опухолевой нагрузки с использованием программного обеспечения для анализа изображений. Этот процесс позволяет исследовать несколько параметров конечной точки, включая средний размер метастазирования, общее количество метастазов и общую площадь метастазирования, для обеспечения всестороннего анализа. Кроме того, этот метод был рассмотрен ветеринарным патологоанатомом, сертифицированным Американским колледжем ветеринарных патологов (SEK), для обеспечения точности.
Introduction
Несмотря на то, что метастазирование является очень сложным и неэффективным процессом1, оно вносит значительный вклад в заболеваемость и смертность больных раком2. Фактически, большинство смертей, связанных с раком, объясняются метастатическим распространением болезни3,4. Для того, чтобы опухолевые клетки успешно метастазировали, они должны отделяться от первичного участка, вторгаться через прилегающую строму, интравазать в кровообращение или лимфатическую систему, перемещаться в капиллярное русло вторичного участка, экстравазировать во вторичную ткань и размножаться или расти с образованием метастатических поражений5. Использование мышиных моделей имеет решающее значение для дальнейшего понимания молекулярных механизмов, ответственных за метастатическое посев и рост6,7. Здесь мы фокусируемся на метастазировании рака молочной железы, для которого часто используются как генетически модифицированные мышиные модели, так и методы трансплантации – каждый со своим набором преимуществ и ограничений.
Генетически модифицированные модели опухолей молочной железы используют специфические промоторы молочной железы, включая MMTV-LTR (длинный терминальный повтор вируса опухоли молочной железы мыши) и WAP (сывороточный кислотный белок), для стимулирования экспрессии трансгенов в эпителии молочной железы8. Онкогены, включая полиомный средний Т-антиген (PyMT), ErbB2/Neu, c-Myc, Wnt-1 и обезьяний вирус 40 (SV40), были экспрессированы таким образом9,10,11,12,13, и хотя эти генетические модели полезны для изучения первичного инициации и прогрессирования опухоли, немногие легко метастазируют в отдаленные органы. Кроме того, эти генетические мышиные модели часто являются более временными и дорогостоящими, чем модели спонтанного или экспериментального метастазирования. Учитывая ограниченность большинства генетически модифицированных моделей опухолей молочной железы для изучения метастазирования, методы трансплантации стали привлекательными методами изучения этого сложного процесса. Это включает в себя ортотопическую, заднюю вену, внутрисердечную и внутричерепную инъекцию подходящих клеточных линий.
Хотя несколько клеточных линий рака молочной железы легко метастазируют после ортотопической инъекции в жировую прокладку молочной железы14,15, консистенция и воспроизводимость метастатической опухолевой нагрузки могут быть проблемой, а продолжительность таких исследований может составлять порядка нескольких месяцев. Для оценки метастазирования в легких, в частности, внутривенная инъекция в хвостовую вену часто является более воспроизводимым и эффективным по времени методом с метастатическим распространением, обычно происходящим в течение нескольких недель. Однако, поскольку модель внутривенной инъекции обходит начальные этапы метастатического каскада, необходимо проявлять осторожность при интерпретации результатов этих исследований. В этой демонстрации мы показываем инъекцию опухолевых клеток молочной железы в хвостовую вену вместе с точным и комплексным методом анализа.
Несмотря на то, что исследовательское сообщество добилось значительного прогресса в понимании сложного процесса метастазирования рака молочной железы, по оценкам, более 150 000 женщин в настоящее время имеют метастатический рак молочной железы16. Из пациентов с раком молочной железы IV стадии >36% пациентов имеют метастазы в легкие17; однако сайт-специфическая картина и частота метастазов могут варьироваться в зависимости от молекулярного подтипа18,19,20,21. Пациенты с метастазами в легкие, связанными с раком молочной железы, имеют среднюю выживаемость всего 21 месяц, что подчеркивает необходимость выявления эффективных методов лечения и новых биомаркеров этого заболевания17. Использование экспериментальных моделей метастазирования, включая внутривенную инъекцию опухолевых клеток, будет продолжать расширять наши знания об этой важной клинической проблеме. В сочетании с патологией цифровой визуализации и методом анализа метастатической опухоли легкого, описанным в этом протоколе, инъекции в заднюю вену являются ценным инструментом для исследования метастазирования рака молочной железы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Использование животных соответствовало правилам Университета по ресурсам лабораторных животных (ULAR) в соответствии с утвержденным протоколом 2007A0120-R4 (PI: Dr. Gina Sizemore) Институциональным комитетом по уходу и использованию животных OSU (IACUC).
1. Инъекция клеток рака молочной железы в хвостовую вену
- Подготовка клеток и шприца к инъекциям
- Нанесите соответствующее количество клеток в зависимости от количества мышей и концентрации клеток, которые будут использоваться.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество вводимых клеток и время до развития метастазов будут зависеть от используемой клеточной линии и должны быть оптимизированы. В этой демонстрации 1 x 106 клеток MDA-MB-231 вводят внутривенно мышам NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG), а макроскопические поражения легких наблюдаются не позднее, чем через 24 дня после инъекции. Для клеточной линии опухоли молочной железы MVT1 3 x 106 вводят иммунокомпетентным мышам FVB/N с многочисленными метастазами в легкие, наблюдаемыми 14 дней22,23. - Аспиратная среда и промывка ячеек пластин с 1x PBS. Трипсинизируют клетки в минимальном объеме, добавляют соответствующий объем среды и подсчитывают клетки с помощью гематоцитометра или другого предпочтительного метода. Трипан синий (0,4%) или другие красители живых / мертвых клеток могут быть использованы для определения количества жизнеспособных клеток.
- Грануляторы путем вращения при 180 х г в течение 5 мин.
- Повторно суспендировать соответствующее количество клеток в стерильном 1x PBS таким образом, чтобы объем 100 мкл вводился на мышь. Держите клеточную суспензию на льду для поддержания жизнеспособности.
- Перед инъекцией тщательно повторно суспендируйте клетки пипеткой 200 мкл или 1 мл, чтобы избежать слипания. Наберите 100 мкл в инсулиновом шприце 28 г (см. Таблицу материалов).
- Устраните любые пузырьки воздуха, удерживая шприц вертикально, постукивая по шприцу и медленно регулируя плунжер. Инъекция пузырьков воздуха в вену, вероятно, вызовет воздушную / газовую эмболию, которая может быть фатальной.
