ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
암세포의 정맥 주사는 전이 연구에서 자주 사용되지만 전이성 종양 부담은 분석하기 어려울 수 있습니다. 본명, 전이의 꼬리 정맥 주사 모델을 시연하고 결과전이성 폐 종양 부담을 분석하는 새로운 접근법을 포함한다.
Abstract
대부분의 암 환자를 위한 이환율 과 사망의 1차 원인인 전이는 마우스에서 전임상적으로 모델링하는 것이 어려울 수 있습니다. 몇 가지 자발적인 전이 모델을 사용할 수 있습니다. 따라서, 적절한 세포주의 꼬리 정맥 주입을 포함하는 실험전이 모델은 전이 연구의 주축이다. 암세포가 측면 꼬리 정맥에 주입될 때, 폐는 식민지화의 그들의 바람직한 사이트입니다. 이 기술의 잠재적 인 제한은 전이성 폐 종양 부담의 정확한 정량화입니다. 몇몇 조사자는 사전 정의된 크기의 macrometastases를 계산하고 조직의 단면 다음 micrometastases를 포함하는 동안, 그 외는 일반적인 조직 지역에 근거를 둔 전이성 병변의 지역을 결정합니다. 이 두 정량화 방법 모두 전이성 부담이 높을 때 매우 어려울 수 있습니다. 본명, 우리는 영상 분석 소프트웨어를 사용하여 전이성 종양 부담을 정량화하는 고급 방법에 이어 폐 전이의 정맥 주사 모델을 시연한다. 이 프로세스를 통해 평균 전이 크기, 총 전이 수 및 총 전이 영역을 포함한 다중 엔드 포인트 매개 변수를 조사하여 포괄적인 분석을 제공할 수 있습니다. 또한, 이 방법은 정확도를 보장하기 위해 미국 수의병리학자(SEK)에서 인증한 수의병리학자 위원회에 의해 검토되었습니다.
Introduction
매우 복잡하고 비효율적인 과정임에도 불구하고1, 전이는 암 환자의 이환율과 사망률에 중요한 기여이다2. 사실, 대부분의 암 관련 죽음은 질병의 전이성 퍼짐에 기인합니다3,4. 종양 세포가 성공적으로 전이되기 위하여는, 그(것)들은 1 차 적인 사이트에서 분리하고, 인접한 기질기를 통해 침략하고, 혈액 순환 또는 림프로 침입하고, 이차 사이트의 모세관 침대로 여행하고, 이차 조직으로 사치스럽게, 증식하거나 전이성 병변을 형성하기 위하여 증가하거나 성장해야 합니다. 마우스 모델의 사용은 전이성 파종 및 growth6,7을 담당하는 분자 메커니즘의 이해를 증진하는 데 매우 중요했습니다. 본명, 우리는 유방암 전이에 초점을 맞추고, 유전자 변형 마우스 모델뿐만 아니라 이식 방법이 종종 사용되는 - 장점과 한계의 자신의 세트와 각각.
유전자 조작 된 유방 종양 모델은 MMTV-LTR (마우스 유방 종양 바이러스 긴 말단 반복) 및 WAP (유청 산성 단백질)를 포함한 유방 선및 특정 프로모터를 사용하여 유방 상피8에서 트랜스 유전자의 발현을 유도합니다. 폴리마 중형 T 항원(PyMT), ErbB2/Neu, c-Myc, Wnt-1 및 simian 바이러스 40(SV40)을 포함한 온코진은 이러한 방식으로 발현되었으며, 이러한 유전 적 모델은 1차 종양 개시 및 진행을 연구하는 데 유용하지만, 몇 가지 판독적으로 대사를 거친 장기에 대해 보다 쉽게 대사한다. 더욱이, 이러한 유전 마우스 모델은 종종 자발적 또는 실험 전이 모델보다 더 많은 시간과 비용이 금지된다. 전이를 연구하기 위해 대부분의 유전자 조작 된 유방 종양 모델의 한계를 감안할 때, 이식 기술은이 복잡한 과정을 연구하는 매력적인 방법이되고있다. 여기에는 직교, 꼬리 정맥, 심장 내 및 적합한 세포주의 두개 내 주입이 포함됩니다.
여러 유방암 세포주가 유방 지방 패드14,15로 직교 주입에 따라 쉽게 전이되지만, 전이성 종양 부담의 일관성과 재현성은 도전이 될 수 있으며, 이러한 연구의 기간은 몇 달의 순서에 있을 수 있습니다. 폐 전이를 평가하기 위해, 특히, 꼬리 정맥내의 정맥 주사는 종종 전이성 확산이 일반적으로 몇 주 내에 발생하는 보다 재현 가능하고 시간 효율적인 방법입니다. 그러나, 정맥 주사 모델은 전이성 캐스케이드의 초기 단계를 우회하기 때문에, 이러한 연구의 결과를 해석에주의를 기울여야한다. 이 데모에서는 정확하고 포괄적인 분석 방법과 함께 유방 종양 세포의 꼬리 정맥 주입을 보여줍니다.
연구 공동체가 유방암 전이의 복잡한 과정을 이해하는 데 상당한 진전을 이루었음에도 불구하고 현재 150,000명 이상의 여성이 전이성 유방암16을 가지고 있는 것으로 추정됩니다. 단계 IV 유방암을 가진 사람들의, >36% 환자의 폐 전이17이 있습니다; 그러나, 전이의 부위 별 패턴 및 발생률은 분자 하위타입18,19,20,21에 따라 달라질 수 있다. 유방암 관련 폐 전이를 가진 환자는 이 질병을 위한 효과적인 처리 및 새로운 biomarkers를 확인하는 필요를 강조하는 단지 21 달의 중앙 생존이 17. 종양 세포의 정맥 주사를 포함하여 실험적인 전이 모형의 사용은, 이 중요한 임상 도전의 우리의 지식을 계속 전진할 것입니다. 디지털 이미징 병리학 및 이 프로토콜 내에서 설명된 전이성 폐 종양 부담 분석 방법과 결합될 때, 꼬리 정맥 주사는 유방암 전이 연구를 위한 귀중한 도구입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
동물 사용은 OSU 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)-승인 프로토콜 2007A0120-R4 (PI: 지나 사이즈모어 박사)에 따라 대학 실험실 동물 자원 (ULAR) 규정을 따랐다.
1. 유방암 세포의 꼬리 정맥 주입
- 세포 및 주사 주사기 의 준비
- 사용되는 마우스 및 세포 농도의 수에 따라 적절한 수의 세포를 플레이트.
