Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Patologisk analyse av lungemetastase etter lateral hale-vene injeksjon av tumorceller

Published: May 20, 2020 doi: 10.3791/61270
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center, 2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University

ERRATUM NOTICE

Summary

Intravenøs injeksjon av kreftceller brukes ofte i metastaseforskning, men den metastatiske tumorbyrden kan være vanskelig å analysere. Heri demonstrerer vi en hale-vene injeksjonsmodell av metastase og inkluderer en ny tilnærming for å analysere den resulterende metastatiske lungesvulstbyrden.

Abstract

Metastase, hovedårsaken til sykelighet og dødelighet for de fleste kreftpasienter, kan være utfordrende å modellere preklinisk hos mus. Få spontane metastaseringsmodeller er tilgjengelige. Dermed er den eksperimentelle metastasemodellen som involverer hale-vene injeksjon av egnede cellelinjer en bærebjelke i metastaseforskning. Når kreftceller injiseres i lateral hale-venen, er lungen deres foretrukne koloniseringssted. En potensiell begrensning av denne teknikken er nøyaktig kvantifisering av den metastatiske lungesvulstbyrden. Mens noen etterforskere teller makrometastaser av forhåndsdefinerte størrelser og/eller inkluderer mikrometastaser etter seksjonering av vev, bestemmer andre området metastatiske lesjoner i forhold til normalt vevsområde. Begge disse kvantifiseringsmetodene kan være svært vanskelige når den metastatiske byrden er høy. Heri demonstrerer vi en intravenøs injeksjonsmodell av lungemetastase etterfulgt av en avansert metode for kvantifisering av metastatisk tumorbyrde ved hjelp av bildeanalyseprogramvare. Denne prosessen gjør det mulig å undersøke flere sluttpunktparametere, inkludert gjennomsnittlig metastaseringsstørrelse, totalt antall metastaser og totalt metastaseområde, for å gi en omfattende analyse. Videre har denne metoden blitt gjennomgått av en veterinærpatolog som er sertifisert av American College of Veterinary Pathologists (SEK) for å sikre nøyaktighet.

Introduction

Til tross for å være en svært kompleks og ineffektiv prosess1, er metastase en betydelig bidragsyter til sykelighet og dødelighet av kreftpasienter2. Faktisk tilskrives de fleste kreftrelaterte dødsfall metastatisk spredning av sykdom3,4. For at tumorceller skal kunne metastasere, må de løsne fra det primære stedet, invadere gjennom tilstøtende stroma, intravasere i blodsirkulasjon eller lymfatikk, reise til kapillærsengen på et sekundært sted, ekstravasere inn i sekundærvevet og spre seg eller vokse for å danne metastatiske lesjoner5. Bruken av musemodeller har vært avgjørende for å fremme forståelsen av de molekylære mekanismene som er ansvarlige for metastatisk såing og vekst6,7. Her fokuserer vi på brystkreftmetastase, som både genetisk modifiserte musemodeller samt transplantasjonsmetoder ofte brukes til - hver med sitt eget sett med fordeler og begrensninger.

Genetisk konstruerte brystsvulstmodeller benytter seg av brystkjertelspesifikke promotorer, inkludert MMTV-LTR (musepattedyr tumorvirus lang terminal repetisjon) og WAP (Whey Acidic Protein), for å drive uttrykk for transgenes i pattedyrepitelet8. Oncogenes inkludert polyoma middle T antigen (PyMT), ErbB2/Neu, c-Myc, Wnt-1 og simian virus 40 (SV40) har blitt uttrykt på denne måten9,10,11,12,13, og mens disse genetiske modellene er nyttige for å studere primær tumor initiering og progresjon, få lett metastasere til fjerne organer. Videre er disse genetiske musemodellene ofte mer tids- og kostnadsoverkommelige enn spontane eller eksperimentelle metastasemodeller. Gitt begrensningen av de fleste genetisk konstruerte mammary tumor modeller for å studere metastase, har transplantasjonsteknikker blitt attraktive metoder for å studere denne komplekse prosessen. Dette inkluderer ortotopisk, hale-vene, intrakariac og intrakraniell injeksjon av egnede cellelinjer.

Selv om flere brystkreftcellelinjer lett metastaser etter ortotopisk injeksjon i brystfettputen14,15, kan konsistensen og reproduserbarheten av metastatisk tumorbyrde være en utfordring, og varigheten av slike studier kan være i rekkefølge på flere måneder. For evaluering av lungemetastase er spesielt intravenøs injeksjon i hale-venen ofte en mer reproduserbar og tidseffektiv metode med metastatisk spredning som vanligvis forekommer i løpet av noen uker. Men siden den intravenøse injeksjonsmodellen omgår de første trinnene i den metastatiske kaskaden, må det tas hensyn til å tolke resultatene av disse studiene. I denne demonstrasjonen viser vi hale-vene injeksjon av mammary tumor celler sammen med en nøyaktig og omfattende analysemetode.

Selv om forskersamfunnet har gjort betydelige fremskritt i å forstå den komplekse prosessen med brystkreftmetastase, anslås det at over 150.000 kvinner for tiden har metastatisk brystkreft16. Av de med stadium IV brystkreft har >36% av pasientene lungemetastase17; Det stedsspesifikke mønsteret og forekomsten av metastaser kan imidlertid variere basert på molekylær undertype18,19,20,21. Pasienter med brystkreft-assosierte lungemetastaser har en median overlevelse på bare 21 måneder som fremhever behovet for å identifisere effektive behandlinger og nye biomarkører for denne sykdommen17. Bruken av eksperimentelle metastasemodeller, inkludert intravenøs injeksjon av tumorceller, vil fortsette å fremme vår kunnskap om denne viktige kliniske utfordringen. Kombinert med digital avbildningspatologi og metoden for metastatisk lungesvulstbyrdeanalyse beskrevet i denne protokollen, er hale-vene injeksjoner et verdifullt verktøy for brystkreftmetastaseforskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dyrebruk fulgte ULAR-regelverket (University Laboratory Animal Resources) i henhold til OSU Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC)–godkjent protokoll 2007A0120-R4 (PI: Dr. Gina Sizemore).