- Нанесите соответствующее количество клеток в зависимости от количества мышей и концентрации клеток, которые будут использоваться.
- Инъекция боковой хвостовой вены
ПРИМЕЧАНИЕ: Для экспериментальных анализов метастазирования рака молочной железы инъекции проводятся > 6-недельным самкам мышей.- Обведите мышь за хвост и сдвиньте животное в щелевую трубку/удерживающее устройство соответствующего размера (см. Таблицу материалов для используемого удерживающего устройства).
- Вставьте заглушку удерживающего устройства и расположите мышь на боку таким образом, чтобы ее боковая хвостовая жилка была легко просматриваемой. Мышь имеет вентральную артерию на одной линии с гениталиями, дорсальную вену и две боковые хвостовые вены.
- Очистите поверхность хвоста мыши асептической салфеткой. Возьмите хвост между указательным и большим пальцами недоминирующей рукой и приложите небольшое напряжение.
- Начиная с дистальной части хвоста, вставьте иглу параллельно вене со скосом в конце.
- Если это разрешено, тщательно подведите итоги иглы и согните под углом 20-30°. Настоятельно рекомендуется использовать одноручный подход или устройство для повторного нанесения иглы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Нет необходимости аспирировать, так как это может привести к коллапсу вены. Тем не менее, небольшая вспышка крови может быть замечена при первом размещении. Игла будет плавно продвигаться в вену при правильном размещении. - Медленно дозируйте весь объем в вену. Не должно быть сопротивления при нажатии плунжера.
- Если чувствуется какое-либо сопротивление, своевременно извлеките шприцевую иглу. При необходимости повторно вводят иглу (в идеале не более 3 попыток), двигаясь в сторону проксимального конца хвоста или противоположной боковой вены.
- Небольшой объем крови, скорее всего, будет вытеснен после инъекции. Нанесите мягкое давление стерильной марлей и протрите асептической салфеткой.
- Своевременно утилизируйте шприц в соответствующий контейнер для острых предметов.
- Верните мышь в чистую, вентилируемую клетку и следите за признаками дистресса.
- Контролируйте мышей 2-3 раза в неделю на наличие признаков образования метастазов (затрудненное дыхание, сгорбленная осанка, потеря веса) и общего дистресса. Время до развития метастазирования будет зависеть от клеточной линии и штамма мыши.
- При использовании устройства визуализации живых животных in vivo изображение мышей сразу после инъекции в хвостовую вену для подтверждения успешной инъекции клеток и получения данных о времени «нуля» (конкретные сведения о биолюминесцентной визуализации in vivo не включены в настоящий документ, но описаны Yang et al.24).
2. Фиксация легочной ткани и анализ метастатической опухолевой нагрузки легкого
- Инфляция легочной ткани для поддержания структурного формата легких при гистопатологии
- После выполнения утвержденных процедур эвтаназии (например, углекислого газа при смещении 30 - 70% объема камеры в минуту) закрепите тушу мыши на рассеченной доске с помощью штифтов. Либо распылите, либо нанесите 70% этанола, чтобы шерсть мыши не мешала во время рассечения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Удушье углекислого газа может вызвать легочное кровоизлияние в качестве ожидаемого фонового поражения, особенно при более медленных скоростях потока. - Откройте грудную клетку с помощью разреза средней линии, вытяните разрез краниально / каудально через брюшину и отрежьте диафрагму, захватив клифозный отросток.
- Используя отдельный набор ножниц, чтобы не затупить лезвия, отрежьте ребра вдоль каждой стороны грудины и аккуратно удалите грудную клетку, оставив место для расширения легких.
- Изолируют трахею путем удаления подчелюстных слюнных желез и инфрагиоидной мускулатуры. Размещение штифтов по обе стороны трахеи может предотвратить нежелательное движение во время введения иглы.
- Заполните шприц весом 26 г 2-3 мл 10% нейтрального буферизованного формалина и вставьте в трахею.
- Медленно вводите формалин и следите за расширением легких (обычно требуется ~ 1,5 мл формалина).
- Как только формалин начнет вытекать из легких (избегайте чрезмерной инфляции), отщипните трахею парой щипцов, удалите шприцевую иглу и отсоедините весь дыхательный аппарат. Поместите легкие, сердце и т. Д. Непосредственно в формалин, так как дополнительная обрезка ткани может быть сделана после фиксации.
- Полная обработка, встраивание, сечение ткани, а также окрашивание гематоксилином и эозином (H & E) с использованием стандартных методов.
- После выполнения утвержденных процедур эвтаназии (например, углекислого газа при смещении 30 - 70% объема камеры в минуту) закрепите тушу мыши на рассеченной доске с помощью штифтов. Либо распылите, либо нанесите 70% этанола, чтобы шерсть мыши не мешала во время рассечения.
- Анализ метастатической опухолевой нагрузки легкого
- Сканирование окрашенных H&E участков легких на слайд-сканере высокого разрешения с 40-кратным увеличением (рисунок 3).
- Импорт изображений в программное обеспечение для анализа изображений (например, Visiopharm Image Analysis) для количественной оценки метастазов в легких.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем новым пользователям пройти обучение на месте или в режиме онлайн для использования программного обеспечения для анализа изображений. Многочисленные вебинары также доступны через коммерческую веб-страницу. - Выберите приложение Visiopharm 10118 H&E Lung Metastasis App из библиотеки приложений программного обеспечения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Целью этого приложения является маркировка и количественная оценка метастазирования в легких на слайдах, окрашенных H&E. В рамках приложения 10118 H&E Lung Metastasis App первый этап обработки изображений сегментирует легочную ткань с помощью приложения Tissue Detection. На втором этапе обработки изображений используется приложение Metastasis Detect, которое идентифицирует метастазы внутри легочной ткани. Метастазы идентифицируются по форме вместе с областями, которые либо слишком деформированы, либо слишком красные, либо слишком редкие, чтобы быть идентифицированными как метастазы. - Отрегулируйте параметры, определяющие форму и разреженность, чтобы наилучшим образом соответствовать репрезентативным изображениям. Сегментированные участки метастазов опухоли и нормальная легочная ткань могут отображаться с использованием различных цветовых меток для каждого типа ткани.