참고: 전이의 발달에 주입된 세포의 수와 시간은 사용된 세포주에 따라 달라지며 최적화되어야 합니다. 본 데모에서, 1 x 106 MDA-MB-231 세포는 NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(NSG) 마우스로 정맥주사되고, 거시성 폐 병변은 24일 이내에 사후 주입 후 관찰된다. MVT1 뮤린 유방 종양 세포 17의 경우, 3 x 106 세포는 14일22,23에 의해 관찰된 수많은 폐 전이를 가진 면역 유능한 FVB/N 마우스로 주입된다. - 1x PBS로 세포판을 흡입하고 헹구세요. 트립시니징 셀을 최소한의 부피로, 적절한 양의 매체를 추가하고, 혈종계 또는 다른 바람직한 방법을 사용하여 세포를 계산합니다. Trypan 파란색(0.4%) 또는 기타 라이브/데드 셀 염료를 사용하여 실행 가능한 세포 수를 결정할 수 있습니다.
- 펠릿 셀은 180 x g 에서 5 분 동안 회전합니다.
- 마우스당 100 μL의 부피가 주입되는 멸균 1x PBS에서 적절한 수의 세포를 재일시 중단합니다. 생존력을 유지하기 위해 얼음에 세포 현탁액을 유지합니다.
- 주입 하기 전에, 완전히 응고를 피하기 위해 200 μL 또는 1 mL 파이펫으로 세포를 다시 중단. 28G 인슐린 주사기에 100 μL을 그립니다( 재료 표 참조).
- 주사기를 수직으로 유지하고 주사기를 두드리고 플런저를 천천히 조정하여 기포를 제거하십시오. 정맥에 기포를 주입하면 치명적일 수 있는 공기/가스 색전증이 발생할 수 있습니다.
- 사용되는 마우스 및 세포 농도의 수에 따라 적절한 수의 세포를 플레이트.
- 측면 꼬리 정맥 주입
참고: 실험적인 유방암 전이 assays를 위해, 주사는 6주 된 암컷 마우스를 > 수행됩니다.- 꼬리에 의해 마우스를 처리하고 적절한 크기의 슬롯 튜브 / 구속 장치로 동물을 밀어 넣습니다 (사용되는 구속 장치에 대한 재료 표 참조).
- 구속 장치의 플러그 부분을 삽입하고 측면 꼬리 정맥이 쉽게 볼 수 있도록 측면에 마우스를 배치합니다. 마우스는 생식기, 등류 정맥 및 2 개의 측면 카우달 정맥에 맞춰 복부 동맥을 가지고 있습니다.
- 무균 닦아 마우스 꼬리의 표면을 청소합니다. 검지 손가락과 엄지 손가락 사이의 꼬리를 지배적이지 않은 손으로 잡고 약간의 긴장을 가합니다.
- 꼬리의 말단 부분에서 시작하여, 벨끝으로 정맥에 평행하게 바늘을 삽입한다.
- 허용되는 경우 조심스럽게 바늘 을 다시 캡 하고 20-30 ° 각도로 구부립니다. 한 손으로 접근하거나 바늘 재래핑 장치를 적극 권장합니다.
참고: 정맥이 붕괴될 수 있으므로 흡인할 필요는 없습니다. 그러나, 혈액의 작은 플래시처음 배치 될 때 볼 수 있습니다. 바늘은 적절한 배치와 정맥으로 원활하게 진행됩니다. - 전체 볼륨을 정맥에 천천히 분배합니다. 플런저를 밀어붙일 때 저항해서는 안 됩니다.
- 저항이 느껴지면 주사기 바늘을 즉시 제거하십시오. 필요한 경우 꼬리의 근위 쪽 끝으로 이동하거나 측면 정맥을 반대하는 바늘 (이상적으로 3 번 이상 시도)을 다시 삽입하십시오.
- 소량의 혈액은 주사 후 대체 될 가능성이 높습니다. 멸균 거즈로 부드러운 압력을 가하고 무균 닦아 닦아냅니다.
- 즉시 적절한 날카로운 용기에 주사기를 폐기하십시오.
- 마우스를 깨끗하고 통풍이 잘 되는 케이지로 되돌리고 고통의 징후를 모니터링합니다.
- 전이 형성의 징후 (노동 호흡, 구부러진 자세, 체중 감소) 및 일반적인 고민에 대한 마우스 2-3x / 매주 모니터링. 전이의 발달 시간은 세포주와 마우스 변형에 달려 있습니다.
- 생체 내 살아있는 동물 영상 장치를 사용하는 경우, 화상 마우스는 세포의 성공적인 주입을 확인하고 시간 "제로"데이터를 얻기 위해 꼬리 정맥 주입 직후 (생체 내 생체 발광 화상 진찰에 대한 구체적인 세부 사항은 본원에 포함되지 않지만 양 외 24에 의해 설명된다).
2. 폐 조직 고정 및 전이성 폐 종양 부담의 분석
- 조직 병리학을 위한 폐의 구조적 형식을 유지하기 위한 폐 조직 인플레이션
- 승인된 안락사 절차(예: 챔버 부피/분의 30-70% 변위)가 뒤따르고, 핀이 있는 해부판에 마우스 시체를 고정한다. 해부 중에 마우스의 털을 막기 위해 70%의 에탄올을 스프레이하거나 바르십시오.
참고: 이산화탄소 질식은 특히 느린 유량에서 예상되는 배경 병변으로 폐 출혈을 일으킬 수 있습니다. - 중음절절로 흉부를 열고 복막을 통해 절개/캐니드를 확대하고, xyphoid 과정을 파악하여 다이어프램을 잘라냅니다.
- 별도의 가위를 사용하여 블레이드를 무디게하지 않고 흉골의 양쪽을 따라 갈비뼈를 자르고 조심스럽게 갈비뼈를 제거하여 폐가 확장 될 수있는 공간을 남겨 둡시하십시오.
- 하안 타액 땀샘과 적외선 근골격계를 제거하여 기관지를 분리합니다. 기관의 양쪽에 핀을 배치하면 바늘 삽입 중에 원치 않는 움직임을 방지 할 수 있습니다.
- 26 G 주사기를 2-3mL의 10% 중성 버퍼포름으로 채우고 기관지에 삽입한다.
- 천천히 포르말린을 주입하고 폐가 팽창하는 것을 감시합니다 (일반적으로 포르말린의 ~ 1.5 mL이 필요합니다).
- 포르말린이 폐에서 누출하기 시작하면 (인플레이션을 피하기), 한 쌍의 집게로 기관을 꼬집어 주사기 바늘을 제거하고 전체 호흡기 장치를 분리하십시오. 조직의 추가 트리밍이 수정 후 수행 할 수 있기 때문에 폐, 심장 등을 포르말린에 직접 배치하십시오.
- 표준 방법을 사용하여 완전한 처리, 포함, 조직의 단면, 헤마톡시린 및 에오신 (H&E) 염색.
- 승인된 안락사 절차(예: 챔버 부피/분의 30-70% 변위)가 뒤따르고, 핀이 있는 해부판에 마우스 시체를 고정한다. 해부 중에 마우스의 털을 막기 위해 70%의 에탄올을 스프레이하거나 바르십시오.