1. Hale-vene injeksjon av brystkreftceller

  1. Fremstilling av celler og sprøyte til injeksjon
    1. Plate et passende antall celler basert på antall mus og cellekonsentrasjon som skal brukes.
      MERK: Antall celler som injiseres og tid til utvikling av metastaser vil avhenge av cellelinjen som brukes og må optimaliseres. I denne demonstrasjonen injiseres 1 x 106 MDA-MB-231 celler intravenøst i NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mus, og makroskopiske lungeskader observeres senest 24 dager etter injeksjon. For MVT1 murine mammary tumor celle line17, injiseres 3 x 106 celler i immun-kompetente FVB / N mus med mange lungemetastaser observert med 14 dager22,23.
    2. Aspirer medier og skyll celleplater med 1x PBS. Prøv celler i minimalt volum, legg til riktig medievolum og tell celler ved hjelp av et hematocytometer eller en annen foretrukket metode. Trypan blå (0,4%) eller andre levende / døde cellefarger kan brukes til å bestemme levedyktige celletall.
    3. Pelletsceller ved å spinne på 180 x g i 5 min.
    4. Resuspend passende antall celler i steril 1x PBS slik at et volum på 100 μL injiseres per mus. Hold cellefjæring på is for å opprettholde levedyktigheten.
    5. Før injeksjon, grundig resuspend celler med en 200 μL eller 1 ml pipette for å unngå klumping. Lag 100 μL i en 28 G insulinsprøyte (se Materialtabell).
    6. Fjern eventuelle luftbobler ved å holde sprøyten vertikal, banke på sprøyten og sakte justere stempelet. Injeksjon av luftbobler i venen vil sannsynligvis forårsake en luft / gass embolisme som kan være dødelig.
  2. Lateral hale-vene injeksjon
    MERK: For eksperimentelle brystkreftmetastaseanalyser utføres injeksjoner på > 6 uker gamle kvinnelige mus.
    1. Håndter musen ved halen og skyv dyret inn i et rør med spor /sikkerhetsenhet av passende størrelse (se materialtabellen for fastholdelsesanordningen som brukes).
    2. Sett inn pluggdelen av festeenheten og plasser musen på siden slik at sidehalevenen er lett å se. Musen har en ventral arterie i tråd med kjønnsorganene, en dorsal vene og to laterale kaudale årer.
    3. Rengjør overflaten av musens hale med en aseptisk klut. Ta tak i halen mellom pekefingeren og tommelen med ikke-dominerende hånd og påfør liten spenning.
    4. Begynn ved den distale delen av halen, sett nålen parallelt med venen med skråkanten ende opp.
    5. Hvis det er tillatt, ta forsiktig inn nålen igjen og bøy den til en 20-30° vinkel. En enhånds tilnærming eller nåleoppnåingsanordning anbefales på det sterkeste.
      MERK: Det er ikke nødvendig å aspirere, da dette kan føre til at venen kollapser. Imidlertid kan et lite glimt av blod ses når det først plasseres. Nålen vil gå jevnt inn i venen med riktig plassering.
    6. Dispenser sakte hele volumet inn i venen. Det bør ikke være motstand når stempelet skyves.
    7. Hvis det merkes motstand, må du straks fjerne sprøytenålen. Om nødvendig, sett nålen (ideelt sett ikke mer enn 3 forsøk) på nytt mot den proksimale enden av halen eller motstående lateral vene.
    8. Et lite volum blod vil sannsynligvis bli forskjøvet etter injeksjon. Påfør forsiktig trykk med steril gasbind og tørk med aseptisk klut.
    9. Kast sprøyten straks i riktig beholder for skarpe gjenstander.
    10. Returner musen til et rent, ventilert bur og overvåk for tegn på nød.
    11. Overvåk mus 2-3x / ukentlig for tegn på metastasedannelse (arbeidspustende, hunched holdning, vekttap) og generell nød. Tiden for utvikling av metastase vil avhenge av cellelinje og musestamme.
    12. Hvis du bruker en in vivo levende dyreavbildningsenhet, er bildemus umiddelbart etter hale-vene injeksjon for å bekrefte vellykket injeksjon av celler og oppnå tid "null" data (spesifikke detaljer om in vivo bioluminescence avbildning er ikke inkludert heri, men er beskrevet av Yang et al.24).

