ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
Kanser hücrelerinin intravenöz enjeksiyonu genellikle metastaz araştırmalarında kullanılır, ancak metastatik tümör yükünü analiz etmek zor olabilir. Burada, metastazın kuyruk damarı enjeksiyon modelini gösteriyoruz ve ortaya çıkan metastatik akciğer tümörü yükünü analiz etmek için yeni bir yaklaşım içeriyoruz.
Abstract
Çoğu kanser hastası için morbidite ve mortalitenin birincil nedeni olan metastazın farelerde preklinik olarak model alınması zor olabilir. Birkaç spontan metastaz modeli mevcuttur. Bu nedenle, uygun hücre hatlarının kuyruk damarı enjeksiyonu içeren deneysel metastaz modeli metastaz araştırmalarının bir dayanağıdır. Kanser hücreleri lateral kuyruk damarına enjekte edildiğinde akciğer tercih ettikleri kolonizasyon bölgesidir. Bu tekniğin potansiyel bir sınırlaması metastatik akciğer tümörü yükünün doğru ölçülmesidir. Bazı araştırmacılar önceden tanımlanmış boyuttaki makrometazları sayarken ve/veya dokunun kesitini takiben mikrometazlar içerirken, diğerleri normal doku alanına göre metastatik lezyonların alanını belirler. Metastatik yük yüksek olduğunda bu niceleme yöntemlerinin her ikisi de son derece zor olabilir. Burada, akciğer metastazının intravenöz enjeksiyon modelini ve ardından görüntü analiz yazılımı kullanarak metastatik tümör yükünü ölçmek için gelişmiş bir yöntem gösteriyoruz. Bu işlem, kapsamlı bir analiz sağlamak için ortalama metastaz boyutu, toplam metastaz sayısı ve toplam metastaz alanı dahil olmak üzere birden fazla uç nokta parametresinin araştırılmasına olanak tanır. Ayrıca, bu yöntem doğruluğu sağlamak için Amerikan Veteriner Patologlar Koleji (SEK) tarafından onaylanmış bir veteriner patolog kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
Introduction
Son derece karmaşık ve verimsiz bir süreç olmasına rağmen1, metastaz kanser hastalarının morbidite ve mortalitesine önemli bir katkıda bulunur2. Aslında, kansere bağlı ölümlerin çoğu hastalığın metastatik yayılmasına atfedilir3,4. Tümör hücrelerinin başarılı bir şekilde metastaz yapabilmesi için birincil bölgeden kopmaları, bitişik stroma yoluyla istila etmeleri, kan dolaşımına veya lenfatiklere intravazyona girmeleri, ikincil bir bölgenin kılcal yatağına gitmeleri, ikincil dokuya yayılmaları ve çoğalmaları veya metastatik lezyonlar oluşturmak için büyümeleri gerekir5. Fare modellerinin kullanımı, metastatik tohumlama ve büyümeden sorumlu moleküler mekanizmaların anlaşılmasını ilerletmek için kritik öneme sahiptir6,7. Burada, hem genetiği değiştirilmiş fare modellerinin hem de transplantasyon yöntemlerinin sıklıkla kullanıldığı meme kanseri metastazına odaklanıyoruz - her biri kendi avantajları ve sınırlamaları var.
Genetik olarak tasarlanmış meme tümörü modelleri, meme epitelinde transjenlerin ekspresyonini sağlamak için MMTV-LTR (fare meme tümörü virüsü uzun terminal tekrarı) ve WAP (Peynir Altı Suyu Asidik Protein) dahil olmak üzere meme bezine özgü promotörlerden yararlanır8. Polioma orta T antijeni (PyMT), ErbB2/Neu, c-Myc, Wnt-1 ve simian virüs 40 (SV40) dahil olmak üzere onkogenler bu şekilde ifade edilmiştir9,10,11,12,13 ve bu genetik modeller primer tümör başlangıç ve ilerlemesini incelemek için yararlı olmakla birlikte, çok azı uzak organlara kolayca metastaz yapmaktadır. Ayrıca, bu genetik fare modelleri genellikle spontan veya deneysel metastaz modellerine göre daha fazla zaman ve maliyet yasaklayıcıdır. Genetik olarak tasarlanmış meme tümörü modellerinin çoğunun metastaz çalışması için sınırlandırılması göz önüne alındığında, transplantasyon teknikleri bu karmaşık süreci incelemek için cazip yöntemler haline gelmiştir. Buna ortotopik, kuyruk damarı, intrakardiyak ve uygun hücre hatlarının intrakraniyal enjeksiyonu dahildir.
Meme yağı pedine ortotopik enjeksiyondan sonra birkaç meme kanseri hücre hattı kolayca metastaz yapsa da14,15, metastatik tümör yükünün tutarlılığı ve tekrarlanabilirliği zor olabilir ve bu tür çalışmaların süresi birkaç ay sırasına göre olabilir. Akciğer metastazını değerlendirmek için, özellikle kuyruk damarına intravenöz enjeksiyon genellikle birkaç hafta içinde meydana gelen metastatik yayılma ile daha tekrarlanabilir ve zaman etkili bir yöntemdir. Ancak intravenöz enjeksiyon modeli metastatik kaskadın ilk adımlarını atlatığından, bu çalışmaların sonuçlarının yorumlanmasının dikkatli olunmalıdır. Bu gösteride, meme tümörü hücrelerinin kuyruk damarı enjeksiyonunun yanı sıra doğru ve kapsamlı bir analiz yöntemi gösteriyoruz.
Araştırma topluluğu meme kanseri metastazının karmaşık sürecini anlamada önemli ilerleme kaydetmiş olsa da, şu anda 150.000'den fazla kadının metastatik meme kanserine sahip olduğu tahmin edilmektedir16. Evre IV meme kanseri olanların % > 36'sı akciğer metastazı17; bununla birlikte, metastazların bölgeye özgü deseni ve insidansı moleküler alt tipe göre değişebilir18,19,20,21. Meme kanseri ile ilişkili akciğer metastazları olan hastalar, bu hastalık için etkili tedaviler ve yeni biyobelirteçler belirleme ihtiyacını vurgulayan sadece 21 aylık ortanca bir sağkalıma sahiptir17. Tümör hücrelerinin intravenöz enjeksiyonu da dahil olmak üzere deneysel metastaz modellerinin kullanımı, bu önemli klinik zorluk hakkındaki bilgimizi ilerletmeye devam edecektir. Bu protokolde açıklanan dijital görüntüleme patolojisi ve metastatik akciğer tümörü yük analizi yöntemi ile birleştirildiğinde kuyruk damar enjeksiyonları meme kanseri metastaz araştırmaları için değerli bir araçtır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan kullanımı, OSU Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) onaylı protokol 2007A0120-R4 (PI: Dr. Gina Sizemore) kapsamında Üniversite Laboratuvar Hayvan Kaynakları (ULAR) yönetmeliklerini takip etti.
1. Meme kanseri hücrelerinin kuyruk damarı enjeksiyonu
- Enjeksiyon için hücrelerin ve şırıncının hazırlanması
- Kullanılacak fare sayısına ve hücre konsantrasyonuna göre uygun sayıda hücreyi plakalar.