ПРИМЕЧАНИЕ: В случае, если приложение не может точно отделить метастазы от нормальной легочной ткани, может потребоваться написать пользовательское приложение, использующее программу Visiopharm Decision Forest, как это было сделано для экспериментов (см. Рисунок 2 и Рисунок 3). Подробная информация о написании пользовательского алгоритма приведена ниже. В противном случае перейдите к шагу 2.2.9. - Откройте программу Decision Forest, которая работает путем обучения нескольких классов [т. Е. Легочная ткань (неопуляционная), метастазы, эритроциты, эпителий и / или белое пространство] на желаемом изображении. На рисунке 2 метастазы опухоли синие, нормальная ткань зеленая, а бронхиолярный эпителий желтый. Кроме того, красные кровяные тельца находятся в красном, а воздушные пространства в розовом.
- Следуйте предложенной серии вопросов «да» или «нет», чтобы соответствующим образом обучить каждый класс для изображения. Точность алгоритма будет определять количество вопросов «да/нет». Для анализа пользовательский алгоритм/приложение был написан с точностью, установленной на 50 (диапазон 0-100).
- Настройте функции для каждого класса, применив фильтры для резкости, размытия, сортировки по форме и т. Д., Чтобы повысить точность алгоритма /приложения. Visiopharm рассматривает каждый класс через одну или несколько линз, известных как функции. Функции изменяют способ просмотра изображения классом , чтобы выявить определенные цвета или интенсивности.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для пользовательского алгоритма метастазы размером 8500 мкм2 и выше маркируются и измеряются как метастазы. Это объясняет дисперсию размера и метастазы, слишком малые для обнаружения. Небольшие деформированные участки и небольшие метастатические участки под 8500 мкм2 были включены в нормальную количественную оценку тканей. - Сохраните измененные настройки из приложения или пользовательского алгоритма, а затем примените алгоритм/приложение ко всему набору или серии тканей, окрашенных H&E.
- Наконец, экспортируйте все выходные переменные, включая переменные, перечисленные в таблице 1. Площадь в микронах в квадрате (мкм2) может быть количественно определена для каждого типа ткани, и проценты получены из общей чистой площади ткани образца (т.е. общей ткани минус воздушное пространство).
- При создании пользовательского алгоритма просмотрите разметку тканей в консультации с ветеринарным патологоанатомом, сертифицированным Американским колледжем ветеринарных патологов, чтобы обеспечить точные измерения и дифференцировать типы тканей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
При использовании немаркированных клеток для инъекции в хвостовую вену может быть трудно подтвердить колонизацию легких до (1) времени некропсии, если могут наблюдаться макрометастазы, или (2) после гистологического анализа, если существуют микроскопические метастазы. При обширной метастатической опухолевой нагрузке на легкие у мышей будет затрудненное дыхание. Как и при любом исследовании опухоли, мыши должны тщательно контролироваться на протяжении всей продолжительности исследования. Использование меченых клеток является простым способом подтверждения успешной инъекции в хвостовую вену; следовательно, использование помеченных люциферазой клеток MDA-MB-231 в демонстрации. Однако визуализация in vivo не всегда возможна или необходима в зависимости от экспериментальной конструкции и других факторов. На рисунке 1А показан сигнал биолюминесценции в грудном пространстве менее чем через 2 часа после инъекции в хвостовую вену клеток MDA-MB-231, помеченных люциферазой, в качестве подтверждения точной инъекции. Для этого эксперимента количество фотонов в грудной области увеличивается с течением времени, и сильный сигнал биолюминесценции присутствует на 24-м дне после инъекции (рисунок 1B и C; обратите внимание на изменение шкалы шкалы). Во время некропсии у этих мышей наблюдалось много макроскопических поражений легких (рисунок 1D).
После надлежащей обработки тканей и окрашивания участки легких, окрашенные H&E, могут быть отсканированы или визуализированы. Количественная оценка метастатической опухоли легкого может быть эффективно достигнута с использованием программного обеспечения для анализа изображений и пользовательского алгоритма. Используя настраиваемый алгоритм, вся легочная ткань сегментируется различными особенностями ткани (рисунок 2A и B). Сегментируя легочную ткань таким образом, программное обеспечение может количественно оценить различные параметры, перечисленные в таблице 1. Этот анализ был проведен на легочной ткани у мышей, которым вводили клетки MDA-MB-231 с последующим лечением препаратом, предназначенным для блокирования метастатической колонизации или контроля транспортного средства (DMSO). Исходные данные этого анализа приведены в таблице 2. Кроме того, на рисунке 3А показаны репрезентативные изображения H&E метастазов MDA-MB-231 в легких от мышей, получавших ДМСО или обработанных лекарственными препаратами. Хотя разница в метастатической опухолевой нагрузке между этими группами лечения, возможно, была легко упущена из виду, поскольку общее количество легочных узелков ничем не отличается, всесторонний анализ всех параметров указывает на значительную разницу в проценте чистой области метастазирования в легких (рисунок 3B, C). Это подчеркивает необходимость комплексного и тщательного подхода к анализу метастатической опухолевой нагрузки легкого, такого как способ, описанный в настоящем описании.
Для данных, представленных на рисунке 3, все статистические анализы проводились с использованием GraphPad Prism 7. Данные считались нормально распределенными при прохождении любого из следующих стандартных тестов на нормальность: омнибус Д'Агостино-Пирсона, Шапиро-Вилка и Колмогорова-Смирнова. Сравнение между транспортным средством и группами, получавшими наркотики (рисунок 3), проводилось с помощью непарного двуххвостого т-теста студента. Статистическая значимость установлена на уровне P ≤ 0,05.
Рисунок 1: Подтверждение биолюминесценции in vivo успешной инъекции хвостовой вены.
(A) Репрезентативный сигнал биолюминесценции у мышей через 1 час после инъекции в хвостовую вену клеток MDA-MB-231, помеченных люциферазой. (B) Репрезентативный сигнал биолюминесценции у той же группы мышей, что и (A) через 24 дня после инъекции в хвостовую вену клеток MDA-MB-231, помеченных люциферазой. [Обратите внимание на изменение шкалы между подпунктами (A) и (B)]. (C) Количественная оценка количества фотонов с течением времени у мышей, которым вводили хвостовую вену MDA-MB-231. Полосы ошибок представляют собой среднее ± SEM. (n = 8 мышей) (D) Репрезентативные неопухолевые легочной ткани (справа) и макрометастазов MDA-MB-231 в легких (слева) во время некропсии. Шкала = 50 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Сегментация тканей с помощью программного обеспечения Visiopharm.