2. Lungevevsfiksering og analyse av metastatisk lungesvulstbelastning

  1. Lungevevsinflasjon for å opprettholde lungenes strukturelle format for histopatologi
    1. Etter at godkjente eutanasiprosedyrer (f.eks. karbondioksid ved 30 - 70% forskyvning av kammervolumet / min) følges, sikre musekroppen til et dissekeringsbrett med pinner. Spray eller påfør 70% etanol for å holde musens pels ute av veien under disseksjon.
      MERK: Karbondioksidasfysasjon kan forårsake lungeblødning som en forventet bakgrunnslesjon, spesielt ved langsommere strømningshastigheter.
    2. Åpne thoraxen med et midtlinje snitt, utvid snittet kranialt / kaudalt gjennom bukhinnen, og kutt bort membranen ved å gripe xyphoid-prosessen.
    3. Bruk et eget sett med saks for ikke å sløve bladene, kutt ribbeina langs hver side av brystbenet og fjern forsiktig ribbeburet slik at lungene kan utvide seg.
    4. Isoler luftrøret ved å fjerne submandibulære spyttkjertler og infrahyoid muskulatur. Plassering av pinner på hver side av luftrøret kan forhindre uønsket bevegelse under innsetting av nålen.
    5. Fyll en 26 G sprøyte med 2-3 ml 10 % nøytralt bufret formalin og sett den inn i luftrøret.
    6. Injiser formalin sakte og se etter lungene å utvide (krever vanligvis ~ 1,5 ml formalin).
    7. Når formalin begynner å lekke ut av lungene (unngå over inflasjon), klem av luftrøret med et par tang, fjern sprøytenålen og løsne hele luftveiene. Plasser lunger, hjerte, etc. direkte inn i formalin som ytterligere trimning av vev kan gjøres etter fiksering.
    8. Fullstendig bearbeiding, innebygging, seksjonering av vev og hematoksylin og eosin (H&E) farging ved hjelp av standardmetoder.
  2. Analyse av metastatisk lungesvulstbelastning
    1. Skann H&E-fargede lungeseksjoner på en skyveskanner med høy oppløsning ved 40x forstørrelse (figur 3).
    2. Importer bilder til bildeanalyseprogramvare (f.eks. bildeanalyse i Visiopharm) for kvantifisering av lungemetastaser.
      MERK: Vi anbefaler at nye brukere enten får opplæring på stedet eller på nettet for å bruke bildeanalyseprogramvaren. Tallrike webinarer er også tilgjengelige via den kommersielle nettsiden.
    3. Velg Visiopharm 10118 H&E Lung Metastasis App fra programvarens appbibliotek.
      MERK: Formålet med denne appen er å merke og kvantifisere lungemetastase på H&E-fargede lysbilder. Som en del av H&E Lung Metastasis-appen i 10118 segmenterer det første bildebehandlingstrinnet lungevevet med Tissue Detection-appen. Det andre bildebehandlingstrinnet bruker Metastasis Detect App som identifiserer metastasene inne i lungevevet. Metastaser identifiseres via form sammen med regioner som enten er for feilformede, for røde eller for sparsommelige for å bli identifisert som metastaser.
    4. Juster parametrene som definerer form og sparsomhet for å passe best til representative bilder. Segmenterte områder av tumormetastaser og normalt lungevev kan vises ved hjelp av forskjellige fargeetiketter for hver vevstype.
      MERK: I tilfelle appen ikke kan skille metastaser nøyaktig fra normalt lungevev, kan det hende at en tilpasset app som bruker Visiopharm Decision Forest-programmet, må skrives slik det ble gjort for forsøkene (se figur 2 og figur 3). Detaljer for å skrive en tilpasset algoritme følger nedenfor. Ellers går du videre til trinn 2.2.9.
    5. Åpne Decision Forest-programmet, som fungerer ved å trene flere klasser [dvs . lungevev (ikke-neoplastisk), metastaser, røde blodlegemer, epitel og / eller mellomrom] på et ønsket bilde. I figur 2 er tumormetastaser blå, normalt vev er grønt og bronchiolar epitel er gult. Også røde blodlegemer er i røde og luftrom i rosa.
    6. Følg den tilskyndede serien med ja- eller nei-spørsmål for å trene hver klasse på riktig måte for et bilde. Nøyaktigheten til algoritmen vil bestemme antall ja / nei-spørsmål. For analysen ble den egendefinerte algoritmen / appen skrevet med nøyaktighet satt til 50 (område 0-100).
    7. Juster funksjoner for hver klasse ved å bruke filtre for å gjøre hver klasse skarpere, uskarpe, sortere etter form osv. Funksjoner endrer hvordan klassen ser bildet for å få frem bestemte farger eller intensiteter.
      MERK: For den egendefinerte algoritmen merkes og måles metastaser som måler 8500 μm2 og over som metastaser. Dette står for størrelsesvarians og metastaserer er for små til å oppdages. Små misshaped områder og små metastatiske områder under 8500 μm2 ble inkludert i normal vev kvantifisering.
    8. Lagre de endrede innstillingene fra enten appen eller den egendefinerte algoritmen, og bruk deretter algoritmen/appen på et helt sett eller en serie med H&E-farget vev.
    9. Til slutt eksporterer du alle utdatavariabler, som inkluderer de som er oppført i tabell 1. Arealet i mikroner kvadrert (μm2) kan kvantifiseres for hver vevstype og prosenter er avledet fra prøve total netto vevsområde (dvs. totalt vev minus luftrom).
    10. Når du oppretter en tilpasset algoritme, gjennomgå vevsmarkeringer i samråd med en veterinærpatolog som er sertifisert av American College of Veterinary Pathologists for å sikre nøyaktige målinger og skille mellom vevstyper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved bruk av umerkede celler for hale-vene injeksjon, kan det være vanskelig å bekrefte lungekolonisering før (1) tidspunktet for nekropsi hvis makrometastaser kan observeres eller (2) etter histologisk analyse hvis mikroskopiske metastaser eksisterer. Med omfattende metastatisk lungesvulstbyrde vil mus ha arbeidet med å puste. Som med enhver tumorstudie, bør mus overvåkes nøye gjennom hele studievarigheten. Bruken av merkede celler er en enkel måte å bekrefte vellykket hale-vene injeksjon; derfor bruk av luciferase-kodede MDA-MB-231 celler i demonstrasjonen. In vivo-avbildning er imidlertid ikke alltid mulig eller nødvendig, avhengig av eksperimentell design og andre faktorer. Figur 1A viser bioluminescenssignal i thoraxrommet mindre enn 2 timer etter hale-vene injeksjon av luciferase-tagget MDA-MB-231 celler som bekreftelse på nøyaktig injeksjon. For dette eksperimentet øker fotontallene i thoracic-regionen over tid, og et sterkt bioluminescenssignal er til stede på dag 24 etter injeksjon (figur 1B og C; legg merke til endringen i skalalinjen). På tidspunktet for nekropsi ble det observert mange makroskopiske lungelesjoner hos disse musene (figur 1D).

Etter riktig vevsbehandling og farging kan H&E-fargede lungeseksjoner skannes eller avbildes. Metastatisk lunge tumor byrde kvantifisering kan effektivt oppnås ved hjelp av bildeanalyse programvare og en tilpasset algoritme. Ved hjelp av den tilpassede algoritmen segmenteres hele lungevevet av forskjellige vevsfunksjoner (figur 2A og B). Ved å segmentere lungevevet på denne måten, kan programvaren kvantifisere de ulike parametrene som er oppført i tabell 1. Denne analysen har blitt utført på lungevev fra mus injisert med MDA-MB-231 celler etterfulgt av behandling med et stoff designet for å blokkere metastatisk kolonisering eller en kjøretøykontroll (DMSO). Rådataene fra denne analysen vises i tabell 2. Videre viser figur 3A representative H&E-bilder av MDA-MB-231 lungemetastaser fra enten DMSO eller legemiddelbehandlede mus. Mens en forskjell i metastatisk tumorbyrde mellom disse behandlingsgruppene lett kan ha blitt oversett da det totale antallet lungeknuter ikke er annerledes, indikerer en omfattende analyse av alle parametere en signifikant forskjell i prosentandelen netto lungemetastaseområde (figur 3B, C). Dette understreker behovet for en omfattende og grundig tilnærming for å analysere metastatisk lungesvulstbelastning som metoden beskrevet her.