- 전이성 폐 종양 부담 분석
- 40배율의 고해상도 슬라이드 스캐너에서 H&E 염색 폐 단면을 스캔합니다(그림 3).
- 폐 전이의 정량화를 위해 이미지 분석 소프트웨어(예: Visiopharm 이미지 분석)로 이미지를 가져옵니다.
참고: 새 사용자는 이미지 분석 소프트웨어를 사용하기 위해 현장 또는 온라인 교육을 받는 것이 좋습니다. 수많은 웨비나 도 상용 웹 페이지를 통해 사용할 수 있습니다. - 소프트웨어의 앱 라이브러리에서 Visiopharm 10118 H&E 폐 전이 앱을 선택합니다.
참고 : 이 응용 프로그램의 목적은 H&E 스테인드 슬라이드에 폐 전이를 표시하고 정량화하는 것입니다. 10118 H&E 폐 전이 앱의 일환으로, 첫 번째 이미지 처리 단계는 조직 검출 앱으로 폐 조직을 분할합니다. 두 번째 이미지 처리 단계는 폐 조직 내부의 전이를 식별하는 전이 감지 앱을 사용합니다. 전이는 전이로 식별되기에 대해 너무 잘못 모양이 있거나 너무 빨갛거나 너무 희소한 영역과 함께 모양을 통해 식별됩니다. - 모양과 희소성 을 정의하는 매개 변수를 조정하여 대표 이미지에 가장 잘 맞춥니다. 종양 전이 및 정상 폐 조직의 분할 영역은 각 조직 유형에 대해 상이한 색 레이블을 사용하여 표시될 수 있다.
참고: 앱이 정상 폐 조직과 전이를 정확하게 분리할 수 없는 경우, Visiopharm 결정 포리스트 프로그램을 사용하는 사용자 지정 앱은 실험에 대해 수행한 대로 작성해야 할 수 있습니다( 그림 2 및 그림 3 참조). 사용자 지정 알고리즘 작성에 대한 자세한 내용은 아래를 따릅니다. 그렇지 않으면 2.2.9 단계로 진행하십시오. - 원하는 이미지에 여러 클래스 (즉, 폐 조직 (비 신생물), 전이, 적혈구, 상피 및 / 또는 공백을 훈련하여 작동하는 결정 숲 프로그램을 엽니 다. 도 2에서 종양 전이는 파란색이고 정상 조직은 녹색이며 기관지 상피는 노란색입니다. 또한 적혈구는 빨간색과 공기 공간에 분홍색으로 되어 있습니다.
- 이미지에 대한 각 클래스 를 적절하게 교육하기 위해 예 또는 아니오 질문의 프롬프트 시리즈를 따르십시오. 알고리즘의 정확도는 예/아니오 질문의 수를 결정합니다. 분석을 위해 사용자 지정 알고리즘/앱은 정확도를 50(범위 0-100 범위)으로 설정하여 작성되었습니다.
- 알고리즘/앱의 정확도를 높이기 위해 필터를 적용하여 각 클래스의 기능을 조정하여 알고리즘/앱의 정확도를 향상시킵니다. 피처는 클래스가 이미지를 보는 방식을 변경하여 특정 색상이나 강도를 가져옵니다.
참고: 사용자 지정 알고리즘의 경우 8500 μm2 이상을 측정하는 전이가 전이로 표시되고 측정됩니다. 이것은 크기 차이를 차지하고 전이가 너무 작아서 감지할 수 없습니다. 8500 μm2 미만의 작은 모양의 영역과 작은 전이성 영역이 정상 조직 정량화에 포함되었다. - 앱 또는 사용자 지정 알고리즘에서 수정된 설정을 저장한 다음 알고리즘/앱을 전체 집합 또는 일련의 H&E 염색 조직에 적용합니다.
- 마지막으로 표 1에 나열된 변수를 포함하는 모든 출력 변수를 내보냅니다. 미크론 제곱(μm2)의 면적은 각 조직 유형에 대해 정량화될 수 있으며 백분율은 표본 총 순 조직 영역(즉, 총 조직 마이너스 공공간)으로부터 유래된다.
- 사용자 지정 알고리즘을 만들 때, 정확한 측정을 보장하고 조직 유형을 구별하기 위해 수의 병리학자 보드 인증 수의 병리학자와 협의하여 조직 마크업을 검토하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
꼬리 정맥 주사를 위해 표지가 없는 세포를 사용하는 경우, (1) 거세메타제가 관찰될 수 있는 경우 또는 (2) 현미경 전이가 존재하는 경우 내시경 분석 후 부검 시간까지 폐 식민지화를 확인하기 어려울 수 있다. 광범위한 전이성 폐 종양 부담으로 마우스는 호흡을 수고하게 됩니다. 어떤 종양 연구와 마찬가지로, 마우스는 주의 깊게 연구 기간 내내 감시되어야 합니다. 표지 된 세포의 사용은 성공적인 꼬리 정맥 주입을 확인하는 쉬운 방법입니다; 따라서 데모에서 luciferase 태그 MDA-MB-231 세포의 사용. 그러나 생체 내 이미징이 실험 설계 및 기타 요인에 따라 항상 가능하거나 필요한 것은 아닙니다. 도 1A는 정확한 주입의 확인으로 루시파라래이태그 MDA-MB-231 세포의 꼬리 정맥 주입 후 2 시간 미만 흉부 공간에서 생물 발광 신호를 나타낸다. 이 실험의 경우, 흉부 부위의 광자 수는 시간이 지남에 따라 증가하고 강력한 생물 발광 신호가 24 일째에 존재합니다(도 1B 및 C; 스케일 바의 변화를 기록). 부검 시, 이들 마우스에서 많은 거시성 폐 병변이 관찰되었다(도 1D).
적절한 조직 처리 및 염색 후 H&E 염색 폐 단면을 스캔하거나 이미지화할 수 있습니다. 전이성 폐 종양 부담 정량화는 이미지 분석 소프트웨어 및 사용자 지정 알고리즘을 사용하여 효과적으로 달성될 수 있다. 사용자 지정 알고리즘을 사용하여 전체 폐 조직은 다른 조직 특징(도 2A 및 B)에 의해 세분화됩니다. 이러한 방식으로 폐 조직을 분할함으로써, 소프트웨어는 표 1에 나열된 다양한 매개 변수를 정량화할 수 있다. 이러한 분석은 MDA-MB-231 세포로 주입된 마우스로부터 폐 조직에 대해 수행되었으며, 그 다음에전이성 식민지 또는 차량 제어(DMSO)를 차단하도록 설계된 약물로 치료를 받고 있다. 이 분석의 원시 데이터는 표 2에 표시됩니다. 더욱이, 도 3A는 DMSO 또는 약물 처리마우스에서 MDA-MB-231 폐 전이의 대표적인 H&E 영상을 보여줍니다. 이러한 치료군 간의 전이성 종양 부담의 차이는 폐 결절의 총 수가 다르지 않기 때문에 쉽게 간과되었을 수 있지만, 모든 파라미터의 포괄적인 분석은 백성 폐 전이 영역(도 3B,C)에서 유의한 차이를 나타낸다. 이는 본원에 기재된 방법과 같은 전이성 폐 종양 부담을 분석하기 위한 포괄적이고 철저한 접근법의 필요성을 강조한다.