(A) Репрезентативные фрагменты несегментированных и сегментированных тканевых наценок с использованием индивидуального программного алгоритма. (B) Условные обозначения для всех категорий тканей, сегментированных с помощью программного обеспечения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Репрезентативный анализ метастатической опухоли легких тканей, окрашенных H&E.
(A) Репрезентативное окрашивание H&E легочной ткани у неинъецированных мышей и контрольных мышей (DMSO) и мышей, получавших лечение лекарственными препаратами, после инъекции клеток MDA-MB-231 в хвостовую вену. Репрезентативные метастазы опухоли обозначены стрелками. Шкала стержней = 500 мкм для 4-кратного увеличения и 200 мкм для 10-кратного увеличения. (B) График процентной чистой области метастазирования в легких контрольных и обработанных препаратами мышей. Полосы ошибок представляют среднее ± SD. (*) P = 0,022 по t-тесту Стьюдента. (C) Таблица, обобщающая анализ метастатической опухоли легкого (n = 9 DMSO; n = 9 обработанных препаратом). После проверки нормального распределения данных все P-значения в таблице определялись непарным t-тестом двуххвостого студента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Параметр | Описание | |
| Общая площадь ткани (мкм2) | Площадь в квадратных микронах включает все метастазы опухоли, нормальные легкие и участки эритроцитов. | |
| Количество метастазов | Общее количество метастазов в легочной ткани. | |
| Процент площади метастазирования (мкм2) | Общая площадь метастазирования, разделенная на площадь чистой ткани х 100. | |
| Общая ткань + площадь белого пространства (мкм2) | Площадь в квадратных микронах с учетом всех тканей и белого пространства. | |
| Площадь чистой ткани (мкм2) | Площадь тканей в квадратных микронах (метс и нормальное легкое) без белого пространства и эритроцитов. | |
| Общая площадь метастазирования (мкм2) | Общая площадь метастазирования в квадратных микронах сегментирована алгоритмом Decision Forest. | |
| Средняя площадь метастазирования (мкм2) | Средняя (средняя) площадь в квадратных микронах метастазов в пределах каждого изображения. | |
| Срединная площадь метастазирования (мкм2) | Срединная площадь метастазирования в квадратных микронах. Равное количество метастазов опускается ниже этого значения и равное количество метастазов больше медианного значения. | |
Таблица 1: Параметры, измеренные с помощью программного обеспечения. Список параметров вместе с описанием каждого измерения, которое вычисляется с помощью пользовательского алгоритма.
| Скользить | Количество метастазов | Процент площади метастазирования (мкм2) | Общая ткань + площадь белого пространства (мкм2) | Общее пространство (мкм2) | Площадь чистой ткани (мкм2) | Общая площадь метастазирования (мкм2) | Площадь эритроцитов (мкм2) | Средняя площадь метастазирования (мкм2) | Срединная площадь метастазирования (мкм2) |
| 171 Легкий слайд 1 | 435 | 8.90 | 185698000 | 83201800 | 92031400 | 8189250 | 10464800 | 18825.86 | 14748.73 |
| 171 Легкий слайд 2 | 323 | 8.37 | 185698000 | 83201800 | 92054740 | 7708990 | 10441460 | 23866.84 | 14748.73 |
| 172 Легкие Слайд 1 | 151 | 2.73 | 181546000 | 89509904 | 81571296 | 2225220 | 10464800 | 14736.56 | 12486.37 |
| 172 Легкие Слайд 2 | 142 | 2.60 | 170708000 | 81735504 | 80558196 | 2093040 | 8414300 | 14739.72 | 12119.62 |
| 173 Легкие Слайд 1 | 634 | 11.60 | 234104992 | 102153000 | 115606692 | 13406800 | 16345300 | 21146.37 | 15472.22 |
| 173 Легкие Слайд 2 | 667 | 12.70 | 223180992 | 86778600 | 122374592 | 15542700 | 14027800 | 23302.40 | 16531.00 |
| 174 Легкие Слайд 1 | 40 | 0.55 | 192452992 | 80340896 | 87591096 | 485121 | 24521000 | 12128.03 | 10484.05 |
| 174 Легкие Слайд 2 | 34 | 0.51 | 183918000 | 71287904 | 91242796 | 464830 | 21387300 | 13671.47 | 11181.81 |
| 175 Легкие Слайд 1 | 780 | 23.93 | 179544992 | 44799200 | 126995782 | 30388600 | 7750010 | 38959.74 | 19307.76 |
| 175 Легкий слайд 2 | 1001 | 12.58 | 169191536 | 43425608 | 120610754 | 15169100 | 5155174 | 15153.95 | 19703.08 |
| 188 Легкие Слайд 1 | 569 | 13.20 | 162290000 | 54210000 | 98486310 | 12997300 | 9593690 | 22842.36 | 14463.91 |
| 188 Легкая горка 2 | 271 | 5.15 | 157146000 | 54250800 | 91996500 | 4738100 | 10898700 | 17483.76 | 12657.83 |
| 189 Легкие Слайд 1 | 74 | 1.70 | 185292992 | 95700800 | 77779392 | 1318820 | 11812800 | 17821.89 | 14551.08 |
| 189 Легкая горка 2 | 74 | 1.76 | 182272992 | 95700800 | 74759392 | 1318820 | 11812800 | 17821.89 | 14551.08 |
| 816 Легкий слайд 1 | 246 | 5.65 | 185876000 | 87568896 | 81916204 | 4631050 | 16390900 | 18825.41 | 14371.99 |
| 816 Легкие Слайд 2 | 565 | 6.05 | 183220000 | 76954304 | 90305396 | 5462670 | 15960300 | 9668.44 | 14244.82 |
| 876 Легкий слайд 1 | 468 | 10.36 | 208308000 | 99300096 | 100947064 | 10454500 | 8060840 | 22338.68 | 16011.37 |
| 876 Легкий слайд 2 | 528 | 11.74 | 199750896 | 81642568 | 110450391 | 12963400 | 7657937 | 24551.89 | 16699.13 |
| 877 Легкий слайд 1 | 732 | 17.98 | 219340992 | 99918600 | 107869992 | 19397100 | 11552400 | 26498.77 | 18137.52 |
| 877 Легкие Слайд 2 | 605 | 14.64 | 207925504 | 88539712 | 108168329 | 15839700 | 11217463 | 26181.32 | 18014.64 |