NOT: Enjekte edilen hücre sayısı ve metastazların geliştirilmesi için zaman, kullanılan hücre hattına bağlı olacaktır ve optimize edilmesi gerekecektir. Bu gösteride NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) farelerine intravenöz olarak 1 x 106 MDA-MB-231 hücresi enjekte edilir ve en geç 24 gün sonra makroskopik akciğer lezyonları gözlenir. MVT1 murine meme tümörü hücre hattı17 için, 3 x 106 hücre, 14 gün boyunca gözlenen çok sayıda akciğer metastazı ile bağışıklık yetkin FVB / N farelerine enjekte edilir22,23. - Medyayı epire edin ve hücre plakalarını 1x PBS ile durulayın. Hücreleri minimum hacimde deneyin, uygun ortam hacmini ekleyin ve hematostatometre veya tercih edilen başka bir yöntem kullanarak hücreleri sayın. Uygun hücre sayılarını belirlemek için trypan mavisi (%0.4) veya diğer canlı/ölü hücre boyaları kullanılabilir.
- 5 dakika boyunca 180 x g'da dönerek pelet hücreleri.
- Fare başına 100 μL'lik bir hacim enjekte olacak şekilde steril 1x PBS'de uygun sayıda hücreyi yeniden kullanın. Canlılığı korumak için hücre süspansiyonlarını buzda tutun.
- Enjeksiyondan önce, topaklanmaması için hücreleri 200 μL veya 1 mL pipetle iyice yeniden biriktirin. 28 G insülin şırındında 100 μL çizin (bkz. Malzeme Tablosu).
- Şırıngayı dikey tutarak, şırıngaya dokunarak ve pistonu yavaşça ayarlayarak hava kabarcıklarını ortadan kaldırın. Hava kabarcıklarının damara enjekte edilmesi ölümcül olabilecek bir hava/gaz embolisi neden olabilir.
- Kullanılacak fare sayısına ve hücre konsantrasyonuna göre uygun sayıda hücreyi plakalar.
- Yanal kuyruk damarı enjeksiyonu
NOT: Deneysel meme kanseri metastaz tahlilleri için 6 haftalık dişi farelere enjeksiyonlar >.- Fareyi kuyruğundan dolayı idare edin ve hayvanı uygun boyutta oluklu bir tüp / kısıtlama cihazına kaydırın (kullanılan kısıtlama cihazı için Malzeme Tablosuna bakın).
- Kısıtlama cihazının fiş kısmını takın ve fareyi yan tarafına yanal kuyruk damarının görüntülenmesi kolay olacak şekilde yerleştirin. Farenin cinsel organa uygun bir ventral arteri, bir dorsal damarı ve iki lateral kaudal damarı vardır.
- Farenin kuyruğunun yüzeyini aseptik bir mendille temizleyin. İşaret parmağı ve başparmak arasındaki kuyruğu baskın olmayan elle kavrayın ve hafif gerginlik uygulayın.
- Kuyruğun distal kısmından başlayarak, iğneyi göbek ucu ile damara paralel yerleştirin.
- İzin verilirse, iğneyi dikkatlice yeniden yakalayın ve 20-30 ° açıya bükün. Tek elle yaklaşım veya iğne recapping cihazı şiddetle tavsiye edilir.
NOT: Damarın çökmesine neden olabileceğinden aspirasyon yapmak gerekli değildir. Bununla birlikte, ilk yerleştirildiğinde küçük bir kan parlaması görülebilir. İğne, uygun yerleşimle damara sorunsuz bir şekilde ilerleyecektir. - Tüm hacmi yavaşça damara dağıtın. Piston itildiğinde direnç olmamalıdır.
- Herhangi bir direnç hissederse, şırınga iğnesini derhal çıkarın. Gerekirse, kuyruğun proksimal ucuna doğru hareket eden veya karşıt yan damar olan iğneyi (ideal olarak en fazla 3 deneme) yeniden yerleştirin.
- Enjeksiyondan sonra küçük bir kan hacmi muhtemelen yerinden çıkacaktır. Steril gazlı bezle hafif basınç uygulayın ve aseptik mendille silin.
- Şırınnayı derhal uygun keskinlik kabına atın.
- Fareyi temiz, havalandırılmış bir kafese geri döndürün ve sıkıntı belirtileri alıp almadığını izleyin.
- Metastaz oluşumu (zahmetli solunum, kambur duruş, kilo kaybı) ve genel sıkıntı belirtileri için fareleri 2-3x / haftalık izleyin. Metastaz geliştirme süresi hücre çizgisine ve fare zorlanmasına bağlı olacaktır.
- Bir in vivo canlı hayvan görüntüleme cihazı kullanıyorsanız, hücrelerin başarılı enjeksiyonu onaylamak ve zaman "sıfır" veri elde etmek için kuyruk damarı enjeksiyonundan hemen sonra görüntü fareleri (in vivo biyolüminesans görüntüleme ile ilgili belirli ayrıntılar burada yer almaz, ancak Yang ve ark.24 tarafından açıklanmaktadır).
2. Akciğer dokusu fiksasyonu ve metastatik akciğer tümörü yükünün analizi
- Histopatoloji için akciğerlerin yapısal formatını korumak için akciğer dokusu enflasyonu
- Onaylanan ötanazi prosedürleri (örneğin oda hacminin / dk'nın% 30 - 70'inde karbondioksit) takip edildikten sonra, fare karkasını pimli bir diseksiyon tahtasına sabitleyin. Diseksiyon sırasında farenin kürklerini yoldan uzak tutmak için sprey veya% 70 etanol uygulayın.
NOT: Karbondioksit boğulması, özellikle daha yavaş akış hızlarında beklenen bir arka plan lezyonu olarak pulmoner kanamaya neden olabilir. - Toraksı orta çizgi kesiği ile açın, kesiği periton boyunca kranially/kaudally uzatın ve ksifoid işlemini kavrayarak diyaframı kesin.
- Bıçakları köreltmemek için ayrı bir makas seti kullanarak, göğüs kafesinin her iki tarafındaki kaburgaları kesin ve akciğerlerin genişlemesi için yer bırakarak göğüs kafesini dikkatlice çıkarın.
- Submandibuler tükürük bezlerini ve infrahidoid kasları çıkararak trakeayı izole edin. Pimlerin nefes borusunun her iki tarafına yerleştirilmesi, iğne takılması sırasında istenmeyen hareketleri önleyebilir.
- 26 G şırındı % 10 nötr tamponlu formalin 2-3 mL ile doldurun ve nefes borusuna yerleştirin.
- Yavaşça formalin enjekte edin ve akciğerlerin genişlemesini izleyin (genellikle ~1,5 mL formalin gerektirir).
- Formalin akciğerlerden sızmaya başladığında (aşırı enflasyondan kaçının), trakeayı bir çift ön ayakla kıstırın, şırınga iğnesini çıkarın ve tüm solunum cihazını çıkarın. Doku ek kırpması sabitleme sonrası yapılabileceğinden akciğerleri, kalbi vb. doğrudan formalin içine yerleştirin.
- Standart yöntemler kullanılarak tam işleme, gömme, doku kesiti ve hematoksilin ve eozin (H&E) boyama.
- Onaylanan ötanazi prosedürleri (örneğin oda hacminin / dk'nın% 30 - 70'inde karbondioksit) takip edildikten sonra, fare karkasını pimli bir diseksiyon tahtasına sabitleyin. Diseksiyon sırasında farenin kürklerini yoldan uzak tutmak için sprey veya% 70 etanol uygulayın.