그림 3에 제시된 데이터의 경우, 모든 통계 분석은 그래프패드 프리즘 7을 사용하여 수행되었다. 데이터는 D'Agostino-Pearson 옴니버스, 샤피로-윌크, 콜모고로프-스미르노프 와 같은 표준 정상 테스트 중 어느 것이라도 통과하면 일반적으로 배포된 것으로 간주되었습니다. 차량과 약물 치료 그룹(그림 3)의 비교는 짝이 없는 두 꼬리 학생의 t-test에 의해 수행되었다. 통계적 유의성은 P ≤ 0.05에 확립되었다.
그림 1: 성공적인 꼬리 정맥 주입의 생체 발광 확인.
(A) 루시파라래거 태그MDA-MB-231 세포의 꼬리 정맥 주입 후 1시간 후 마우스에서 대표적인 생체 발광 신호. (B) 루시파라래거 태그MDA-MB-231 세포의 꼬리 정맥 주입 후 24일(A)과 동일한 마우스 세트에서 대표적인 생체 발광 신호. [(A)와 (B) 사이의 스케일 막대의 변화에 유의하십시오. (C) MDA-MB-231 꼬리 정맥 주입 마우스에서 시간이 지남에 따라 광자 수의 정량화. 오류 막대는 평균 ± SEM. (n = 8 마우스) (D) 대표적인 비종양 베어링 폐 조직 (오른쪽) 및 MDA-MB-231 매크로 메타아제폐폐시의 폐(왼쪽)를 나타낸다. 스케일 바 = 50mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: Visiopharm 소프트웨어를 사용하여 조직 세분화.
(A) 사용자 정의 소프트웨어 알고리즘을 사용하여 분할되지 않은 세그먼트 및 분할 조직 마크 업의 대표 스닙. (B) 소프트웨어를 사용하여 세분화된 모든 조직 범주에 대한 범례입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: H&E 염색 조직의 대표적인 전이성 폐 종양 부담 분석.
(A) MDA-MB-231 세포의 꼬리 정맥 주입 에 이어 미주입 마우스 및 대조군(DMSO) 및 약물 처리 마우스로부터 폐 조직의 대표적인 H&E 염색. 대표적인 종양 전이는 화살로 표시됩니다. 스케일 바 = 4배율용 500 μm, 10배 배율의 경우 200 μm. (B) 대조군 및 약물 치료 마우스의 퍼센트 순 폐 전이 영역의 그래프. 오류 막대는 학생의 t-test에 의해 ± sD.(*) P = 0.022를 의미하는 것을 나타냅니다. (C) 전이성 폐 종양 부담 해석을 요약한 표(n = 9 DMSO; n = 9 약물 치료). 데이터의 정상적인 분포를 확인한 후 테이블의 모든 P 값은 페어링되지 않은 두 꼬리 학생의 t-test로 결정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 매개 변수 | 묘사 | |
| 총 조직 영역(μm2) | 모든 종양 전이, 정상적인 폐 및 적혈구 부위를 포함하는 사각형 미크론의 면적. | |
| 전이 카운트 | 폐 조직 내의 전이의 총 수. | |
| 전이 영역 비율(μm2) | 총 전이 영역은 그물 조직 영역 x 100으로 나눈다. | |
| 총 조직 + 공백 영역(μm2) | 모든 조직과 공백을 포함하는 사각형 미크론의 면적. | |
| 순 조직 영역(μm2) | 공백과 적혈구가없는 사각형 미크론 (mets 및 정상 폐)의 조직 영역. | |
| 총 전이 지역(μm2) | 결정 숲 알고리티임에 의해 분할된 사각형 미크론의 총 전이 영역. | |
| 평균 전이 지역(μm2) | 각 이미지 내의 전이의 제곱미크론의 평균 (평균) 영역. | |
| 중간 전이 지역 (μm2) | 사각형 미크론의 중앙전이 영역. 동일한 수의 전이가 이 값보다 낮으며 동일한 수의 전이가 중앙값보다 큽습니다. | |
표 1: 소프트웨어로 측정된 매개 변수입니다. 사용자 지정 알고리즘을 사용하여 계산되는 각 측정에 대한 설명과 함께 매개 변수 목록입니다.
| 슬라이드 | 전이 카운트 | 전이 영역 비율(μm2) | 총 조직 + 공백 영역(μm2) | 총 공백(μm2) | 순 조직 영역(μm2) | 총 전이 지역(μm2) | 적혈구 면적(μm2) | 평균 전이 지역 (μm2) | 중간 전이 지역 (μm2) |
| 171 폐 슬라이드 1 | 435 | 8.90 | 185698000 | 83201800 | 92031400 | 8189250 | 10464800 | 18825.86 | 14748.73 |
| 171 폐 슬라이드 2 | 323 | 8.37 | 185698000 | 83201800 | 92054740 | 7708990 | 10441460 | 23866.84 | 14748.73 |
| 172 폐 슬라이드 1 | 151 | 2.73 | 181546000 | 89509904 | 81571296 | 2225220 | 10464800 | 14736.56 | 12486.37 |
| 172 폐 슬라이드 2 | 142 | 2.60 | 170708000 | 81735504 | 80558196 | 2093040 | 8414300 | 14739.72 | 12119.62 |
| 173 폐 슬라이드 1 | 634 | 11.60 | 234104992 | 102153000 | 115606692 | 13406800 | 16345300 | 21146.37 | 15472.22 |
| 173 폐 슬라이드 2 | 667 | 12.70 | 223180992 | 86778600 | 122374592 | 15542700 | 14027800 | 23302.40 | 16531.00 |
| 174 폐 슬라이드 1 | 40 | 0.55 | 192452992 | 80340896 | 87591096 | 485121 | 24521000 | 12128.03 | 10484.05 |
| 174 폐 슬라이드 2 | 34 | 0.51 | 183918000 | 71287904 | 91242796 | 464830 | 21387300 | 13671.47 | 11181.81 |
| 175 폐 슬라이드 1 | 780 | 23.93 | 179544992 | 44799200 | 126995782 | 30388600 | 7750010 | 38959.74 | 19307.76 |
| 175 폐 슬라이드 2 | 1001 | 12.58 | 169191536 | 43425608 | 120610754 | 15169100 | 5155174 | 15153.95 | 19703.08 |
| 188 폐 슬라이드 1 | 569 | 13.20 | 162290000 | 54210000 | 98486310 | 12997300 | 9593690 | 22842.36 | 14463.91 |
| 188 폐 슬라이드 2 | 271 | 5.15 | 157146000 | 54250800 | 91996500 | 4738100 | 10898700 | 17483.76 | 12657.83 |
| 189 폐 슬라이드 1 | 74 | 1.70 | 185292992 | 95700800 | 77779392 | 1318820 | 11812800 | 17821.89 | 14551.08 |
| 189 폐 슬라이드 2 | 74 | 1.76 | 182272992 | 95700800 | 74759392 | 1318820 | 11812800 | 17821.89 | 14551.08 |
| 816 폐 슬라이드 1 | 246 | 5.65 | 185876000 | 87568896 | 81916204 | 4631050 | 16390900 | 18825.41 | 14371.99 |