For dataene som presenteres i figur 3, ble alle statistiske analyser utført ved hjelp av GraphPad Prism 7. Data ble ansett som normalt distribuert ved passering av noen av følgende standard normalitetstester: D'Agostino-Pearson omnibus, Shapiro-Wilk og Kolmogorov-Smirnov. Sammenligning mellom kjøretøy og narkotikabehandlede grupper (figur 3) ble gjort ved ubetalt to-tailed Student t-test. Statistisk signifikans ble etablert ved P ≤ 0,05.

Figure 1
Figur 1: In vivo bioluminescence bekreftelse av vellykket hale-vene injeksjon.
(A) Representativt bioluminescenssignal hos mus 1 time etter hale-vene injeksjon av luciferase-tagget MDA-MB-231 celler. (B) Representativt bioluminescenssignal i samme sett med mus som (A) 24 dager etter hale-vene injeksjon av luciferase-tagget MDA-MB-231 celler. [Legg merke til endringen i skalalinjen mellom (A) og (B)]. (C) Kvantifisering av foton teller over tid i MDA-MB-231 hale-vene injiserte mus. Feilstenger representerer gjennomsnittlig ± SEM. (n = 8 mus) (D) Representativt ikke-tumorbærende lungevev (høyre) og MDA-MB-231 makrometastaser i lungene (venstre) på tidspunktet for nekropsi. Skalastenger = 50 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Vevssegmentering ved hjelp av Visiopharm-programvare.
(A) Representative klipp av usegmenterte og segmenterte vevsmarkeringer ved hjelp av den tilpassede programvarealgoritmen. (B) Legend for alle vevskategorier segmentert ved hjelp av programvare. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Representativ metastatisk lungesvulstbyrdeanalyse av H&E-farget vev.
(A) Representativ H&E farging av lungevev fra uinjiserte mus og kontroll (DMSO) og legemiddelbehandlede mus etter hale-vene injeksjon av MDA-MB-231 celler. Representative tumormetastaser er indikert med piler. Skalastenger = 500 μm for 4x forstørrelse og 200 μm for 10x forstørrelse. (B) Graf over prosent netto lungemetastaseområde for kontroll og legemiddelbehandlede mus. Feilfelt representerer gjennomsnittlig ± SD. (*) P = 0,022 ved students t-test. (C) Tabell som oppsummerer den metastatiske lungesvulstbyrdeanalysen (n = 9 DMSO; n = 9 legemiddelbehandlet). Etter å ha sett etter normal fordeling av data, ble alle P-verdier i tabellen bestemt av uparret, tosidet Student t-test. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Parameter Beskrivelse
Totalt vevsområde (μm2) Areal i firkantede mikroner inkludert alle tumormetastaser, normal lunge og områder av røde blodlegemer.
Antall metastase Totalt antall metastaser i lungevevet.
Prosent for metastaseområde (μm2) Totalt metastaseområde delt på netto vevsområde x 100.
Totalt vev + mellomromsområde (μm2) Areal i firkantede mikroner inkludert alt vev og hvitt rom.
Nettvevsområde (μm2) Vevsområde i firkantede mikroner (mets og normal lunge) uten mellomrom og røde blodlegemer.
Totalt metastaseringsområde (μm2) Totalt metastaseringsområde i kvadratmikroner som segmentert av Decision Forest algorithim.
Gjennomsnittlig metastaseringsområde (μm2) Gjennomsnittlig (gjennomsnittlig) område i kvadratiske mikroner av metastaser i hvert bilde.
Median metastaseområde (μm2) Median metastaseområde i firkantede mikroner. Et likt antall metastaser faller under denne verdien, og et likt antall metastaser er større enn medianverdien.

Tabell 1: Parametere målt med programvare. Liste over parametere sammen med en beskrivelse av hvert mål som beregnes ved hjelp av den egendefinerte algoritmen.