| 878 Легочный слайд 1 | 377 | 10.05 | 178534000 | 85610896 | 81931104 | 8232340 | 10992000 | 21836.45 | 16671.03 |
| 878 Легкие Слайд 2 | 376 | 9.88 | 170544000 | 75337904 | 86108406 | 8511710 | 9097690 | 22637.53 | 16754.38 |
| 879 Легкие Слайд 1 | 205 | 5.22 | 167556000 | 89999000 | 68123630 | 3553860 | 9433370 | 17335.90 | 13845.69 |
| 879 Легкий Слайд 2 | 213 | 4.64 | 167931008 | 80789400 | 78489588 | 3638720 | 8652020 | 17083.19 | 14058.12 |
| 881 Легкий слайд 1 | 1122 | 38.81 | 218880000 | 79713504 | 130893816 | 50802300 | 8272680 | 45278.34 | 22044.99 |
| 881 Легкая горка 2 | 628 | 21.67 | 184200992 | 74502600 | 99122692 | 21475200 | 10575700 | 34196.18 | 19857.40 |
| 882 Легкий слайд 1 | 678 | 24.05 | 194476992 | 83941904 | 98484788 | 23684500 | 12050300 | 34932.89 | 20748.06 |
| 882 Легкая горка 2 | 645 | 21.93 | 185537040 | 75790040 | 101412430 | 22241700 | 8334570 | 34483.26 | 20325.11 |
| 883 Легкие Слайд 1 | 429 | 10.79 | 179400992 | 84955696 | 84699866 | 9138800 | 9745430 | 21302.56 | 15080.23 |
| 883 Легкий слайд 2 | 342 | 85.30 | 175220992 | 76210896 | 90472386 | 77170200 | 8537710 | 225643.86 | 17078.26 |
| 884 Легкий слайд 1 | 359 | 6.42 | 206751008 | 87752600 | 103825008 | 6669710 | 15173400 | 18578.58 | 14333.41 |
| 884 Легкий слайд 2 | 480 | 9.12 | 200990000 | 77052496 | 111060804 | 10125700 | 12876700 | 21095.21 | 15679.88 |
| 885 Легкий слайд 1 | 332 | 7.79 | 191398000 | 92896304 | 84752596 | 6605490 | 13749100 | 19896.05 | 14500.11 |
| 885 Легкие Слайд 2 | 537 | 81.02 | 187475008 | 85938000 | 89378408 | 72411104 | 12158600 | 134843.77 | 15360.29 |
| 886 Легкий слайд 1 | 305 | 7.93 | 158435008 | 80433296 | 76541662 | 6068720 | 1460050 | 19897.44 | 14500.11 |
| 886 Легкие Слайд 2 | 898 | 8.84 | 155460000 | 70808600 | 83457470 | 7380490 | 1193930 | 8218.81 | 14744.92 |
Таблица 2: Репрезентативная таблица результатов. Таблица результатов по каждому параметру алгоритма из когорты мышей хвостовой вены, которым вводили клетки MDA-MB-231.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Поскольку исследователи продолжают использовать внутривенную инъекцию опухолевых клеток в качестве экспериментальной модели метастазирования, стандартные методы анализа результирующей метастатической опухолевой нагрузки отсутствуют. В некоторых случаях могут наблюдаться значительные различия в метастатической опухолевой нагрузке при манипулировании конкретными клеточными линиями и/или использовании химических соединений. Однако в других случаях тонкие различия в метастатическом посеве и росте могут быть упущены из виду или неправильно истолкованы без тщательного патологического анализа. Это исследование продвигает ранее опубликованные протоколы инъекций хвостовой вены, включая комплексный метод анализа метастатической опухоли легкого. Важно отметить, что этот метод цифрового анализа патологии также может быть применен для количественной оценки метастатической опухолевой нагрузки легких после ортотопической инъекции опухолевых клеток, которые способны к спонтанному метастазированию, а также для других экспериментальных моделей метастазирования (т.е. внутрисердечных и т.д.) и моделей ксенотрансплантата пациента (PDX). Использование цифровой визуализации и разработки алгоритма программного обеспечения ветеринарными патологоанатомами обеспечивает воспроизводимость, точность и тщательность такого подхода к анализу метастатической опухолевой нагрузки легких25.
Продуманное решение клеточных линий, концентрации клеток и конечных точек на основе либо ранее опубликованных исследований, либо тщательной экспериментальной оптимизации абсолютно необходимо. Учитывая, что метастатический посев и колонизация сильно зависят от взаимодействия с различными популяциями иммунных клеток26,27, использование иммунокомпетентных мышей является идеальным, хотя и не всегда осуществимым. По этой же причине интерпретацию экспериментальных исследований метастазирования с использованием атипичных или NSG мышей, у которых отсутствуют ключевые компоненты иммунных клеток, следует принимать с осторожностью. Существует несколько клеточных линий опухоли молочной железы мышей, включая клетки MVT1, используемые в этом исследовании, которые были получены из штамма мыши FVB / N22,28,29. Существуют и другие сингенные модели. Что касается концентрации клеток, инъекция большого количества клеток может значительно ускорить и усилить метастатическую опухолевую нагрузку на легкие. Однако, если легкие перегружены, может быть трудно различить отдельные метастатические очаги и эмболы более вероятны. Кроме того, процедура инъекции хвостовой вены требует достаточной практики и обучения, прежде чем безопасно и / или регулярно выполнять инъекции. Многие учреждения будут предлагать техническую подготовку и могут предоставлять мышей для практических целей. Правильное размещение иглы и плавный укол должны свидетельствовать об успехе; однако для целей обучения / практики краситель Evans Blue может быть использован для определения успешной инъекции (1% в стерильном PBS). Конечности мыши станут синими вскоре после инъекции, но животное должно быть усыплено впоследствии.