| 816 폐 슬라이드 2 | 565 | 6.05 | 183220000 | 76954304 | 90305396 | 5462670 | 15960300 | 9668.44 | 14244.82 |
| 876 폐 슬라이드 1 | 468 | 10.36 | 208308000 | 99300096 | 100947064 | 10454500 | 8060840 | 22338.68 | 16011.37 |
| 876 폐 슬라이드 2 | 528 | 11.74 | 199750896 | 81642568 | 110450391 | 12963400 | 7657937 | 24551.89 | 16699.13 |
| 877 폐 슬라이드 1 | 732 | 17.98 | 219340992 | 99918600 | 107869992 | 19397100 | 11552400 | 26498.77 | 18137.52 |
| 877 폐 슬라이드 2 | 605 | 14.64 | 207925504 | 88539712 | 108168329 | 15839700 | 11217463 | 26181.32 | 18014.64 |
| 878 폐 슬라이드 1 | 377 | 10.05 | 178534000 | 85610896 | 81931104 | 8232340 | 10992000 | 21836.45 | 16671.03 |
| 878 폐 슬라이드 2 | 376 | 9.88 | 170544000 | 75337904 | 86108406 | 8511710 | 9097690 | 22637.53 | 16754.38 |
| 879 폐 슬라이드 1 | 205 | 5.22 | 167556000 | 89999000 | 68123630 | 3553860 | 9433370 | 17335.90 | 13845.69 |
| 879 폐 슬라이드 2 | 213 | 4.64 | 167931008 | 80789400 | 78489588 | 3638720 | 8652020 | 17083.19 | 14058.12 |
| 881 폐 슬라이드 1 | 1122 | 38.81 | 218880000 | 79713504 | 130893816 | 50802300 | 8272680 | 45278.34 | 22044.99 |
| 881 폐 슬라이드 2 | 628 | 21.67 | 184200992 | 74502600 | 99122692 | 21475200 | 10575700 | 34196.18 | 19857.40 |
| 882 폐 슬라이드 1 | 678 | 24.05 | 194476992 | 83941904 | 98484788 | 23684500 | 12050300 | 34932.89 | 20748.06 |
| 882 폐 슬라이드 2 | 645 | 21.93 | 185537040 | 75790040 | 101412430 | 22241700 | 8334570 | 34483.26 | 20325.11 |
| 883 폐 슬라이드 1 | 429 | 10.79 | 179400992 | 84955696 | 84699866 | 9138800 | 9745430 | 21302.56 | 15080.23 |
| 883 폐 슬라이드 2 | 342 | 85.30 | 175220992 | 76210896 | 90472386 | 77170200 | 8537710 | 225643.86 | 17078.26 |
| 884 폐 슬라이드 1 | 359 | 6.42 | 206751008 | 87752600 | 103825008 | 6669710 | 15173400 | 18578.58 | 14333.41 |
| 884 폐 슬라이드 2 | 480 | 9.12 | 200990000 | 77052496 | 111060804 | 10125700 | 12876700 | 21095.21 | 15679.88 |
| 885 폐 슬라이드 1 | 332 | 7.79 | 191398000 | 92896304 | 84752596 | 6605490 | 13749100 | 19896.05 | 14500.11 |
| 885 폐 슬라이드 2 | 537 | 81.02 | 187475008 | 85938000 | 89378408 | 72411104 | 12158600 | 134843.77 | 15360.29 |
| 886 폐 슬라이드 1 | 305 | 7.93 | 158435008 | 80433296 | 76541662 | 6068720 | 1460050 | 19897.44 | 14500.11 |
| 886 폐 슬라이드 2 | 898 | 8.84 | 155460000 | 70808600 | 83457470 | 7380490 | 1193930 | 8218.81 | 14744.92 |
표 2: 대표 결과 표입니다. MDA-MB-231 세포로 주입된 마우스 꼬리 정맥의 코호트로부터 알고리즘의 각 매개변수에 대한 결과 표.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
연구원이 전이를 위한 실험 모형으로 종양 세포의 정맥 주사를 계속 사용함에 따라, 결과전이성 종양 부담을 분석하는 표준 사례는 부족합니다. 경우에 따라 특정 세포주를 조작하거나 화학 화합물을 사용하는 경우 전이성 종양 부담의 현저한 차이를 거시적으로 관찰할 수 있다. 그러나, 다른 경우에, 전이성 파종 및 성장에 있는 미묘한 다름은 철저한 병리학 적인 분석 없이 간과되거나 잘못 해석될 수 있습니다. 이 연구는 전이성 폐 종양 부담 분석의 포괄적인 방법을 포함하 여 이전에 발표 된 꼬리 정맥 주입 프로토콜을 진행합니다. 중요한 것은, 이러한 디지털 병리학 분석 방법은 자발적전이뿐만 아니라 다른 실험전이 모델(즉, 심내 외성 등) 및 환자 유래 제노이식(PDX) 모델뿐만 아니라 자발적인 전이성 주입에 따른 폐 전이성 종양 부담의 정량화에도 적용될 수 있다. 수의병리학자에 의한 디지털 이미징 및 소프트웨어 알고리즘 개발의 사용은 전이성 폐 종양 부담을 분석하기 위해 이 접근법의 재현성, 정확성 및 철저함을 보장합니다25.
세포주, 세포 농도 및 이전에 발표된 연구 또는 신중한 실험 최적화를 기반으로 한 종점의 사려 깊은 결정은 절대적으로 필요합니다. 전이성 파종 및 식민지화가 다양한 면역 세포 집단과의 상호 작용에 크게 의존한다는 점을 감안할 때, 면역 능력이 있는 마우스의 사용은 항상 가능하지는 않지만 이상적입니다. 같은 이유로, 주요 면역 세포 구성 요소가 부족한 자성병 또는 NSG 마우스를 사용하여 실험전이 연구의 해석을 주의해서 취해야 합니다. 이 연구에서 사용되는 MVT1 세포를 포함한 여러 마우스 유방 종양 세포주가 있는데, 이는 FVB/N 마우스 균주22,28,29에서 유래되었다. 다른 합성 모델도 존재합니다. 세포 농도에 관해서는, 많은 수의 세포의 주입이 크게 가속화되고 전이성 폐 종양 부담을 향상시킬 수 있습니다. 그러나 폐가 압도되면 개별 전이성 포시와 색전증을 구별하기가 어려울 수 있습니다. 또한, 꼬리 정맥 주입 절차는 안전 하 게 및/또는 정기적으로 주사를 수행 하기 전에 충분 한 연습 및 훈련 필요. 많은 기관이 기술 교육을 제공하고 연습 목적을 위해 마우스를 제공 할 수 있습니다. 바늘과 부드러운 주입의 적절 한 배치 성공을 표시 한다; 그러나, 훈련/연습 목적을 위해, 에반스 블루 염료는 성공적인 주입을 결정하는 데 사용할 수 있습니다 (1% 멸균 PBS). 마우스의 사지는 주입 직후 파란색으로 변하지만 동물은 나중에 안락사해야합니다.