Sklie Antall metastase Prosent for metastaseområde (μm2) Totalt vev + mellomromsområde (μm2) Totalt mellomrom (μm2) Nettvevsområde (μm2) Totalt metastaseringsområde (μm2) Område for røde blodlegemer (μm2) Gjennomsnittlig metastaseområde (μm2) Median metastaseområde (μm2)
171 Lungeskred 1 435 8.90 185698000 83201800 92031400 8189250 10464800 18825.86 14748.73
171 Lungeskred 2 323 8.37 185698000 83201800 92054740 7708990 10441460 23866.84 14748.73
172 Lungeskred 1 151 2.73 181546000 89509904 81571296 2225220 10464800 14736.56 12486.37
172 Lungeskred 2 142 2.60 170708000 81735504 80558196 2093040 8414300 14739.72 12119.62
173 Lungeskred 1 634 11.60 234104992 102153000 115606692 13406800 16345300 21146.37 15472.22
173 Lungeskred 2 667 12.70 223180992 86778600 122374592 15542700 14027800 23302.40 16531.00
174 Lungeskred 1 40 0.55 192452992 80340896 87591096 485121 24521000 12128.03 10484.05
174 Lungeskred 2 34 0.51 183918000 71287904 91242796 464830 21387300 13671.47 11181.81
175 Lungeskred 1 780 23.93 179544992 44799200 126995782 30388600 7750010 38959.74 19307.76
175 Lungeskred 2 1001 12.58 169191536 43425608 120610754 15169100 5155174 15153.95 19703.08
188 Lungeskred 1 569 13.20 162290000 54210000 98486310 12997300 9593690 22842.36 14463.91
188 Lungeskred 2 271 5.15 157146000 54250800 91996500 4738100 10898700 17483.76 12657.83
189 Lungeskred 1 74 1.70 185292992 95700800 77779392 1318820 11812800 17821.89 14551.08
189 Lungeskred 2 74 1.76 182272992 95700800 74759392 1318820 11812800 17821.89 14551.08
816 Lungeskred 1 246 5.65 185876000 87568896 81916204 4631050 16390900 18825.41 14371.99
816 Lungeskred 2 565 6.05 183220000 76954304 90305396 5462670 15960300 9668.44 14244.82
876 Lungeskred 1 468 10.36 208308000 99300096 100947064 10454500 8060840 22338.68 16011.37
876 Lungeskred 2 528 11.74 199750896 81642568 110450391 12963400 7657937 24551.89 16699.13
877 Lungeskred 1 732 17.98 219340992 99918600 107869992 19397100 11552400 26498.77 18137.52
877 Lungeskred 2 605 14.64 207925504 88539712 108168329 15839700 11217463 26181.32 18014.64
878 Lungeskred 1 377 10.05 178534000 85610896 81931104 8232340 10992000 21836.45 16671.03
878 Lungeskred 2 376 9.88 170544000 75337904 86108406 8511710 9097690 22637.53 16754.38
879 Lungeskred 1 205 5.22 167556000 89999000 68123630 3553860 9433370 17335.90 13845.69
879 Lungeskred 2 213 4.64 167931008 80789400 78489588 3638720 8652020 17083.19 14058.12
881 Lungeskred 1 1122 38.81 218880000 79713504 130893816 50802300 8272680 45278.34 22044.99
881 Lungeskred 2 628 21.67 184200992 74502600 99122692 21475200 10575700 34196.18 19857.40
882 Lungeskred 1 678 24.05 194476992 83941904 98484788 23684500 12050300 34932.89 20748.06
882 Lungeskred 2 645 21.93 185537040 75790040 101412430 22241700 8334570 34483.26 20325.11
883 Lungeskred 1 429 10.79 179400992 84955696 84699866 9138800 9745430 21302.56 15080.23
883 Lungeskred 2 342 85.30 175220992 76210896 90472386 77170200 8537710 225643.86 17078.26
884 Lungeskred 1 359 6.42 206751008 87752600 103825008 6669710 15173400 18578.58 14333.41
884 Lungeskred 2 480 9.12 200990000 77052496 111060804 10125700 12876700 21095.21 15679.88
885 Lungeskred 1 332 7.79 191398000 92896304 84752596 6605490 13749100 19896.05 14500.11
885 Lungeskred 2 537 81.02 187475008 85938000 89378408 72411104 12158600 134843.77 15360.29
886 Lungeskred 1 305 7.93 158435008 80433296 76541662 6068720 1460050 19897.44 14500.11
886 Lungeskred 2 898 8.84 155460000 70808600 83457470 7380490 1193930 8218.81 14744.92

Tabell 2: Representativ resultattabell. Tabell over resultater for hver parameter av algoritmen fra en kohort av mus hale-vene injisert med MDA-MB-231 celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Etter hvert som forskere fortsetter å bruke intravenøs injeksjon av tumorceller som en eksperimentell modell for metastase, mangler standard praksis for å analysere den resulterende metastatiske tumorbyrden. I noen tilfeller kan signifikante forskjeller i metastatisk tumorbyrde ved manipulering av bestemte cellelinjer og/eller bruk av kjemiske forbindelser observeres makroskopisk. Men i andre tilfeller kan subtile forskjeller i metastatisk såing og vekst overses eller feiltolkes uten grundig patologisk analyse. Denne studien fremmer tidligere publiserte hale-vene injeksjon protokoller ved å inkludere en omfattende metode for metastatisk lunge tumor byrde analyse. Viktigst, denne metoden for digital patologi analyse kan også brukes på kvantifisering av lunge metastatisk tumor byrde etter ortotopisk injeksjon av tumorceller som er i stand til spontan metastase samt andre eksperimentelle metastase modeller (dvs. intrakarakum, etc.) og pasient-avledet xenograft (PDX) modeller. Bruken av digital bildebehandling og programvarealgoritmeutvikling av veterinærpatologer sikrer reproduserbarhet, nøyaktighet og grundighet av denne tilnærmingen for å analysere metastatisk lungesvulstbyrde25.

Gjennomtenkt beslutning av cellelinjer, cellekonsentrasjon og endepunkter basert på enten tidligere publiserte studier eller nøye eksperimentell optimalisering er absolutt nødvendig. Gitt at metastatisk såing og kolonisering er svært avhengig av interaksjoner med ulike immuncellepopulasjoner26,27, er bruk av immun-kompetente mus ideell, om enn ikke alltid mulig. Av samme grunn bør tolkningen av eksperimentelle metastasestudier ved hjelp av atymiske eller NSG-mus, som mangler viktige immuncellekomponenter, tas med forsiktighet. Det er flere musepattedyr tumorcellelinjer, inkludert MVT1-cellene som brukes i denne studien, som har blitt avledet fra FVB / N-musestammen22,28,29. Det finnes også andre modeller. Når det gjelder cellekonsentrasjon, kan injeksjon av et stort antall celler i stor grad akselerere og forbedre metastatisk lungesvulstbelastning. Men hvis lungene er overveldet, kan det være vanskelig å skille mellom individuelle metastatiske foci og emboli er mer sannsynlig å oppstå. Også hale-vene injeksjon prosedyren krever rikelig praksis og trening før trygt og / eller rutinemessig utføre injeksjoner. Mange institusjoner vil tilby teknisk opplæring og kan gi mus til praksisformål. Riktig plassering av nålen og en jevn injeksjon bør indikere suksess; For opplærings-/øvingsformål kan Evans Blue-fargestoffet imidlertid brukes til å fastslå vellykket injeksjon (1 % i steril PBS). Musens ekstremiteter blir blå kort tid etter injeksjon, men dyret skal avlives etterpå.

I tillegg kan viktigheten av standard nekropsi- og vevsprøvetakingsteknikker for å kontrollere og forhindre lysbildeartefakter som kan svekke lysbildeskanning og analyse av bildeanalyseprogramvaren ikke stresses nok. Inflasjonen i lungene på tidspunktet for nekropsi er et kritisk skritt for å opprettholde vevsintegriteten og forbedrer påfølgende H&E-farging samt endelig analyse. For konsistens med oppløsning og reproduserbarhet anbefales det at alle lysbildene i et studiesett skannes med samme mål. I denne studien ble alle lysbilder skannet ved 40x for å sikre nøyaktighet av algoritmeinnstillinger og riktig identifisering av tumormetastaser når de brukes på analyserte felt. For hvert lysbilde ble de samme lungelobene konsekvent skannet og analysert for hver mus. Det anbefales også sterkt at en patolog gjennomgår vevsmarkeringer for nøyaktighet av den anvendte algoritmen, og at den samme algoritmen brukes på hvert lysbilde i en studie.