Кроме того, важность стандартных методов некропсии и отбора проб тканей для контроля и предотвращения артефактов скольжения, которые могут ухудшить сканирование и анализ слайдов программным обеспечением для анализа изображений, не может быть достаточно подчеркнута. Инфляция легких во время некропсии является критическим шагом в поддержании целостности тканей и улучшает последующее окрашивание H & E, а также окончательный анализ. Для согласованности с разрешением и воспроизводимостью рекомендуется, чтобы все слайды в наборе исследования сканировались с одной и той же целью. В этом исследовании все слайды были отсканированы в 40 раз для обеспечения точности настроек алгоритма и правильной идентификации метастазов опухоли при применении к анализируемым полям. Для каждого слайда одни и те же доли легких последовательно сканировались и анализировались для каждой мыши. Также настоятельно рекомендуется, чтобы патологоанатом рассмотрел разметку тканей на предмет точности примененного алгоритма и чтобы тот же алгоритм применялся к каждому слайду в исследовании.
Представленный протокол может быть изменен в соответствии с экспериментальным дизайном, предпочтениями пользователя и измерениями желаемого результата. Одна из таких модификаций включает в себя использование индукционной камеры анестезии, а не обычного удерживающего устройства для сознательного животного. С точки зрения здоровья и благополучия животных ни один из подходов не превосходит другой, и каждый из них имеет свой собственный набор преимуществ, а также ограничений30. Кроме того, для черных или коричневых мышей может потребоваться источник света или нагревательное устройство для визуализации хвостовых жилок. Инфракрасные лампы или теплая водяная баня могут быть использованы для расширения вен. Однако температуру следует тщательно контролировать. Кроме того, имеются подсвечивающие удерживающие устройства, а также другие коммерческие версии удерживающих устройств для грызунов. Некоторые исследователи предпочитают шприцы Luer-Lok для инъекций. Нам сложнее устранить пузырьки воздуха шприцами Luer-Lok, но это вопрос предпочтения. Жизнеспособность клеток является важным фактором для процедуры инъекции хвостовой вены, и, следовательно, точный подсчет клеток, а также поддержание клеток на льду до инъекции являются необходимыми шагами. При сравнении посева легких и колонизации манипулируемых клеточных линий крайне важно определить любые различия в размере и жизнеспособности клеток до инъекции, поскольку они могут усложнить интерпретацию результатов. Гибель и/или повреждение клеток могут произойти при использовании узкоколейной иглы; однако не рекомендуется использовать иглу размером более 25 г, так как это может вызвать боль и дискомфорт у животного.
Чтобы подтвердить, что поражения легких образуются инъекционными опухолевыми клетками, иммуноокрашивание может быть выполнено на участках тканей. При использовании клеточных линий человека специфические для человека антитела могут быть использованы для распознавания метастатических поражений. Альтернативно, при использовании помеченных клеточных линий (например, GFP), могут быть использованы соответствующие антитела. Кроме того, многие клеточные линии рака молочной железы положительны для эпителиальных маркеров (то есть цитокератинов, E-кадгерина и EpCAM), но предварительное знание экспрессии имеет важное значение. Тем не менее, эпителий легких, выстилающий дыхательные пути, также будет положительным для этих маркеров, и, таким образом, структура также должна быть рассмотрена. Возможны случаи, при которых необходимо исключить развитие первичной опухоли легкого. Для этого иммуногистохимическое окрашивание для фактора транскрипции щитовидной железы-1 (TTF1) может быть использовано в качестве маркера первичной аденокарциномы легких. Окрашивание TTF1 должно быть оценено сертифицированным патологоанатомом.
При этом пользовательский алгоритм был написан с использованием алгоритма классификации Decision Forest, поскольку установленный алгоритм метастазирования в легких не мог быть точно настроен для точного обнаружения метастазов, которые различались по размеру. Этот настраиваемый алгоритм позволяет проводить сложные измерения, позволяет точно сегментировать метастазы по размеру и поддерживает отсечение размера, чтобы небольшие деформированные области и нормальные структуры не интерпретировались неправильно и, следовательно, могли быть включены в окончательный набор данных. Мы ожидаем, что этот алгоритм будет применим к большинству исследований метастазирования в легких in vivo, но пользователям, возможно, придется настроить параметры в программном обеспечении в соответствии с их индивидуальными потребностями в исследовании. Тем не менее, этот алгоритм служит платформой для исследователей, желающих проанализировать метастатическую нагрузку легких аналогичным образом. Существует множество различных вариантов платформ анализа изображений, при которых доступ или доступность, стоимость и обучение, а также уровень опыта могут диктовать лучшую платформу для использования36. Диапазон опций включает в себя бесплатные платформы, такие как QuPath, и более дорогие, но сложные платформы, такие как Visiopharm. Рекомендуется проконсультироваться с ядром патологии анализа изображений и патологоанатомом при принятии решения о том, какая платформа может быть доступна и лучше всего использоваться для конкретного исследовательского проекта.
Спонтанные мышиные модели опухолей молочной железы (например, MMTV-PyMT) или ортотопические методы инъекции жировой прокладки молочной железы представляют собой наиболее физиологически значимую модель для изучения метастазирования в легкие. Серьезным недостатком модели инъекций хвостовой вены является то, что она не повторяет полный метастатический каскад и поэтому ограничивается изучением экстравазации опухолевых клеток и вторичной колонизации органов. Тем не менее, эта экспериментальная модель метастазирования актуальна для исследований рака молочной железы, поскольку метастазы в легкие, образующиеся после инъекции в заднюю вену, имеют геномные профили, аналогичные метастатическим поражениям, которые развиваются после ортотопической имплантации тех же клеток31. Чтобы установить модель метастазирования в легкие, большое количество клеток часто вводится внутривенно, что может не точно представлять процесс метастазирования, поскольку он относится к посеву, иммунной реакции и покоя. Кроме того, основываясь на циркуляторном пути, легочные метастазы наиболее распространены при инъекции в хвостовую вену32. С большинством клеточных линий рака молочной железы опубликованные отчеты указывают на относительно низкую частоту метастазов в кости, печень или мозг после инъекции в хвостовую вену7. Альтернативные экспериментальные методы метастазирования, такие как внутрисердечные, интратибиальные, воротные венозные и интракаротидные инъекции, более подходят для изучения метастазов в другие участки33,34,35,36,37. Опять же, предпочтительны модели спонтанной опухоли молочной железы или методы инъекции ортотопических жировых прокладок, которые повторяют все этапы метастатического каскада. Проблемы с постоянной метастатической опухолевой нагрузкой, продолжительностью исследования и количеством животных, необходимых для таких исследований, являются недостатком. Однако метод цифрового анализа патологии, представленный здесь, может быть применен к метастазам в легкие, образующимся через любую спонтанную или экспериментальную модель метастазирования.