- Metastatik akciğer tümörü yükünün analizi
- H&E lekeli akciğer bölümlerini 40x büyütmede yüksek çözünürlüklü, slayt tarayıcıda tarayın (Şekil 3).
- Akciğer metastazlarının ölçülmesi için görüntüleri görüntü analiz yazılımına (örneğin Visiopharm Görüntü Analizi) içe aktarın.
NOT: Yeni kullanıcıların görüntü analizi yazılımını kullanmak için yerinde veya çevrimiçi eğitim almalarını öneririz. Ticari web sayfası üzerinden çok sayıda web semineri de mevcuttur. - Yazılımın uygulama kitaplığından Visiopharm 10118 H&E Lung Metastaz Uygulamasını seçin.
NOT: Bu uygulamanın amacı, H&E lekeli slaytlarda akciğer metastazını etiketlemek ve ölçmektir. 10118 H&E Akciğer Metastazı Uygulamasının bir parçası olarak, ilk görüntü işleme adımı Doku Algılama Uygulaması ile akciğer dokusunu segmentlere ayırır. İkinci görüntü işleme adımı, akciğer dokusu içindeki metastazları tanımlayan Metastaz Algılama Uygulamasını kullanır. Metastazlar, metastaz olarak tanımlanamayacak kadar yanlış şekillendirilmiş, çok kırmızı veya çok seyrek olan bölgelerle birlikte şekil yoluyla tanımlanır. - Şekil ve seyrekliği tanımlayan parametreleri temsili görüntülere en uygun şekilde ayarlayın. Tümör metastazlarının ve normal akciğer dokusunun parçalı bölgeleri her doku tipi için farklı renk etiketleri kullanılarak görüntülenebilir.
NOT: Uygulamanın metastazları normal akciğer dokusundan doğru bir şekilde ayıramaması durumunda, Visiopharm Karar Ormanı programını kullanan özel bir uygulamanın deneyler için yapıldığı gibi yazılması gerekebilir (bkz. Şekil 2 ve Şekil 3). Özel bir algoritma yazmak için ayrıntılar aşağıdadır. Aksi takdirde, 2.2.9 adımına geçin. - İstenilen bir görüntüde birden fazla Sınıf [yani akciğer dokusu (neoplastik olmayan), metastazlar, kırmızı kan hücreleri, epitel ve/veya beyaz alan] eğitilerek çalışan Karar Ormanı programını açın. Şekil 2'de tümör metastazları mavi, normal doku yeşil ve bronşiyoler epitel sarıdır. Ayrıca, kırmızı kan hücreleri kırmızı ve hava boşlukları pembedir.
- Her Sınıfı bir görüntü için uygun şekilde eğitmek için sorulan evet veya hayır soruları serisini izleyin. Algoritmanın doğruluğu evet/hayır sorularının sayısını belirleyecektir. Analiz için, özel algoritma / uygulama 50 'ye (aralık 0-100) ayarlanmış doğrulukla yazılmıştır.
- Algoritmanın/Uygulamanın doğruluğunu artırmak için keskinleştirmek, bulanıklaştırmak, şekle göre sıralamak vb. Özellikler, belirli renkleri veya yoğunlukları ortaya çıkarmak için Sınıfın görüntüyü görme şeklini değiştirir.
NOT: Özel algoritma için 8500 μm2 ve üzeri ölçülerindeki metastazlar metastaz olarak etiketlenir ve ölçülür. Bu, boyut farkı ve algılamak için çok küçük metastazları hesaplar. Normal doku nicelemesinde küçük yanlış şekilli alanlar ve 8500 μm2'nin altındaki küçük metastatik alanlar yer aldı. - Değiştirilen ayarları uygulamadan veya özel algoritmadan kaydedin ve ardından algoritmayı/uygulamayı H&E lekeli dokuların tamamına veya serisine uygulayın.
- Son olarak, Tablo 1'de listelenenleri içeren tüm çıktı değişkenlerini dışa aktar. Mikronlardaki alan kare (μm2) her doku tipi için ölçülebilir ve yüzdeler numune toplam net doku alanından (yani toplam doku eksi hava alanından) elde edilir.
- Özel bir algoritma oluştururken, doğru ölçümler sağlamak ve doku tipleri arasında ayrım yapmak için Amerikan Veteriner Patologlar Koleji tarafından onaylanmış bir veteriner patolog kuruluna danışarak doku işaretlemelerini gözden geçirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kuyruk damarı enjeksiyonu için etiketsiz hücreler kullanıyorsanız, makrometazlar gözlemlenebiliyorsa (1) nekropsi zamanına kadar veya (2) mikroskobik metastazlar varsa histolojik analizi takiben akciğer kolonizasyonunu doğrulamak zor olabilir. Geniş metastatik akciğer tümörü yükü ile fareler nefes almaya çalışacaktır. Herhangi bir tümör çalışmasında olduğu gibi, fareler çalışma süresi boyunca dikkatle izlenmelidir. Etiketli hücrelerin kullanımı, başarılı kuyruk damarı enjeksiyonu onaylamanın kolay bir yoludur; bu nedenle gösteride luciferaz etiketli MDA-MB-231 hücrelerinin kullanılması. Bununla birlikte, in vivo görüntüleme deneysel tasarıma ve diğer faktörlere bağlı olarak her zaman mümkün veya gerekli değildir. Şekil 1A, doğru enjeksiyonun teyidi olarak luciferaz etiketli MDA-MB-231 hücrelerinin kuyruk damarı enjeksiyonundan 2 saatten az bir süre sonra torasik alanda biyolüminesans sinyalini göstermektedir. Bu deney için torasik bölgedeki foton sayıları zamanla artar ve enjeksiyon sonrası 24. günde güçlü bir biyolüminesans sinyali bulunur (Şekil 1B ve C; ölçek çubuğundaki değişime dikkat edin). Nekropsi zamanında bu farelerde birçok makroskopik akciğer lezyonu gözlenmiştir (Şekil 1D).
Uygun doku işleme ve lekelenmeden sonra H&E lekeli akciğer bölümleri taranabilir veya görüntülenebilir. Metastatik akciğer tümörü yükü nicelemesi, görüntü analiz yazılımı ve özel bir algoritma kullanılarak etkili bir şekilde elde edilebilir. Özelleştirilmiş algoritma kullanılarak, tüm akciğer dokusu farklı doku özelliklerine göre segmentlere ayrılmıştır (Şekil 2A ve B). Yazılım, akciğer dokusunu bu şekilde segmentlere ayırarak Tablo 1'de listelenen çeşitli parametreleri ölçebilir. Bu analiz, MDA-MB-231 hücreleri enjekte edilen farelerden akciğer dokusu üzerinde ve ardından metastatik kolonizasyonu veya araç kontrolünü (DMSO) engellemek için tasarlanmış bir ilaçla tedavi edilmiştir. Bu analizden elde edilen ham veriler Tablo 2'de gösterilmiştir. Ayrıca, Şekil 3A, DMSO veya ilaçla tedavi edilen farelerden MDA-MB-231 akciğer metastazlarının temsili H&E görüntülerini göstermektedir. Toplam akciğer nodül sayısı farklı olmadığı için bu tedavi grupları arasındaki metastatik tümör yükündeki fark kolayca göz ardı edilebilirken, tüm parametrelerin kapsamlı bir analizi yüzde net akciğer metastaz alanında önemli bir fark olduğunu göstermektedir (Şekil 3B,C). Bu, burada açıklanan yöntem gibi metastatik akciğer tümörü yükünü analiz etmek için kapsamlı ve kapsamlı bir yaklaşıma duyulan ihtiyacın altını çizer.