Den presenterte protokollen kan endres i henhold til eksperimentell design, brukerpreferanser og ønskede resultatmålinger. En slik modifikasjon inkluderer bruk av et anestesiinduksjonskammer i stedet for konvensjonell restrainerenhet for et bevisst dyr. Når det gjelder dyrehelse og velvære, er ingen av tilnærmingene bedre enn den andre, og hver har sitt eget sett med fordeler så vel som begrensninger30. Også for svarte eller brune mus kan det være nødvendig med en lyskilde eller varmeenhet for å visualisere haleårene. Infrarøde lamper eller et varmt vannbad kan brukes til å utvide venene. Temperaturen bør imidlertid overvåkes nøye. Videre er det opplyste selvbeherskelsesenheter tilgjengelig, så vel som andre kommersielle versjoner av gnagerbeherskelsesenheter. Noen etterforskere foretrekker Luer-Lok sprøyter til injeksjoner. Vi finner det vanskeligere å eliminere luftbobler med Luer-Lok sprøyter, men det er et spørsmål om preferanse. Levedyktigheten til celler er et viktig hensyn for hale-vene injeksjon prosedyren, og derfor, nøyaktig celle teller samt opprettholde celler på is før injeksjon er nødvendige trinn. Hvis man sammenligner lungesåing og kolonisering av manipulerte cellelinjer, er det viktig å fastslå eventuelle forskjeller i cellestørrelse og levedyktighet før injeksjon, da disse kan komplisere tolkningen av resultatene. Celledød og/eller skade kan oppstå ved bruk av en smal nål; Det anbefales imidlertid ikke at en nål større enn 25 G brukes, da det kan forårsake smerte og ubehag for dyret.

Som en måte å validere at lungelesjoner dannes av injiserte tumorceller, kan immunstaining gjøres på vevsseksjoner. Ved bruk av menneskelige cellelinjer kan menneskespesifikke antistoffer brukes til å skjelne metastatiske lesjoner. Alternativt, hvis du bruker kodede cellelinjer (f.eks. GFP), kan tilsvarende antistoffer brukes. Mange brystkreftcellelinjer er også positive for epitelmarkører (dvs. cytokeratiner, E-kaderin og EpCAM), men forkunnskaper om uttrykk er avgjørende. Imidlertid vil lungeepitelet som fôrer luftveiene også være positivt for disse markørene, og dermed må struktur også vurderes. Det kan være tilfeller der primær lungesvulstutvikling må utelukkes. For å gjøre dette kan immunhiistokjemisk farging for skjoldbrusk transkripsjonsfaktor-1 (TTF1) brukes som en markør for primær lungeadenokarsinom. TTF1 farging bør evalueres av en sertifisert patolog.

Heri ble en tilpasset algoritme skrevet ved hjelp av en beslutningsskogklassifiseringsalgoritme fordi den etablerte lungemetastasealgoritmen ikke kunne finjusteres for nøyaktig deteksjon av metastaser som varierte i størrelse. Denne tilpassede algoritmen muliggjør komplekse målinger, gir mulighet for nøyaktig segmentering av metastaser etter størrelse, og støtter en størrelseskutt slik at små feilformede områder og normale strukturer ikke feiltolkes og derfor kan inkluderes i det endelige datasettet. Vi forventer at denne algoritmen vil gjelde for de fleste in vivo lungemetastasestudier, men brukere må kanskje justere innstillingene i programvaren for å passe deres individuelle studiebehov. Denne algoritmen fungerer imidlertid som en plattform for etterforskere som ønsker å analysere lungemetastatisk byrde på en lignende måte. Det er mange forskjellige alternativer for bildeanalyseplattformer der tilgang eller tilgjengelighet, kostnader og opplæring, samt erfaringsnivå kan diktere den beste plattformen å bruke36. Utvalget av alternativer inkluderer gratis plattformer som QuPath og dyrere, men sofistikerte plattformer, for eksempel Visiopharm. Det anbefales at man konsulterer en bildeanalysepatologikjerne og patolog når man bestemmer hvilken plattform som kan være tilgjengelig og best utnyttet for et bestemt forskningsprosjekt.

Spontane mus mammary tumor modeller (f.eks, MMTV-PyMT) eller ortotoksiske mammary fett pad injeksjon metoder representerer den mest fysiologisk relevante modellen for å studere lungemetastase. En alvorlig ulempe med hale-vene injeksjon modellen er at den ikke rekapitulere hele metastatisk kaskade og er derfor begrenset til studiet av tumorcelle ekstravasasjon og sekundær organ kolonisering. Imidlertid er denne eksperimentelle metastasemodellen relevant for brystkreftforskning da lungemetastaser dannet etter hale-vene injeksjon har genomiske profiler som ligner metastatiske lesjoner som utvikler seg etter ortotopisk implantasjon av de samme cellene31. For å etablere en lungemetastasemodell injiseres et stort antall celler ofte intravenøst, noe som kanskje ikke nøyaktig representerer metastaseringsprosessen når det gjelder såing, immunreaksjon og dormancy. Også, basert på sirkulasjonsveien, er lungemetastaser mest vanlige med hale-vene injeksjon32. Med de fleste brystkreftcellelinjer indikerer publiserte rapporter en relativt lav forekomst av bein-, lever- eller hjernemetastaser etter hale-vene injeksjon7. Alternative eksperimentelle metastaseringsmetoder som intrakariac, intratibial, portal vene og intracarotid injeksjoner er mer hensiktsmessig for å undersøke metastaser til andre steder33,34,35,36,37. Igjen, spontane mammary tumor modeller eller ortotopisk fett pad injeksjon metoder som rekapitulerer alle trinnene i metastatisk kaskade foretrekkes. Problemer med konsistent metastatisk tumorbyrde, studievarighet og antall dyr som kreves for slike studier er en ulempe. Metoden for digital patologianalyse presentert her i kan imidlertid brukes på lungemetastaser dannet gjennom enhver spontan eller eksperimentell metastasemodell.