또한 이미지 분석 소프트웨어에 의한 슬라이드 스캐닝 및 분석을 손상시킬 수 있는 슬라이드 아티팩트를 제어하고 방지하는 표준 부검 및 조직 샘플링 기술의 중요성은 충분히 강조될 수 없습니다. 부검 시 폐의 인플레이션은 조직의 무결성을 유지하는 중요한 단계이며 후속 H&E 염색뿐만 아니라 최종 분석을 향상시킵니다. 해상도 및 재현성을 일관성있게 하기 위해 스터디 세트의 모든 슬라이드를 동일한 대상으로 스캔하는 것이 좋습니다. 이 연구에서는, 모든 슬라이드는 분석된 필드에 적용될 때 알고리즘 설정의 정확성과 종양 전이의 적절한 식별을 보장하기 위해 40x에서 스캔되었습니다. 각 슬라이드에 대해 동일한 폐 엽을 일관되게 스캔하고 각 마우스에 대해 분석했습니다. 또한 병리학자가 적용 된 알고리즘의 정확성을 위해 조직 마크업을 검토하고 연구의 모든 슬라이드에 동일한 알고리즘이 적용되는 것이 좋습니다.
제시된 프로토콜은 실험 설계, 사용자 기본 설정 및 원하는 결과 측정에 따라 수정할 수 있습니다. 이러한 변형은 의식적인 동물을 위한 종래의 제지 장치보다는 마취 유도 챔버의 사용을 포함한다. 동물의 건강과 웰빙측면에서, 어느 쪽도 접근 방식이 서로 우수하지 않으며 각각은 장점과 한계30을 가지고 있습니다. 또한, 검은 색 또는 갈색 마우스의 경우, 꼬리 정맥을 시각화하기 위해 광원 또는 가열 장치가 필요할 수 있습니다. 적외선 램프 또는 따뜻한 수조는 정맥을 팽창시키는 데 사용할 수 있습니다. 그러나 온도를 주의 깊게 모니터링해야 합니다. 또한, 설치류 구속 장치의 다른 상용 버전뿐만 아니라 사용할 수있는 조명 구속 장치가 있습니다. 일부 조사관은 주사를 위해 Luer-Lok 주사기를 선호합니다. 루어록 주사기로 기포를 제거하는 것이 더 어렵지만, 선호도가 높습니다. 세포의 생존능력은 꼬리 정맥 주입 절차에 대한 중요한 고려 사항이므로 정확한 세포 수는 주입 전에 얼음에 세포를 유지하는 데 필요한 단계입니다. 폐 파종 및 조작 된 세포주의 식민지화를 비교하는 경우, 이러한 결과의 해석을 복잡하게 할 수 있으므로 주사 전에 세포 크기와 생존력의 차이를 결정하는 것이 중요합니다. 세포 사멸 및/또는 손상은 좁은 게이지 바늘을 사용할 때 발생할 수 있습니다; 그러나, 25 G보다 큰 바늘은 동물에게 통증과 불편함을 유발할 수 있으므로 사용하지 않는 것이 좋습니다.
폐 병변이 주입된 종양 세포에 의해 형성된다는 것을 확인하는 방법으로, 면역 염색은 조직 단면도에서 행해질 수 있습니다. 인간 세포주를 사용하는 경우 인간 특정 항체를 사용하여 전이성 병변을 분별하는 데 사용할 수 있습니다. 대안적으로, 태그가 지정된 세포주(예를 들어, GFP)를 사용하는 경우, 해당 항체를 사용할 수 있다. 또한, 많은 유방암 세포주는 상피 마커(즉, 사이토케라틴, E-cadherin 및 EpCAM)에 대해 긍정적이지만 발현에 대한 사전 지식이 필수적입니다. 그러나, 기도를 안감하는 폐 상피는 또한 이 마커를 위해 양성일 것이고, 따라서, 구조는 또한 고려되어야 합니다. 1 차적인 폐 종양 발달이 배제되어야 하는 케이스가 있을지도 모릅니다. 이를 위해 갑상선 전사 인자-1(TTF1)을 위한 면역히스토케토케닌은 1차 폐 아데노암종의 마커로 사용될 수 있다. TTF1 염색은 공인 병리학자에 의해 평가되어야 합니다.
본 명세서에서, 확립된 폐 전이 알고리즘이 크기가 다양한 전이의 정확한 검출을 위해 미세 조정할 수 없기 때문에 결정산림 분류 알고리즘을 사용하여 사용자 지정 알고리즘을 작성하였다. 이 사용자 지정 알고리즘은 복잡한 측정을 가능하게 하고, 크기별로 전이의 정확한 세분화를 허용하며, 작은 모양의 영역과 일반 구조가 잘못 해석되지 않도록 크기 차단을 지원하므로 최종 데이터 집합에 포함될 수 있습니다. 우리는이 알고리즘이 대부분의 생체 폐 전이 연구에 적용 될 것으로 예상하지만, 사용자는 개별 연구 요구에 맞게 소프트웨어 내에서 설정을 조정해야 할 수 있습니다. 그러나, 이 알고리즘은 유사한 방식으로 폐 전이성 부담을 분석하고자하는 조사자들을위한 플랫폼 역할을한다. 이미지 분석 플랫폼에대한 다양한 옵션이 있어 액세스 또는 가용성, 비용 및 교육뿐만 아니라 경험 수준이 36을 활용하는 가장 적합한 플랫폼을 결정할 수 있습니다. 옵션의 범위는 QuPath와 같은 무료 플랫폼과 더 비싸지 만 Visiopharm과 같은 정교한 플랫폼을 포함합니다. 특정 연구 프로젝트에 사용할 수 있는 플랫폼을 결정할 때 이미지 분석 병리학 핵심 및 병리학자와 상의하는 것이 좋습니다.