Şekil 3'te sunulan veriler için tüm istatistiksel analizler GraphPad Prism 7 kullanılarak yapılmıştır. Veriler normalde aşağıdaki standart normallik testlerinden herhangi birini geçtikten sonra dağıtıldığı kabul edildi: D'Agostino-Pearson omnibus, Shapiro-Wilk ve Kolmogorov-Smirnov. Araç ve uyuşturucu ile tedavi edilen gruplar arasında karşılaştırma (Şekil 3) eşleşmeyen iki kuyruklu Öğrenci t testi ile yapılmıştır. İstatistiksel anlamlılık P ≤ 0.05'te belirlendi.
Şekil 1: Başarılı kuyruk damarı enjeksiyonunun in vivo biyolüminesans onayı.
(A) Luciferaz etiketli MDA-MB-231 hücrelerinin kuyruk damarı enjeksiyonundan 1 saat sonra farelerde temsili biyolüminesans sinyali. (B) Luciferaz etiketli MDA-MB-231 hücrelerinin kuyruk damarı enjeksiyonundan 24 gün sonra (A) ile aynı fare kümesinde temsili biyolüminesans sinyali. [(A) ve (B) arasındaki ölçek çubuğundaki değişikliğe dikkat edin]. (C) MDA-MB-231 kuyruk damarı enjekte edilen farelerde foton sayılarının zaman içinde ölçülmesi. Hata çubukları ortalama ± SEM'i temsil eder. (n = 8 fare) (D) Nekropsi sırasında akciğer dokusu (sağda) ve akciğerlerde (solda) MDA-MB-231 makrometazları taşıyan tümörsüz temsil eder. Ölçek çubukları = 50 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Visiopharm yazılımı kullanılarak doku segmentasyonu.
(A) Özelleştirilmiş yazılım algoritmasını kullanarak, bölümlenmemiş ve parçalı doku işaretlemelerinin temsili snips. (B) Yazılım kullanılarak segmentlere ayrılmıştır tüm doku kategorileri için gösterge. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: H&E lekeli dokuların temsili metastatik akciğer tümörü yük analizi.
(A) MDA-MB-231 hücrelerinin kuyruk damarı enjeksiyonundan sonra akciğer dokusunun seçilmemiş farelerden ve kontrolden (DMSO) ve ilaçla tedavi edilen farelerden temsili H&E lekesi. Temsili tümör metastazları oklarla gösterilir. Ölçek çubukları = 4x büyütme için 500 μm ve 10x büyütme için 200 μm. (B) Kontrol ve ilaçla tedavi edilen farelerin yüzde net akciğer metastaz alanının grafiği. Hata çubukları, Öğrencinin t testi tarafından ortalama ± SD. (*) P = 0,022'dir. (C) Metastatik akciğer tümörü yük analizini özetleyen tablo (n = 9 DMSO; n = 9 ilaç tedavisi). Verilerin normal dağılımı kontrol edildikten sonra, tablodaki tüm P değerleri eşleşmeyen, iki kuyruklu Öğrenci t testi ile belirlendi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Parametre | Tarif | |
| Toplam Doku Alanı (μm2) | Tüm tümör metastazlarını, normal akciğeri ve kırmızı kan hücrelerinin alanlarını kapsayan kare mikronlardaki alan. | |
| Metastaz Sayısı | Akciğer dokusundaki toplam metastaz sayısı. | |
| Metastaz Alanı Yüzdesi (μm2) | Toplam metastaz alanı net doku alanı x 100'e bölünür. | |
| Toplam Doku + Beyaz Boşluk Alanı (μm2) | Tüm doku ve beyaz alanı kapsayan kare mikronlarda alan. | |
| Net Doku Alanı (μm2) | Beyaz boşluk ve kırmızı kan hücreleri olmayan kare mikronlarda (mets ve normal akciğer) doku alanı. | |
| Toplam Metastaz Alanı (μm2) | Karar Ormanı algorithim tarafından segmentlere ayrılır gibi kare mikronlarda toplam metastaz alanı. | |
| Ortalama metastaz Alanı (μm2) | Her görüntüdeki metastazların kare mikronlarındaki ortalama (ortalama) alan. | |
| OrtaNca Metastaz Alanı (μm2) | Kare mikronlarda ortanca metastaz alanı. Eşit sayıda metastaz bu değerin altına düşer ve eşit sayıda metastaz ortanca değerden büyüktür. | |
Tablo 1: Yazılımla ölçülen parametreler. Özel algoritma kullanılarak hesaplanan her ölçümün açıklamasıyla birlikte parametrelerin listesi.
| Kaydırak | Metastaz Sayısı | Metastaz Alanı Yüzdesi (μm2) | Toplam Doku + Beyaz Boşluk Alanı (μm2) | Toplam Beyaz Alan (μm2) | Net Doku Alanı (μm2) | Toplam Metastaz Alanı (μm2) | Kırmızı Kan Hücreleri Bölgesi (μm2) | Ortalama Metastaz Alanı (μm2) | OrtaNca Metastaz Alanı (μm2) |
| 171 Akciğer Kaydırağı 1 | 435 | 8.90 | 185698000 | 83201800 | 92031400 | 8189250 | 10464800 | 18825.86 | 14748.73 |
| 171 Akciğer Slaytı 2 | 323 | 8.37 | 185698000 | 83201800 | 92054740 | 7708990 | 10441460 | 23866.84 | 14748.73 |
| 172 Akciğer Kaydırağı 1 | 151 | 2.73 | 181546000 | 89509904 | 81571296 | 2225220 | 10464800 | 14736.56 | 12486.37 |
| 172 Akciğer Slaytı 2 | 142 | 2.60 | 170708000 | 81735504 | 80558196 | 2093040 | 8414300 | 14739.72 | 12119.62 |
| 173 Akciğer Kaydırağı 1 | 634 | 11.60 | 234104992 | 102153000 | 115606692 | 13406800 | 16345300 | 21146.37 | 15472.22 |
| 173 Akciğer Slaytı 2 | 667 | 12.70 | 223180992 | 86778600 | 122374592 | 15542700 | 14027800 | 23302.40 | 16531.00 |
| 174 Akciğer Kaydırağı 1 | 40 | 0.55 | 192452992 | 80340896 | 87591096 | 485121 | 24521000 | 12128.03 | 10484.05 |
| 174 Akciğer Kaydırağı 2 | 34 | 0.51 | 183918000 | 71287904 | 91242796 | 464830 | 21387300 | 13671.47 | 11181.81 |