Метод анализа также дает определенные ограничения, такие как субъективность в создании алгоритма. Несмотря на то, что вся слайдовая визуализация позволяет проводить цифровой анализ на всем участке ткани и на всех лепестках одной мыши, она ограничена двумерным анализом 3D-ткани. Стереология становится распространенной практикой, которая получает 3D-информацию для анализа изображений и может учитывать такие факторы, как усадка тканей, которая происходит во время обработки тканей38. Стереология, однако, имеет свои собственные ограничения, такие как тканевые, ресурсные и временные ограничения.
Учитывая количество больных раком, пострадавших от метастатического распространения их заболевания, метод инъекций в хвостовую вену для изучения метастазирования будет по-прежнему полезным инструментом с точки зрения понимания сложной биологии метастатического распространения и определения доклинической эффективности новых терапевтических средств. Мышиные модели метастазирования in vivo, особенно те, в которых используются иммунокомпетентные животные, становятся еще более важными для исследований рака, учитывая широкий интерес к иммунотерапии29. Кроме того, экспериментальные модели метастазирования имеют решающее значение с точки зрения исследования генов-супрессоров метастазов (то есть тех, которые подавляют метастатический потенциал раковых клеток, не влияя на первичный рост опухоли), и, следовательно, продолжают оставаться ценным инструментом исследования.
Цифровая визуализация и анализ слайдов быстро стали основой диагностического и экспериментального моделирования мышей39. Использование типа подхода, описанного в настоящем описании, для анализа метастатической опухолевой нагрузки легких позволит проводить анализ с высокой пропускной способностью более всеобъемлющим и точным образом. Кроме того, цифровая патология визуализации предоставляет возможность для более совместных исследовательских проектов с участием патологоанатомов, которые специализируются в таких областях, как мышиные модели метастазирования рака молочной железы. Поскольку методы мультиплексной визуализации тканей и технологии 3D-визуализации (как упоминалось выше) продолжают развиваться, патология цифровой визуализации, сложные программные программы для анализа изображений и опыт патологоанатомов, безусловно, будут необходимы для продвижения исследований метастазирования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Репрезентативные данные финансировались через Национальный институт рака (K22CA218549 to S.T.S). В дополнение к их помощи в разработке комплексного метода анализа, о котором сообщается здесь, мы благодарим Комплексный онкологический центр Университета штата Огайо Сравнительная патология и общий ресурс фенотипирования мышей (директор - Криста Ла Перл, DVM, PhD) за услуги гистологии и иммуногистохимии и Pathology Imaging Core за разработку и анализ алгоритмов.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| alcohol prep pads | Fisher Scientific | 22-363-750 | for cleaning tail prior to injection |
| dissection scissors | Fisher Scientific | 08-951-5 | for mouse dissection and lung tissue inflation |
| DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | MT10013CV | cell culture media base for MDA-MB-231 and MVT1 cell lines |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x | Fisher Scientific | MT21030CV | used for resuspending tumor cells for injection |
| ethanol (70 % solution) | OSU | used to minimize mouse's fur during dissection; use caution - flammable | |
| Evan's blue dye | Millipore Sigma | E2129 | used at 1 % in sterile PBS for practice with tail-vein injection method; use caution - dangerous reagent |
| Fetal Bovine Serum | Millipore Sigma | F4135 | cell culture media additive; used at 10% in DMEM |
| forceps | Fisher Scientific | 10-270 | for dissection and lung tissue inflation |
| FVB/NJ mice | The Jackson Laboratory | 001800 | syngeneic mouse strain for MVT1 cells |
| hemacytometer (Bright-Line) | Millipore Sigma | Z359629 | for use in cell culture to obtain cell counts |
| insulin syringe (28 G) | Fisher Scientific | 14-829-1B | for tail-vein injections (BD 329424) |
| MDA-MB-231 cells | ATCC | human breast cancer cell line | |
| MVT1 cells | mouse mammary tumor cells | ||
| needles (26 G) | Fisher Scientific | 14-826-15 | used to inflate the mouse's lungs |
| neutral buffered formalin (10%) | Fisher Scientific | 245685 | used as a tissue fixative and to inflate lung tissue; use caution - dangerous reagent |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice | The Jackson Laboratory | 005557 | maintained by OSUCCC Target Validation Shared Resource |
| Penicillin Streptomycin 100x | ThermoFisher | 15140163 | cell culture media additive |
| sterile gauze | Fisher Scientific | NC9379092 | for applying pressue to mouse's tail if bleeding occurs |
| syringe (5 mL) | Fisher Scientific | 14-955-458 | used to inflate mouse lung tissue |
| tail-vein restrainer | Braintree Scientific, Inc. | TV-150 STD | used to restrain mouse for tail-vein injections |
| Trypan blue (0.4 %) | ThermoFisher | 15250061 | used in cell culture to assess viability |
| Trypsin-EDTA 0.25 % | ThermoFisher | 25200-114 | used in cell culture to detach tumor cells from plate |
References
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nature Reviews: Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).
- Steeg, P. S.
- Gupta, G. P., Massague, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127 (4), 679-695 (2006).
- Steeg, P. S. Tumor metastasis: mechanistic insights and clinical challenges. Nature Medicine. 12 (8), 895-904 (2006).
- Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331 (6024), 1559-1564 (2011).
- Eckhardt, B. L., Francis, P. A., Parker, B. S., Anderson, R. L. Strategies for the discovery and development of therapies for metastatic breast cancer. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (6), 479-497 (2012).
- Gomez-Cuadrado, L., Tracey, N., Ma, R., Qian, B., Brunton, V. G. Mouse models of metastasis: progress and prospects. Disease Models & Mechanisms. 10 (9), 1061-1074 (2017).
- Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Research. 8 (4), 212 (2006).
- Schoenenberger, C. A., et al. Targeted c-myc gene expression in mammary glands of transgenic mice induces mammary tumours with constitutive milk protein gene transcription. EMBO Journal. 7 (1), 169-175 (1988).
- Nusse, R., Varmus, H. E. Many tumors induced by the mouse mammary tumor virus contain a provirus integrated in the same region of the host genome. Cell. 31 (1), 99-109 (1982).
- Muller, W. J., Sinn, E., Pattengale, P. K., Wallace, R., Leder, P. Single-step induction of mammary adenocarcinoma in transgenic mice bearing the activated c-neu oncogene. Cell. 54 (1), 105-115 (1988).
- Lin, E. Y., et al. Progression to malignancy in the polyoma middle T oncoprotein mouse breast cancer model provides a reliable model for human diseases. American Journal of Pathology. 163 (5), 2113-2126 (2003).
- Green, J. E., et al. The C3(1)/SV40 T-antigen transgenic mouse model of mammary cancer: ductal epithelial cell targeting with multistage progression to carcinoma. Oncogene. 19 (1), 1020-1027 (2000).
- Iorns, E., et al. A new mouse model for the study of human breast cancer metastasis. PloS One. 7 (10), 47995 (2012).
- Kim, I. S., Baek, S. H. Mouse models for breast cancer metastasis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 394 (3), 443-447 (2010).
- Mariotto, A. B., Etzioni, R., Hurlbert, M., Penberthy, L., Mayer, M. Estimation of the Number of Women Living with Metastatic Breast Cancer in the United States. Cancer Epidemiology, Biomarkers and Prevention. 26 (6), 809-815 (2017).
- Xiao, W., et al. Risk factors and survival outcomes in patients with breast cancer and lung metastasis: a population-based study. Cancer Medicine. 7 (3), 922-930 (2018).
- Smid, M., et al. Subtypes of breast cancer show preferential site of relapse. Cancer Research. 68 (9), 3108-3114 (2008).
- Kennecke, H., et al. Metastatic behavior of breast cancer subtypes. Journal of Clinical Oncology. 28 (20), 3271-3277 (2010).
- Soni, A., et al. Breast cancer subtypes predispose the site of distant metastases. American Journal of Clinical Pathology. 143 (4), 471-478 (2015).
- Leone, B. A., et al. Prognostic impact of metastatic pattern in stage IV breast cancer at initial diagnosis. Breast Cancer Research and Treatment. 161 (3), 537-548 (2017).
- Pei, X. F., et al. Explant-cell culture of primary mammary tumors from MMTV-c-Myc transgenic mice. In Vitro Cellular and Developmental Biology: Animal. 40 (1-2), 14-21 (2004).
- Mathsyaraja, H., et al. CSF1-ETS2-induced microRNA in myeloid cells promote metastatic tumor growth. Oncogene. 34 (28), 3651-3661 (2015).
- Yang, S., Zhang, J. J., Huang, X. Y. Mouse models for tumor metastasis. Methods in Molecular Biology. 928, 221-228 (2012).
- La Perle, K. M. D. Comparative Pathologists: Ultimate Control Freaks Seeking Validation. Veterinary Pathology. 56 (1), 19-23 (2019).
- Blomberg, O. S., Spagnuolo, L., de Visser, K. E. Immune regulation of metastasis: mechanistic insights and therapeutic opportunities. Disease Models & Mechanisms. 11 (10), (2018).
- Gonzalez, H., Hagerling, C., Werb, Z. Roles of the immune system in cancer: from tumor initiation to metastatic progression. Genes and Development. 32 (19-20), 1267-1284 (2018).
- Borowsky, A. D., et al. Syngeneic mouse mammary carcinoma cell lines: two closely related cell lines with divergent metastatic behavior. Clinical and Experimental Metastasis. 22 (1), 47-59 (2005).
- Yang, Y., et al. Immunocompetent mouse allograft models for development of therapies to target breast cancer metastasis. Oncotarget. 8 (19), 30621-30643 (2017).
- Resch, M., Neels, T., Tichy, A., Palme, R., Rulicke, T. Impact assessment of tail-vein injection in mice using a modified anaesthesia induction chamber versus a common restrainer without anaesthesia. Laboratory Animals. 53 (2), 190-201 (2019).
- Rashid, O. M., et al. Is tail vein injection a relevant breast cancer lung metastasis model. Journal of Thoracic Disease. 5 (4), 385-392 (2013).
- Goodale, D., Phay, C., Postenka, C. O., Keeney, M., Allan, A. L. Characterization of tumor cell dissemination patterns in preclinical models of cancer metastasis using flow cytometry and laser scanning cytometry. Cytometry Part A. 75 (4), 344-355 (2009).
- Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
- Wright, L. E., et al. Murine models of breast cancer bone metastasis. BoneKEy Reports. 5, 804 (2016).
- Simmons, J. K., et al.
- Liu, Z., et al. Improving orthotopic mouse models of patient-derived breast cancer brain metastases by a modified intracarotid injection method. Scientific Reports. 9 (1), 622 (2019).
- Kodack, D. P., Askoxylakis, V., Ferraro, G. B., Fukumura, D., Jain, R. K. Emerging strategies for treating brain metastases from breast cancer. Cancer Cell. 27 (2), 163-175 (2015).
- Brown, D. L. Practical Stereology Applications for the Pathologist. Veterinary Pathology. 54 (3), 358-368 (2017).
- Aeffner, F., et al. Digital Microscopy, Image Analysis, and Virtual Slide Repository. Institute for Laboratory Animal Research Journal. 59 (1), 66-79 (2018).
Tags
Исследование рака выпуск 159 инъекция в задней вену рак молочной железы метастазы в легких H&E-окрашенные участки количественная цифровая патология анализ изображенийErratum
Formal Correction: Erratum: Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells
Posted by JoVE Editors on 12/02/2020.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells. The author list was updated.
The author list was updated from:
Katie A. Thies1, Sue E. Knoblaugh2, and Steven T. Sizemore1
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center
2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University
to:
Katie A. Thies1, Sarah Steck1, Sue E. Knoblaugh2, and Steven T. Sizemore1
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center
2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University