자발적인 마우스 유방 종양 모델 (예를 들어, MMTV-PyMT) 또는 직교 유방 지방 패드 주입 방법은 폐 전이를 연구하기위한 가장 생리적으로 관련된 모델을 나타냅니다. 꼬리 정맥 주입 모델에 심각한 단점은 전체 전이성 캐스케이드를 회수하지 않고 따라서 종양 세포 사치 및 이차 기관 식민지의 연구에 국한된다는 것입니다. 그러나, 이러한 실험전형 모델은 테일-정맥 주사 에 따라 형성된 폐암 전이가 동일한 세포의 정립 이식 후 발생하는 전이성 병변과 유사한 게놈 프로파일을 가지고 있기 때문에 유방암 연구에 유의하다31. 폐 전이 모델을 확립하기 위해 많은 수의 세포가 종종 정맥 주사를 맞아 파종, 면역 반응 및 휴면과 관련된 전이 과정을 정확하게 나타내지 못할 수 있습니다. 또한 순환 경로에 따라 폐 전이가 꼬리 정맥 주사32에서 가장 일반적입니다. 대부분의 유방암 세포주로, 간행된 보고는 꼬리 정맥 주입다음 뼈, 간, 또는 두뇌 전이의 상대적으로 낮은 부각을 나타냅니다7. 심내, 내막, 포털 정맥 및 자궁 내 주사와 같은 대체 실험 전이 방법은 다른 부위에 전이를 검사하는 데 더 적합하다333,34,35,36,37. 다시, 즉흥적인 유방 종양 모델 또는 전이성 캐스케이드의 모든 단계를 재구성하는 직교 지방 패드 주입 방법이 바람직하다. 일관된 전이성 종양 부담, 연구 기간 및 그러한 연구에 필요한 동물의 수가 있는 문제는 단점입니다. 그러나, 여기에 제시된 디지털 병리학 분석 방법은 자발적 또는 실험전이 모델을 통해 형성된 폐 전이에 적용될 수 있다.
분석 방법은 또한 알고리즘 생성의 주관성과 같은 특정 한계를 산출합니다. 전체 슬라이드 이미징은 전체 조직 섹션과 단일 마우스의 모든 폐 엽에 대한 디지털 분석을 허용하지만 3D 조직의 2 차원 분석으로 제한됩니다. 입체학은 이미지 분석을 위한 3D 정보를 얻고 조직 처리 도중 생기는 조직 수축과 같은 요인을 설명할 수 있는 일반적인 사례가 되고 있습니다38. 그러나 입체학에는 조직, 자원 및 시간 제약과 같은 자체 제한이 있습니다.
전이성 전이성 확산에 의해 영향을 받는 암 환자의 수를 감안할 때, 전이를 연구하는 꼬리 정맥 주입 방법은 전이성 확산의 복잡한 생물학을 이해하고 새로운 치료법의 전임상 효능을 결정하는 측면에서 유용한 도구가 될 것입니다. 전이의 생체 내 마우스 모델, 특히 면역 능력이 있는 동물을 사용하는 사람들은 면역 요법29에 대한 광범위한 관심을 감안할 때 암 연구에 더욱 중요해지고 있습니다. 또한, 실험전이 모델은 전이 억제유전자(즉, 1차 종양 성장에 영향을 미치지 않으면서 암세포의 전이성 전이를 억제하는 유전자)를 조사하는 측면에서 매우 중요하며, 따라서 귀중한 연구 도구가 되고 있다.
디지털 이미징 및 슬라이드 분석은 진단 및 실험 마우스 모델링39의 주류가 되었습니다. 본 원에 기재된 접근법의 유형을 사용하여 폐 전이성 종양 부담을 분석하면 보다 포괄적이고 정확한 방식으로 높은 처리량 분석을 허용할 것이다. 또한, 디지털 이미징 병리학은 유방암 전이의 마우스 모형과 같은 분야를 전문화하는 병리학자를 관련시키는 더 협력적인 연구 프로젝트를 위한 도로를 제공합니다. 멀티플렉스 조직 이미징 방법 및 3D 이미징 기술(위에서 언급한 대로)이 계속 개발됨에 따라 디지털 이미징 병리학, 이미지 분석을 위한 정교한 소프트웨어 프로그램 및 병리학자의 전문 지식은 전이 연구를 진전시키기 위해 확실히 필요합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
대표적인 데이터는 국립암연구소(K22CA218549~S.T.S.S)를 통해 지원되었다. 본 원에 보고된 포괄적인 분석 방법 개발에 도움을 주는 것 외에도, 오하이오 주립대학 종합암 센터 비교 병리학 및 마우스 Phenotyping 공유 리소스(디렉터 – 크리스타 라 펄, DVM, 박사)에게 조직학 및 면역 조직화학 서비스 및 알고리즘 개발 및 분석을 위한 병리학 이미징 코어에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| alcohol prep pads | Fisher Scientific | 22-363-750 | for cleaning tail prior to injection |
| dissection scissors | Fisher Scientific | 08-951-5 | for mouse dissection and lung tissue inflation |
| DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | MT10013CV | cell culture media base for MDA-MB-231 and MVT1 cell lines |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x | Fisher Scientific | MT21030CV | used for resuspending tumor cells for injection |
| ethanol (70 % solution) | OSU | used to minimize mouse's fur during dissection; use caution - flammable | |
| Evan's blue dye | Millipore Sigma | E2129 | used at 1 % in sterile PBS for practice with tail-vein injection method; use caution - dangerous reagent |
| Fetal Bovine Serum | Millipore Sigma | F4135 | cell culture media additive; used at 10% in DMEM |
| forceps | Fisher Scientific | 10-270 | for dissection and lung tissue inflation |
| FVB/NJ mice | The Jackson Laboratory | 001800 | syngeneic mouse strain for MVT1 cells |
| hemacytometer (Bright-Line) | Millipore Sigma | Z359629 | for use in cell culture to obtain cell counts |
| insulin syringe (28 G) | Fisher Scientific | 14-829-1B | for tail-vein injections (BD 329424) |
| MDA-MB-231 cells | ATCC | human breast cancer cell line | |
| MVT1 cells | mouse mammary tumor cells | ||
| needles (26 G) | Fisher Scientific | 14-826-15 | used to inflate the mouse's lungs |
| neutral buffered formalin (10%) | Fisher Scientific | 245685 | used as a tissue fixative and to inflate lung tissue; use caution - dangerous reagent |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice | The Jackson Laboratory | 005557 | maintained by OSUCCC Target Validation Shared Resource |
| Penicillin Streptomycin 100x | ThermoFisher | 15140163 | cell culture media additive |
| sterile gauze | Fisher Scientific | NC9379092 | for applying pressue to mouse's tail if bleeding occurs |
| syringe (5 mL) | Fisher Scientific | 14-955-458 | used to inflate mouse lung tissue |
| tail-vein restrainer | Braintree Scientific, Inc. | TV-150 STD | used to restrain mouse for tail-vein injections |
| Trypan blue (0.4 %) | ThermoFisher | 15250061 | used in cell culture to assess viability |
| Trypsin-EDTA 0.25 % | ThermoFisher | 25200-114 | used in cell culture to detach tumor cells from plate |
References
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nature Reviews: Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).
- Steeg, P. S.