| 175 Akciğer Kaydırağı 1 | 780 | 23.93 | 179544992 | 44799200 | 126995782 | 30388600 | 7750010 | 38959.74 | 19307.76 |
| 175 Akciğer Slaytı 2 | 1001 | 12.58 | 169191536 | 43425608 | 120610754 | 15169100 | 5155174 | 15153.95 | 19703.08 |
| 188 Akciğer Slaytı 1 | 569 | 13.20 | 162290000 | 54210000 | 98486310 | 12997300 | 9593690 | 22842.36 | 14463.91 |
| 188 Akciğer Slaytı 2 | 271 | 5.15 | 157146000 | 54250800 | 91996500 | 4738100 | 10898700 | 17483.76 | 12657.83 |
| 189 Akciğer Slaytı 1 | 74 | 1.70 | 185292992 | 95700800 | 77779392 | 1318820 | 11812800 | 17821.89 | 14551.08 |
| 189 Akciğer Slaytı 2 | 74 | 1.76 | 182272992 | 95700800 | 74759392 | 1318820 | 11812800 | 17821.89 | 14551.08 |
| 816 Akciğer Slaytı 1 | 246 | 5.65 | 185876000 | 87568896 | 81916204 | 4631050 | 16390900 | 18825.41 | 14371.99 |
| 816 Akciğer Slaytı 2 | 565 | 6.05 | 183220000 | 76954304 | 90305396 | 5462670 | 15960300 | 9668.44 | 14244.82 |
| 876 Akciğer Kaydırağı 1 | 468 | 10.36 | 208308000 | 99300096 | 100947064 | 10454500 | 8060840 | 22338.68 | 16011.37 |
| 876 Akciğer Kaydırağı 2 | 528 | 11.74 | 199750896 | 81642568 | 110450391 | 12963400 | 7657937 | 24551.89 | 16699.13 |
| 877 Akciğer Slaytı 1 | 732 | 17.98 | 219340992 | 99918600 | 107869992 | 19397100 | 11552400 | 26498.77 | 18137.52 |
| 877 Akciğer Kaydırağı 2 | 605 | 14.64 | 207925504 | 88539712 | 108168329 | 15839700 | 11217463 | 26181.32 | 18014.64 |
| 878 Akciğer Slaydı 1 | 377 | 10.05 | 178534000 | 85610896 | 81931104 | 8232340 | 10992000 | 21836.45 | 16671.03 |
| 878 Akciğer Kaydırağı 2 | 376 | 9.88 | 170544000 | 75337904 | 86108406 | 8511710 | 9097690 | 22637.53 | 16754.38 |
| 879 Akciğer Slaytı 1 | 205 | 5.22 | 167556000 | 89999000 | 68123630 | 3553860 | 9433370 | 17335.90 | 13845.69 |
| 879 Akciğer Kaydırağı 2 | 213 | 4.64 | 167931008 | 80789400 | 78489588 | 3638720 | 8652020 | 17083.19 | 14058.12 |
| 881 Akciğer Kaydırağı 1 | 1122 | 38.81 | 218880000 | 79713504 | 130893816 | 50802300 | 8272680 | 45278.34 | 22044.99 |
| 881 Akciğer Kaydırağı 2 | 628 | 21.67 | 184200992 | 74502600 | 99122692 | 21475200 | 10575700 | 34196.18 | 19857.40 |
| 882 Akciğer Kaydırağı 1 | 678 | 24.05 | 194476992 | 83941904 | 98484788 | 23684500 | 12050300 | 34932.89 | 20748.06 |
| 882 Akciğer Kaydırağı 2 | 645 | 21.93 | 185537040 | 75790040 | 101412430 | 22241700 | 8334570 | 34483.26 | 20325.11 |
| 883 Akciğer Slaydı 1 | 429 | 10.79 | 179400992 | 84955696 | 84699866 | 9138800 | 9745430 | 21302.56 | 15080.23 |
| 883 Akciğer Slaydı 2 | 342 | 85.30 | 175220992 | 76210896 | 90472386 | 77170200 | 8537710 | 225643.86 | 17078.26 |
| 884 Akciğer Kaydırağı 1 | 359 | 6.42 | 206751008 | 87752600 | 103825008 | 6669710 | 15173400 | 18578.58 | 14333.41 |
| 884 Akciğer Kaydırağı 2 | 480 | 9.12 | 200990000 | 77052496 | 111060804 | 10125700 | 12876700 | 21095.21 | 15679.88 |
| 885 Akciğer Slaydı 1 | 332 | 7.79 | 191398000 | 92896304 | 84752596 | 6605490 | 13749100 | 19896.05 | 14500.11 |
| 885 Akciğer Kaydırağı 2 | 537 | 81.02 | 187475008 | 85938000 | 89378408 | 72411104 | 12158600 | 134843.77 | 15360.29 |
| 886 Akciğer Kaydırağı 1 | 305 | 7.93 | 158435008 | 80433296 | 76541662 | 6068720 | 1460050 | 19897.44 | 14500.11 |
| 886 Akciğer Slaytı 2 | 898 | 8.84 | 155460000 | 70808600 | 83457470 | 7380490 | 1193930 | 8218.81 | 14744.92 |
Tablo 2: Sonuçların temsili tablosu. MDA-MB-231 hücreleri ile enjekte edilen fare kuyruk damarı kohortundan algoritmanın her parametresi için sonuç tablosu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Araştırmacılar metastaz için deneysel bir model olarak tümör hücrelerinin intravenöz enjeksiyonlarını kullanmaya devam ettikçe, ortaya çıkan metastatik tümör yükünü analiz etmek için standart uygulamalar eksiktir. Bazı durumlarda, belirli hücre hatlarının manipülasyonu ve/veya kimyasal bileşiklerin kullanımı üzerine metastatik tümör yükünde önemli farklılıklar makroskopik olarak gözlenebilir. Bununla birlikte, diğer durumlarda, metastatik tohumlama ve büyümedeki ince farklılıklar, kapsamlı patolojik analizler yapılmadan göz ardı edilebilir veya yanlış yorumlanabilir. Bu çalışma, metastatik akciğer tümörü yük analizinin kapsamlı bir yöntemini dahil larak daha önce yayınlanan kuyruk damarı enjeksiyon protokollerini ilerletmektedir. Daha da önemlisi, bu dijital patoloji analizi yöntemi, spontan metastaz yapabilen tümör hücrelerinin ortotopik enjeksiyonunun yanı sıra diğer deneysel metastaz modelleri (yani intra kardiyak vb.) ve hasta kaynaklı ksenograft (PDX) modellerinin ardından akciğer metastatik tümör yükünün nicelleştirilmesine de uygulanabilir. Veteriner patologlar tarafından dijital görüntüleme ve yazılım algoritması geliştirilmesinin kullanılması, metastatik akciğer tümörü yükünü analiz etmek için bu yaklaşımın tekrarlanabilirliğini, doğruluğunu ve titizliğini sağlar25.
Hücre hatlarının, hücre konsantrasyonunun ve uç noktaların daha önce yayınlanan çalışmalara veya dikkatli deneysel optimizasyona dayalı düşünceli kararı kesinlikle gereklidir. Metastatik tohumlama ve kolonileşmenin çeşitli bağışıklık hücresi popülasyonları26,27 ile etkileşimlere oldukça bağımlı olduğu göz önüne alındığında, bağışıklık yetkin farelerinin kullanımı her zaman mümkün olmasa da idealdir. Aynı nedenle, anahtar bağışıklık hücresi bileşenlerinden yoksun athymic veya NSG fareleri kullanılarak deneysel metastaz çalışmalarının yorumlanması dikkatle alınmalıdır. Bu çalışmada kullanılan MVT1 hücreleri de dahil olmak üzere FVB/N fare zorlanmasından türetilmiş birkaç fare meme tümörü hücre hattı vardır22,28,29. Diğer singeneik modeller de mevcuttur. Hücre konsantrasyonu ile ilgili olarak, çok sayıda hücre enjeksiyonu metastatik akciğer tümörü yükünü büyük ölçüde hızlandırabilir ve artırabilir. Bununla birlikte, akciğerler bunalmışsa, bireysel metastatik odakları ayırt etmek zor olabilir ve emboli oluşma olasılığı daha yüksektir. Ayrıca, kuyruk damarı enjeksiyon prosedürü, enjeksiyonları güvenli ve/veya rutin olarak gerçekleştirmeden önce geniş bir uygulama ve eğitim gerektirir. Birçok kurum teknik eğitim verecek ve uygulama amacıyla fareler sağlayabilir. İğnenin doğru yerleştirilmesi ve pürüzsüz bir enjeksiyon başarıyı göstermelidir; bununla birlikte, eğitim / uygulama amacıyla, Evans Blue boyası başarılı enjeksiyonu belirlemeye yardımcı olmak için kullanılabilir (steril PBS'de% 1). Farenin ekstremiteleri enjeksiyondan kısa bir süre sonra maviye dönecektir, ancak hayvan daha sonra ötenaziye tabi edilmelidir.
Ayrıca, görüntü analiz yazılımı tarafından slayt tarama ve analizini bozabilecek slayt yapıtlarını kontrol etmek ve önlemek için standart nekropsi ve doku örnekleme tekniklerinin önemi yeterince vurgulanamaz. Nekropsi sırasında akciğerlerin enflasyonu doku bütünlüğünü korumada kritik bir adımdır ve sonraki H&E lekelerinin yanı sıra son analizi de iyileştirir. Çözünürlük ve tekrarlanabilirlik ile tutarlılık için, bir çalışma kümesindeki tüm slaytların aynı amaçla taranmesi önerilir. Bu çalışmada, analiz edilen alanlara uygulandığında algoritma ayarlarının doğruluğunu ve tümör metastazlarının doğru tanımlanmasını sağlamak için tüm slaytlar 40x'te taranmıştır. Her slayt için, aynı akciğer lobları sürekli olarak tarandı ve her fare için analiz edildi. Ayrıca, bir patologun uygulanan algoritmanın doğruluğu için doku işaretlemelerini gözden geçirmesi ve bir çalışmadaki her slayta aynı algoritmanın uygulanması şiddetle tavsiye edilir.
Sunulan protokol deneysel tasarıma, kullanıcı tercihlerine ve istenen sonuç ölçümlerine göre değiştirilebilir. Bu değişikliklerden biri, bilinçli bir hayvan için geleneksel bir kısıtlayıcı cihaz yerine anestezi indüksiyon odasının kullanılmasını içerir. Hayvan sağlığı ve sağlıklı yaşam açısından, her iki yaklaşım da diğerinden üstün değildir ve her birinin kendi avantajlarının yanı sıra sınırlamaları vardır30. Ayrıca, siyah veya kahverengi fareler için kuyruk damarlarını görselleştirmek için bir ışık kaynağına veya ısıtma cihazına ihtiyaç duyulabilir. Damarları genişletmek için kızılötesi lambalar veya ılık bir su banyosu kullanılabilir. Ancak, sıcaklık dikkatle izlenmelidir. Ayrıca, kemirgen kısıtlama cihazlarının diğer ticari versiyonlarının yanı sıra ışıklı kısıtlama cihazları da mevcuttur. Bazı araştırmacılar enjeksiyonlar için Luer-Lok şırınçlarını tercih ediyor. Luer-Lok şırınnaları ile hava kabarcıklarını ortadan kaldırmak daha zordur, ancak bu bir tercih meselesidir. Hücrelerin canlılığı kuyruk damarı enjeksiyon prosedürü için önemli bir husustur ve bu nedenle, doğru hücre sayımlarının yanı sıra enjeksiyondan önce hücrelerin buz üzerinde tutulması gerekli adımlardır. Akciğer tohumlama ve manipüle hücre çizgilerinin kolonizasyonunu karşılaştırırsak, enjeksiyondan önce hücre büyüklüğü ve canlılığındaki farklılıkları belirlemek önemlidir, çünkü bunlar sonuçların yorumlanmasını zorlaştırabilir. Dar bir iğne kullanılırken hücre ölümü ve/veya hasar oluşabilir; bununla birlikte, hayvana ağrı ve rahatsızlık verebileceğinden 25 G'den büyük bir iğne kullanılması önerilmez.
Akciğer lezyonlarının enjekte edilen tümör hücreleri tarafından oluştuğunu doğrulamanın bir yolu olarak doku bölümlerinde immünostainleme yapılabilir. İnsan hücre hatları kullanılıyorsa, metastatik lezyonları ayırt etmek için insana özgü antikorlar kullanılabilir. Alternatif olarak, etiketli hücre hatları (örneğin, GFP) kullanılıyorsa, karşılık gelen antikorlar kullanılabilir. Ayrıca, birçok meme kanseri hücre hattı epitel belirteçleri (örneğin, sitokeratinler, E-cadherin ve EpCAM) için pozitiftir, ancak önceden ifade bilgisi esastır. Bununla birlikte, hava yollarını kaplayan akciğer epitelleri de bu belirteçler için olumlu olacaktır ve bu nedenle yapı da göz önünde bulundurulmalıdır. Primer akciğer tümörü gelişiminin göz ardı edilmesi gereken durumlar olabilir. Bunun için Tiroid Transkripsiyon Faktörü-1 (TTF1) için immünohistokimyasal lekeleme primer akciğer adenokarsinomunun bir belirteci olarak kullanılabilir. TTF1 boyama sertifikalı bir patolog tarafından değerlendirilmelidir.
Burada, kurulan akciğer metastaz algoritması boyut olarak değişen metastazların doğru tespiti için ince ayar yapılmadığından, Karar Ormanı sınıflandırma algoritması kullanılarak özel bir algoritma yazılmıştır. Bu özelleştirilmiş algoritma karmaşık ölçümlere olanak tanır, metastazların boyuta göre doğru segmentasyonuna izin verir ve küçük yanlış şekillendirilmiş alanların ve normal yapıların yanlış yorumlanmaması ve bu nedenle son veri kümesine dahil edilebilmesi için boyut kesmeyi destekler. Bu algoritmanın çoğu in vivo akciğer metastazı çalışması için geçerli olacağını öngörüyoruz, ancak kullanıcıların bireysel çalışma ihtiyaçlarına uyacak şekilde yazılım içindeki ayarları yapması gerekebilir. Bununla birlikte, bu algoritma akciğer metastatik yükünü benzer şekilde analiz etmek isteyen araştırmacılar için bir platform görevi görür. Görüntü analizi platformları için erişim veya kullanılabilirlik, maliyet ve eğitimin yanı sıra deneyim düzeyinin kullanmak için en iyi platformu belirleyebileceği birçok farklı seçenek vardır36. Seçenekler arasında QuPath gibi ücretsiz platformlar ve Visiopharm gibi daha pahalı, ancak sofistike platformlar bulunur. Belirli bir araştırma projesi için hangi platformun mevcut ve en iyi şekilde kullanılabileceğine karar verirken bir görüntü analizi patoloji çekirdeğine ve patoloğa danışmanız önerilir.