Analysemetoden gir også visse begrensninger som subjektivitet i algoritmeoppretting. Selv om hele lysbildeavbildning gir mulighet for digital analyse på en hel vevsseksjon og på alle lungelober av en enkelt mus, er den begrenset til en todimensjonal analyse av et 3D-vev. Stereologi blir en vanlig praksis som innhenter 3D-informasjon for bildeanalyse og kan redegjøre for faktorer som vevskrymping som oppstår under vevsbehandling38. Stereologi har imidlertid sine egne begrensninger som vev, ressurs og tidsbegrensninger.

Gitt antall kreftpasienter påvirket av metastatisk spredning av sykdommen, vil hale-vene injeksjonsmetoden for å studere metastase fortsette å være et nyttig verktøy når det gjelder å forstå den kompliserte biologien til metastatisk spredning og for å bestemme den prekliniske effekten av nye terapeutiske behandlinger. In vivo musemodeller av metastase, spesielt de som bruker immun-kompetente dyr, blir enda viktigere for kreftforskning gitt den utbredte interessen for immunterapi29. Også eksperimentelle metastasemodeller er kritiske når det gjelder å undersøke metastaseringsdempergener (dvs. de som undertrykker kreftcellenes metastatiske potensial uten å påvirke primær tumorvekst), og fortsetter derfor å være et verdifullt forskningsverktøy.

Digital bilde- og lysbildeanalyse har raskt blitt en bærebjelke i diagnostisk og eksperimentell musemodellering39. Ved å bruke den typen tilnærming som er beskrevet her, vil det å analysere lungemetastatisk tumorbyrde gi mulighet for analyser med høy gjennomstrømning på en mer omfattende og nøyaktig måte. Videre gir digital bildepatologi en mulighet for mer samarbeidende forskningsprosjekter som involverer patologer som spesialiserer seg på områder som musemodeller av brystkreftmetastase. Ettersom multiplex vevsavbildningsmetoder og 3D-bildeteknologier (som nevnt ovenfor) fortsetter å bli utviklet, vil digital bildepatologi, sofistikerte programmer for bildeanalyse og patologenes ekspertise sikkert være nødvendig for å fremme metastaseforskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Representative data ble finansiert gjennom National Cancer Institute (K22CA218549 til S.T.S). I tillegg til deres hjelp til å utvikle den omfattende analysemetoden som rapporteres her, takker vi Ohio State University Comprehensive Cancer Center Comparative Pathology and Mouse Phenotyping Shared Resource (Direktør - Krista La Perle, DVM, PhD) for histologi- og immunhiistokjemitjenester og Patologiavbildningskjernen for algoritmeutvikling og analyse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
alcohol prep pads Fisher Scientific 22-363-750 for cleaning tail prior to injection
dissection scissors Fisher Scientific 08-951-5 for mouse dissection and lung tissue inflation
DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate Fisher Scientific MT10013CV cell culture media base for MDA-MB-231 and MVT1 cell lines
Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x Fisher Scientific MT21030CV used for resuspending tumor cells for injection
ethanol (70 % solution) OSU used to minimize mouse's fur during dissection; use caution - flammable
Evan's blue dye Millipore Sigma E2129 used at 1 % in sterile PBS for practice with tail-vein injection method; use caution - dangerous reagent
Fetal Bovine Serum Millipore Sigma F4135 cell culture media additive; used at 10% in DMEM
forceps Fisher Scientific 10-270 for dissection and lung tissue inflation
FVB/NJ mice The Jackson Laboratory 001800 syngeneic mouse strain for MVT1 cells
hemacytometer (Bright-Line) Millipore Sigma Z359629 for use in cell culture to obtain cell counts
insulin syringe (28 G) Fisher Scientific 14-829-1B for tail-vein injections (BD 329424)
MDA-MB-231 cells ATCC human breast cancer cell line
MVT1 cells mouse mammary tumor cells
needles (26 G) Fisher Scientific 14-826-15 used to inflate the mouse's lungs
neutral buffered formalin (10%) Fisher Scientific 245685 used as a tissue fixative and to inflate lung tissue; use caution - dangerous reagent
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice The Jackson Laboratory 005557 maintained by OSUCCC Target Validation Shared Resource
Penicillin Streptomycin 100x ThermoFisher 15140163 cell culture media additive
sterile gauze Fisher Scientific NC9379092 for applying pressue to mouse's tail if bleeding occurs
syringe (5 mL) Fisher Scientific 14-955-458 used to inflate mouse lung tissue
tail-vein restrainer Braintree Scientific, Inc. TV-150 STD used to restrain mouse for tail-vein injections
Trypan blue (0.4 %) ThermoFisher 15250061 used in cell culture to assess viability
Trypsin-EDTA 0.25 % ThermoFisher 25200-114 used in cell culture to detach tumor cells from plate