- Gupta, G. P., Massague, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127 (4), 679-695 (2006).
- Steeg, P. S. Tumor metastasis: mechanistic insights and clinical challenges. Nature Medicine. 12 (8), 895-904 (2006).
- Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331 (6024), 1559-1564 (2011).
- Eckhardt, B. L., Francis, P. A., Parker, B. S., Anderson, R. L. Strategies for the discovery and development of therapies for metastatic breast cancer. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (6), 479-497 (2012).
- Gomez-Cuadrado, L., Tracey, N., Ma, R., Qian, B., Brunton, V. G. Mouse models of metastasis: progress and prospects. Disease Models & Mechanisms. 10 (9), 1061-1074 (2017).
- Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Research. 8 (4), 212 (2006).
- Schoenenberger, C. A., et al. Targeted c-myc gene expression in mammary glands of transgenic mice induces mammary tumours with constitutive milk protein gene transcription. EMBO Journal. 7 (1), 169-175 (1988).
- Nusse, R., Varmus, H. E. Many tumors induced by the mouse mammary tumor virus contain a provirus integrated in the same region of the host genome. Cell. 31 (1), 99-109 (1982).
- Muller, W. J., Sinn, E., Pattengale, P. K., Wallace, R., Leder, P. Single-step induction of mammary adenocarcinoma in transgenic mice bearing the activated c-neu oncogene. Cell. 54 (1), 105-115 (1988).
- Lin, E. Y., et al. Progression to malignancy in the polyoma middle T oncoprotein mouse breast cancer model provides a reliable model for human diseases. American Journal of Pathology. 163 (5), 2113-2126 (2003).
- Green, J. E., et al. The C3(1)/SV40 T-antigen transgenic mouse model of mammary cancer: ductal epithelial cell targeting with multistage progression to carcinoma. Oncogene. 19 (1), 1020-1027 (2000).
- Iorns, E., et al. A new mouse model for the study of human breast cancer metastasis. PloS One. 7 (10), 47995 (2012).
- Kim, I. S., Baek, S. H. Mouse models for breast cancer metastasis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 394 (3), 443-447 (2010).
- Mariotto, A. B., Etzioni, R., Hurlbert, M., Penberthy, L., Mayer, M. Estimation of the Number of Women Living with Metastatic Breast Cancer in the United States. Cancer Epidemiology, Biomarkers and Prevention. 26 (6), 809-815 (2017).
- Xiao, W., et al. Risk factors and survival outcomes in patients with breast cancer and lung metastasis: a population-based study. Cancer Medicine. 7 (3), 922-930 (2018).
- Smid, M., et al. Subtypes of breast cancer show preferential site of relapse. Cancer Research. 68 (9), 3108-3114 (2008).
- Kennecke, H., et al. Metastatic behavior of breast cancer subtypes. Journal of Clinical Oncology. 28 (20), 3271-3277 (2010).
- Soni, A., et al. Breast cancer subtypes predispose the site of distant metastases. American Journal of Clinical Pathology. 143 (4), 471-478 (2015).
- Leone, B. A., et al. Prognostic impact of metastatic pattern in stage IV breast cancer at initial diagnosis. Breast Cancer Research and Treatment. 161 (3), 537-548 (2017).
- Pei, X. F., et al. Explant-cell culture of primary mammary tumors from MMTV-c-Myc transgenic mice. In Vitro Cellular and Developmental Biology: Animal. 40 (1-2), 14-21 (2004).
- Mathsyaraja, H., et al. CSF1-ETS2-induced microRNA in myeloid cells promote metastatic tumor growth. Oncogene. 34 (28), 3651-3661 (2015).
- Yang, S., Zhang, J. J., Huang, X. Y. Mouse models for tumor metastasis. Methods in Molecular Biology. 928, 221-228 (2012).
- La Perle, K. M. D. Comparative Pathologists: Ultimate Control Freaks Seeking Validation. Veterinary Pathology. 56 (1), 19-23 (2019).
- Blomberg, O. S., Spagnuolo, L., de Visser, K. E. Immune regulation of metastasis: mechanistic insights and therapeutic opportunities. Disease Models & Mechanisms. 11 (10), (2018).
- Gonzalez, H., Hagerling, C., Werb, Z. Roles of the immune system in cancer: from tumor initiation to metastatic progression. Genes and Development. 32 (19-20), 1267-1284 (2018).
- Borowsky, A. D., et al. Syngeneic mouse mammary carcinoma cell lines: two closely related cell lines with divergent metastatic behavior. Clinical and Experimental Metastasis. 22 (1), 47-59 (2005).
- Yang, Y., et al. Immunocompetent mouse allograft models for development of therapies to target breast cancer metastasis. Oncotarget. 8 (19), 30621-30643 (2017).
- Resch, M., Neels, T., Tichy, A., Palme, R., Rulicke, T. Impact assessment of tail-vein injection in mice using a modified anaesthesia induction chamber versus a common restrainer without anaesthesia. Laboratory Animals. 53 (2), 190-201 (2019).
- Rashid, O. M., et al. Is tail vein injection a relevant breast cancer lung metastasis model. Journal of Thoracic Disease. 5 (4), 385-392 (2013).
- Goodale, D., Phay, C., Postenka, C. O., Keeney, M., Allan, A. L. Characterization of tumor cell dissemination patterns in preclinical models of cancer metastasis using flow cytometry and laser scanning cytometry. Cytometry Part A. 75 (4), 344-355 (2009).
- Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
- Wright, L. E., et al. Murine models of breast cancer bone metastasis. BoneKEy Reports. 5, 804 (2016).
- Simmons, J. K., et al.
- Liu, Z., et al. Improving orthotopic mouse models of patient-derived breast cancer brain metastases by a modified intracarotid injection method. Scientific Reports. 9 (1), 622 (2019).
- Kodack, D. P., Askoxylakis, V., Ferraro, G. B., Fukumura, D., Jain, R. K. Emerging strategies for treating brain metastases from breast cancer. Cancer Cell. 27 (2), 163-175 (2015).
- Brown, D. L. Practical Stereology Applications for the Pathologist. Veterinary Pathology. 54 (3), 358-368 (2017).
- Aeffner, F., et al. Digital Microscopy, Image Analysis, and Virtual Slide Repository. Institute for Laboratory Animal Research Journal. 59 (1), 66-79 (2018).
Tags
암 연구 문제 159 꼬리 정맥 주입 유방암 폐암 전이 H&E 염색 섹션 정량적 디지털 병리학 이미지 분석Erratum
Formal Correction: Erratum: Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells
Posted by JoVE Editors on 12/02/2020.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells. The author list was updated.
The author list was updated from:
Katie A. Thies1, Sue E. Knoblaugh2, and Steven T. Sizemore1
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center
2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University
to:
Katie A. Thies1, Sarah Steck1, Sue E. Knoblaugh2, and Steven T. Sizemore1
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center
2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University