Spontan fare meme tümörü modelleri (örneğin, MMTV-PyMT) veya ortotopik meme yağ pedi enjeksiyon yöntemleri akciğer metastazını incelemek için fizyolojik olarak en alakalı modeli temsil eder. Kuyruk damarı enjeksiyon modelinin ciddi bir dezavantajı, tam metastatik kaskadı rekapitüle etmemesi ve bu nedenle tümör hücre ekstravazasyonu ve sekonder organ kolonizasyonu çalışması ile sınırlı olmasıdır. Bununla birlikte, bu deneysel metastaz modeli meme kanseri araştırmaları için geçerlidir, çünkü kuyruk damarı enjeksiyonundan sonra oluşan akciğer metastazları, aynı hücrelerin ortotopik implantasyonundan sonra gelişen metastatik lezyonlara benzer genomik profillere sahiptir31. Akciğer metastaz modeli oluşturmak için, tohumlama, immün reaksiyon ve uyuşukluk ile ilgili olduğu için metastaz sürecini doğru bir şekilde temsil edemeyen çok sayıda hücre genellikle intravenöz olarak enjekte edilir. Ayrıca, dolaşım yoluna dayanarak, pulmoner metastazlar en çok kuyruk damarı enjeksiyonu ile yaygındır32. Çoğu meme kanseri hücre hattında, yayınlanan raporlar kuyruk damarı enjeksiyonundan sonra kemik, karaciğer veya beyin metastazlarının nispeten düşük bir insidansını göstermektedir7. İntradiyak, intratibial, portal ven ve intraarotid enjeksiyonları gibi alternatif deneysel metastaz yöntemleri diğer bölgelere metastazların incelenmesi için daha uygundur33,34,35,36,37. Yine metastatik kaskadın tüm adımlarını rekapitüle eden spontan meme tümörü modelleri veya ortotopik yağ pedi enjeksiyon yöntemleri tercih edilmektedir. Tutarlı metastatik tümör yükü, çalışma süresi ve bu tür çalışmalar için gerekli hayvan sayısı ile ilgili sorunlar bir dezavantajdır. Ancak burada sunulan dijital patoloji analizi yöntemi herhangi bir spontan veya deneysel metastaz modeli ile oluşan akciğer metastazlarına uygulanabilir.
Analiz yöntemi, algoritma oluşturmada öznellik gibi belirli sınırlamalar da doğurur. Tüm slayt görüntüleme, tüm doku bölümünde ve tek bir farenin tüm akciğer loblarında dijital analize izin verse de, 3D dokunun iki boyutlu analizi ile sınırlıdır. Stereoloji, görüntü analizi için 3D bilgiler elde eden ve doku işleme sırasında ortaya çıkan doku büzülmesi gibi faktörleri hesaba katabilen yaygın bir uygulama haline gelmektedir38. Bununla birlikte, stereolojinin doku, kaynak ve zaman kısıtlamaları gibi kendi sınırlamaları vardır.
Hastalıklarının metastatik yayılımından etkilenen kanser hastalarının sayısı göz önüne alındığında, metastazı incelemek için kuyruk damarı enjeksiyon yöntemi, metastatik yayılmanın karmaşık biyolojisini anlamak ve yeni terapötiklerin klinik öncesi etkinliğini belirlemek açısından yararlı bir araç olmaya devam edecektir. Metastazın in vivo fare modelleri, özellikle bağışıklık yetkin hayvanları kullananlar, immünoterapiye olan yaygın ilgi göz önüne alındığında kanser araştırmaları için daha da önemli hale gelmektedir29. Ayrıca deneysel metastaz modelleri metastaz baskılayıcı genlerin araştırılması açısından kritik öneme sahiptir (yani primer tümör büyümesini etkilemeden kanser hücrelerinin metastatik potansiyelini baskılayanlar) ve bu nedenle değerli bir araştırma aracı olmaya devam eder.
Dijital görüntüleme ve slayt analizi, tanısal ve deneysel fare modellemesinde hızla bir dayanak noktası haline gelmiştir39. Akciğer metastatik tümör yükünü analiz etmek için burada açıklanan yaklaşım türünü kullanmak, daha kapsamlı ve doğru bir şekilde yüksek verim analizlerine izin verecektir. Ayrıca, dijital görüntüleme patolojisi, meme kanseri metastazının fare modelleri gibi alanlarda uzmanlaşmış patologları içeren daha işbirlikçi araştırma projeleri için bir yol sağlar. Multipleks doku görüntüleme yöntemleri ve 3D görüntüleme teknolojileri (yukarıda belirtildiği gibi) geliştirilmeye devam ettikçe, dijital görüntüleme patolojisi, görüntü analizi için sofistike yazılım programları ve patoloji uzmanlarının uzmanlığı metastaz araştırmalarını ilerletmek için kesinlikle gerekli olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Temsili veriler Ulusal Kanser Enstitüsü (K22CA218549 ila S.T.S) aracılığıyla finanse edildi. Burada bildirilen kapsamlı analiz yönteminin geliştirilmesindeki yardımlarına ek olarak, histoloji ve immünofizyotimya hizmetleri için Ohio Eyalet Üniversitesi Kapsamlı Kanser Merkezi Karşılaştırmalı Patoloji ve Fare Fenotipleme Paylaşılan Kaynağına (Direktör – Krista La Perle, DVM, PhD) ve algoritma geliştirme ve analiz için Patoloji Görüntüleme Çekirdeğine teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| alcohol prep pads | Fisher Scientific | 22-363-750 | for cleaning tail prior to injection |
| dissection scissors | Fisher Scientific | 08-951-5 | for mouse dissection and lung tissue inflation |
| DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | MT10013CV | cell culture media base for MDA-MB-231 and MVT1 cell lines |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x | Fisher Scientific | MT21030CV | used for resuspending tumor cells for injection |
| ethanol (70 % solution) | OSU | used to minimize mouse's fur during dissection; use caution - flammable | |
| Evan's blue dye | Millipore Sigma | E2129 | used at 1 % in sterile PBS for practice with tail-vein injection method; use caution - dangerous reagent |
| Fetal Bovine Serum | Millipore Sigma | F4135 | cell culture media additive; used at 10% in DMEM |
| forceps | Fisher Scientific | 10-270 | for dissection and lung tissue inflation |
| FVB/NJ mice | The Jackson Laboratory | 001800 | syngeneic mouse strain for MVT1 cells |
| hemacytometer (Bright-Line) | Millipore Sigma | Z359629 | for use in cell culture to obtain cell counts |
| insulin syringe (28 G) | Fisher Scientific | 14-829-1B | for tail-vein injections (BD 329424) |
| MDA-MB-231 cells | ATCC | human breast cancer cell line | |
| MVT1 cells | mouse mammary tumor cells | ||
| needles (26 G) | Fisher Scientific | 14-826-15 | used to inflate the mouse's lungs |
| neutral buffered formalin (10%) | Fisher Scientific | 245685 | used as a tissue fixative and to inflate lung tissue; use caution - dangerous reagent |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice | The Jackson Laboratory | 005557 | maintained by OSUCCC Target Validation Shared Resource |
| Penicillin Streptomycin 100x | ThermoFisher | 15140163 | cell culture media additive |
| sterile gauze | Fisher Scientific | NC9379092 | for applying pressue to mouse's tail if bleeding occurs |
| syringe (5 mL) | Fisher Scientific | 14-955-458 | used to inflate mouse lung tissue |
| tail-vein restrainer | Braintree Scientific, Inc. | TV-150 STD | used to restrain mouse for tail-vein injections |
| Trypan blue (0.4 %) | ThermoFisher | 15250061 | used in cell culture to assess viability |
| Trypsin-EDTA 0.25 % | ThermoFisher | 25200-114 | used in cell culture to detach tumor cells from plate |
References
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nature Reviews: Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).
- Steeg, P. S.
- Gupta, G. P., Massague, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127 (4), 679-695 (2006).
- Steeg, P. S. Tumor metastasis: mechanistic insights and clinical challenges. Nature Medicine. 12 (8), 895-904 (2006).
- Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331 (6024), 1559-1564 (2011).
- Eckhardt, B. L., Francis, P. A., Parker, B. S., Anderson, R. L. Strategies for the discovery and development of therapies for metastatic breast cancer. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (6), 479-497 (2012).
- Gomez-Cuadrado, L., Tracey, N., Ma, R., Qian, B., Brunton, V. G. Mouse models of metastasis: progress and prospects. Disease Models & Mechanisms. 10 (9), 1061-1074 (2017).
- Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Research. 8 (4), 212 (2006).
- Schoenenberger, C. A., et al. Targeted c-myc gene expression in mammary glands of transgenic mice induces mammary tumours with constitutive milk protein gene transcription. EMBO Journal. 7 (1), 169-175 (1988).
- Nusse, R., Varmus, H. E. Many tumors induced by the mouse mammary tumor virus contain a provirus integrated in the same region of the host genome. Cell. 31 (1), 99-109 (1982).
- Muller, W. J., Sinn, E., Pattengale, P. K., Wallace, R., Leder, P. Single-step induction of mammary adenocarcinoma in transgenic mice bearing the activated c-neu oncogene. Cell. 54 (1), 105-115 (1988).
- Lin, E. Y., et al. Progression to malignancy in the polyoma middle T oncoprotein mouse breast cancer model provides a reliable model for human diseases. American Journal of Pathology. 163 (5), 2113-2126 (2003).
- Green, J. E., et al. The C3(1)/SV40 T-antigen transgenic mouse model of mammary cancer: ductal epithelial cell targeting with multistage progression to carcinoma. Oncogene. 19 (1), 1020-1027 (2000).
- Iorns, E., et al. A new mouse model for the study of human breast cancer metastasis. PloS One. 7 (10), 47995 (2012).
- Kim, I. S., Baek, S. H. Mouse models for breast cancer metastasis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 394 (3), 443-447 (2010).
- Mariotto, A. B., Etzioni, R., Hurlbert, M., Penberthy, L., Mayer, M. Estimation of the Number of Women Living with Metastatic Breast Cancer in the United States. Cancer Epidemiology, Biomarkers and Prevention. 26 (6), 809-815 (2017).
- Xiao, W., et al. Risk factors and survival outcomes in patients with breast cancer and lung metastasis: a population-based study. Cancer Medicine. 7 (3), 922-930 (2018).
- Smid, M., et al. Subtypes of breast cancer show preferential site of relapse. Cancer Research. 68 (9), 3108-3114 (2008).
- Kennecke, H., et al. Metastatic behavior of breast cancer subtypes. Journal of Clinical Oncology. 28 (20), 3271-3277 (2010).
- Soni, A., et al. Breast cancer subtypes predispose the site of distant metastases. American Journal of Clinical Pathology. 143 (4), 471-478 (2015).
- Leone, B. A., et al. Prognostic impact of metastatic pattern in stage IV breast cancer at initial diagnosis. Breast Cancer Research and Treatment. 161 (3), 537-548 (2017).
- Pei, X. F., et al. Explant-cell culture of primary mammary tumors from MMTV-c-Myc transgenic mice. In Vitro Cellular and Developmental Biology: Animal. 40 (1-2), 14-21 (2004).
- Mathsyaraja, H., et al. CSF1-ETS2-induced microRNA in myeloid cells promote metastatic tumor growth. Oncogene. 34 (28), 3651-3661 (2015).
- Yang, S., Zhang, J. J., Huang, X. Y. Mouse models for tumor metastasis. Methods in Molecular Biology. 928, 221-228 (2012).
- La Perle, K. M. D. Comparative Pathologists: Ultimate Control Freaks Seeking Validation. Veterinary Pathology. 56 (1), 19-23 (2019).
- Blomberg, O. S., Spagnuolo, L., de Visser, K. E. Immune regulation of metastasis: mechanistic insights and therapeutic opportunities. Disease Models & Mechanisms. 11 (10), (2018).
- Gonzalez, H., Hagerling, C., Werb, Z. Roles of the immune system in cancer: from tumor initiation to metastatic progression. Genes and Development. 32 (19-20), 1267-1284 (2018).
- Borowsky, A. D., et al. Syngeneic mouse mammary carcinoma cell lines: two closely related cell lines with divergent metastatic behavior. Clinical and Experimental Metastasis. 22 (1), 47-59 (2005).
- Yang, Y., et al. Immunocompetent mouse allograft models for development of therapies to target breast cancer metastasis. Oncotarget. 8 (19), 30621-30643 (2017).
- Resch, M., Neels, T., Tichy, A., Palme, R., Rulicke, T. Impact assessment of tail-vein injection in mice using a modified anaesthesia induction chamber versus a common restrainer without anaesthesia. Laboratory Animals. 53 (2), 190-201 (2019).
- Rashid, O. M., et al. Is tail vein injection a relevant breast cancer lung metastasis model. Journal of Thoracic Disease. 5 (4), 385-392 (2013).
- Goodale, D., Phay, C., Postenka, C. O., Keeney, M., Allan, A. L. Characterization of tumor cell dissemination patterns in preclinical models of cancer metastasis using flow cytometry and laser scanning cytometry. Cytometry Part A. 75 (4), 344-355 (2009).
- Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
- Wright, L. E., et al. Murine models of breast cancer bone metastasis. BoneKEy Reports. 5, 804 (2016).
- Simmons, J. K., et al.
- Liu, Z., et al. Improving orthotopic mouse models of patient-derived breast cancer brain metastases by a modified intracarotid injection method. Scientific Reports. 9 (1), 622 (2019).
- Kodack, D. P., Askoxylakis, V., Ferraro, G. B., Fukumura, D., Jain, R. K. Emerging strategies for treating brain metastases from breast cancer. Cancer Cell. 27 (2), 163-175 (2015).
- Brown, D. L. Practical Stereology Applications for the Pathologist. Veterinary Pathology. 54 (3), 358-368 (2017).
- Aeffner, F., et al. Digital Microscopy, Image Analysis, and Virtual Slide Repository. Institute for Laboratory Animal Research Journal. 59 (1), 66-79 (2018).
Tags
Kanser Araştırması Sayı 159 kuyruk damarı enjeksiyonu meme kanseri akciğer metastazı H&E lekeli bölümler nicel dijital patoloji görüntü analiziErratum
Formal Correction: Erratum: Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells
Posted by JoVE Editors on 12/02/2020.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells. The author list was updated.
The author list was updated from:
Katie A. Thies1, Sue E. Knoblaugh2, and Steven T. Sizemore1
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center
2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University
to:
Katie A. Thies1, Sarah Steck1, Sue E. Knoblaugh2, and Steven T. Sizemore1
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center
2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University