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nature Reviews: Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).
  2. Steeg, P. S. Targeting metastasis. Nature Reviews: Cancer. 16 (4), 201-218 (2016).
  3. Gupta, G. P., Massague, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127 (4), 679-695 (2006).
  4. Steeg, P. S. Tumor metastasis: mechanistic insights and clinical challenges. Nature Medicine. 12 (8), 895-904 (2006).
  5. Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331 (6024), 1559-1564 (2011).
  6. Eckhardt, B. L., Francis, P. A., Parker, B. S., Anderson, R. L. Strategies for the discovery and development of therapies for metastatic breast cancer. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (6), 479-497 (2012).
  7. Gomez-Cuadrado, L., Tracey, N., Ma, R., Qian, B., Brunton, V. G. Mouse models of metastasis: progress and prospects. Disease Models & Mechanisms. 10 (9), 1061-1074 (2017).
  8. Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Research. 8 (4), 212 (2006).
  9. Schoenenberger, C. A., et al. Targeted c-myc gene expression in mammary glands of transgenic mice induces mammary tumours with constitutive milk protein gene transcription. EMBO Journal. 7 (1), 169-175 (1988).
  10. Nusse, R., Varmus, H. E. Many tumors induced by the mouse mammary tumor virus contain a provirus integrated in the same region of the host genome. Cell. 31 (1), 99-109 (1982).
  11. Muller, W. J., Sinn, E., Pattengale, P. K., Wallace, R., Leder, P. Single-step induction of mammary adenocarcinoma in transgenic mice bearing the activated c-neu oncogene. Cell. 54 (1), 105-115 (1988).
  12. Lin, E. Y., et al. Progression to malignancy in the polyoma middle T oncoprotein mouse breast cancer model provides a reliable model for human diseases. American Journal of Pathology. 163 (5), 2113-2126 (2003).
  13. Green, J. E., et al. The C3(1)/SV40 T-antigen transgenic mouse model of mammary cancer: ductal epithelial cell targeting with multistage progression to carcinoma. Oncogene. 19 (1), 1020-1027 (2000).
  14. Iorns, E., et al. A new mouse model for the study of human breast cancer metastasis. PloS One. 7 (10), 47995 (2012).
  15. Kim, I. S., Baek, S. H. Mouse models for breast cancer metastasis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 394 (3), 443-447 (2010).
  16. Mariotto, A. B., Etzioni, R., Hurlbert, M., Penberthy, L., Mayer, M. Estimation of the Number of Women Living with Metastatic Breast Cancer in the United States. Cancer Epidemiology, Biomarkers and Prevention. 26 (6), 809-815 (2017).
  17. Xiao, W., et al. Risk factors and survival outcomes in patients with breast cancer and lung metastasis: a population-based study. Cancer Medicine. 7 (3), 922-930 (2018).
  18. Smid, M., et al. Subtypes of breast cancer show preferential site of relapse. Cancer Research. 68 (9), 3108-3114 (2008).
  19. Kennecke, H., et al. Metastatic behavior of breast cancer subtypes. Journal of Clinical Oncology. 28 (20), 3271-3277 (2010).
  20. Soni, A., et al. Breast cancer subtypes predispose the site of distant metastases. American Journal of Clinical Pathology. 143 (4), 471-478 (2015).
  21. Leone, B. A., et al. Prognostic impact of metastatic pattern in stage IV breast cancer at initial diagnosis. Breast Cancer Research and Treatment. 161 (3), 537-548 (2017).
  22. Pei, X. F., et al. Explant-cell culture of primary mammary tumors from MMTV-c-Myc transgenic mice. In Vitro Cellular and Developmental Biology: Animal. 40 (1-2), 14-21 (2004).
  23. Mathsyaraja, H., et al. CSF1-ETS2-induced microRNA in myeloid cells promote metastatic tumor growth. Oncogene. 34 (28), 3651-3661 (2015).
  24. Yang, S., Zhang, J. J., Huang, X. Y. Mouse models for tumor metastasis. Methods in Molecular Biology. 928, 221-228 (2012).
  25. La Perle, K. M. D. Comparative Pathologists: Ultimate Control Freaks Seeking Validation. Veterinary Pathology. 56 (1), 19-23 (2019).
  26. Blomberg, O. S., Spagnuolo, L., de Visser, K. E. Immune regulation of metastasis: mechanistic insights and therapeutic opportunities. Disease Models & Mechanisms. 11 (10), (2018).
  27. Gonzalez, H., Hagerling, C., Werb, Z. Roles of the immune system in cancer: from tumor initiation to metastatic progression. Genes and Development. 32 (19-20), 1267-1284 (2018).
  28. Borowsky, A. D., et al. Syngeneic mouse mammary carcinoma cell lines: two closely related cell lines with divergent metastatic behavior. Clinical and Experimental Metastasis. 22 (1), 47-59 (2005).
  29. Yang, Y., et al. Immunocompetent mouse allograft models for development of therapies to target breast cancer metastasis. Oncotarget. 8 (19), 30621-30643 (2017).
  30. Resch, M., Neels, T., Tichy, A., Palme, R., Rulicke, T. Impact assessment of tail-vein injection in mice using a modified anaesthesia induction chamber versus a common restrainer without anaesthesia. Laboratory Animals. 53 (2), 190-201 (2019).
  31. Rashid, O. M., et al. Is tail vein injection a relevant breast cancer lung metastasis model. Journal of Thoracic Disease. 5 (4), 385-392 (2013).
  32. Goodale, D., Phay, C., Postenka, C. O., Keeney, M., Allan, A. L. Characterization of tumor cell dissemination patterns in preclinical models of cancer metastasis using flow cytometry and laser scanning cytometry. Cytometry Part A. 75 (4), 344-355 (2009).
  33. Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
  34. Wright, L. E., et al. Murine models of breast cancer bone metastasis. BoneKEy Reports. 5, 804 (2016).
  35. Simmons, J. K., et al. Animal Models of Bone Metastasis. Veterinary Pathology. 52 (5), 827-841 (2015).
  36. Liu, Z., et al. Improving orthotopic mouse models of patient-derived breast cancer brain metastases by a modified intracarotid injection method. Scientific Reports. 9 (1), 622 (2019).
  37. Kodack, D. P., Askoxylakis, V., Ferraro, G. B., Fukumura, D., Jain, R. K. Emerging strategies for treating brain metastases from breast cancer. Cancer Cell. 27 (2), 163-175 (2015).
  38. Brown, D. L. Practical Stereology Applications for the Pathologist. Veterinary Pathology. 54 (3), 358-368 (2017).
  39. Aeffner, F., et al. Digital Microscopy, Image Analysis, and Virtual Slide Repository. Institute for Laboratory Animal Research Journal. 59 (1), 66-79 (2018).

Tags

Kreftforskning Utgave 159 hale-vene injeksjon brystkreft lungemetastase H&E-farget seksjoner kvantitativ digital patologi bildeanalyse

Erratum

Formal Correction: Erratum: Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells
Posted by JoVE Editors on 12/02/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells. The author list was updated.

The author list was updated from:

Katie A. Thies1, Sue E. Knoblaugh2, and Steven T. Sizemore1
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center
2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University

to:

Katie A. Thies1, Sarah Steck1, Sue E. Knoblaugh2, and Steven T. Sizemore1
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center
2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University

Patologisk analyse av lungemetastase etter lateral hale-vene injeksjon av tumorceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Thies, K. A., Steck, S., Knoblaugh,… More

Thies, K. A., Steck, S., Knoblaugh, S. E., Sizemore, S. T. Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells. J. Vis. Exp. (159), e61270, doi:10.3791/61270 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter